整个基因克隆实验流程(完整)
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
基因克隆方案
基因克隆方案基因克隆是现代生物学中一项重要的技术手段，可以帮助科学家们研究和理解基因在生物体内的功能以及相互作用关系。
本文将介绍一种基因克隆的方案，包括所需材料、实验步骤以及预期结果。
材料准备：1. 原核或真核生物DNA样本2. 大肠杆菌或其他合适的宿主细胞3. 抗生素培养基4. 离心管和显微管5. 高速离心机6. 热循环仪7. DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等相关试剂实验步骤：1. DNA片段的制备a. 提取所需的DNA样本，并利用限制性内切酶进行酶切，得到所需的目标DNA片段。
b. 进行DNA片段的纯化，通过凝胶电泳确认目标DNA片段的大小，并将其收集起来。
2. 载体的制备a. 准备合适的载体，如质粒或病毒。
b. 利用限制性内切酶对载体进行酶切，以开放载体的多个切位。
c. 将目标DNA片段与载体进行连接，使用连接酶催化反应使其稳定结合。
3. DNA的转化与筛选a. 将连接好的DNA测序样本转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌。
b. 将转化后的细胞培养于含有抗生素的培养基上，以筛选带有目标DNA的克隆。
c. 通过PCR等方法检测筛选出的克隆是否携带目标基因，确认克隆是否成功。
4. 克隆的扩增与提取a. 选择带有目标基因的克隆进行扩增培养。
b. 利用高速离心机将细胞进行离心分离，提取出目标DNA。
预期结果：经过以上步骤，我们可以获得目标基因的克隆并进行扩增。
在实验结果中，我们能够观察到目标DNA片段在凝胶电泳图谱中的特定带状条带，同时，通过PCR验证可以进一步确认克隆是否成功。
此外，最终扩增的目标基因克隆可以用于后续的实验研究，如转基因生物的构建或基因功能的研究。
总结：通过以上实验方案，我们可以使用基因克隆技术获得目标基因的克隆，并获得扩增后的纯净DNA样本。
这项技术在现代生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，为科学家们研究基因的功能及其在人类健康中的意义提供了关键的工具。
然而，需要注意的是，基因克隆技术的操作需要严格遵守实验室安全规范，并经过充分的训练，以确保实验的准确性和安全性。
基因工程实验流程
基因工程实验流程1.选择目标基因：首先，确定要研究或改造的目标基因。
这个基因可以是来自任何生物的DNA序列，包括原核生物和真核生物，甚至可以是合成的DNA片段。
2.基因分离：将包含目标基因的DNA从生物体中分离出来。
这可以通过提取目标生物体的基因组DNA，然后使用特定的酶切酶将目标基因从DNA中剪切出来。
3.DNA克隆：将目标基因插入到合适的载体中，形成重组DNA分子。
常用的载体包括质粒、病毒或人工染色体。
重组DNA分子可以通过转化、感染或转染等方法导入到宿主细胞中。
4.转化宿主细胞：将重组的DNA分子导入到适当的宿主细胞中。
这可以通过热冲击、电穿孔、化学方法或用载体病毒感染的方式实现。
在这一步中，多个宿主细胞可能被转化，以增加目标基因的表达量。
5.分子鉴定：通过PCR反应、限制性酶切、DNA测序等方法，对导入宿主细胞的重组DNA分子进行鉴定和验证。
这可以确认目标基因是否被正确克隆和定位在宿主细胞的基因组中。
6.蛋白质表达：通过转录和翻译，使目标基因在宿主细胞中转录成mRNA，然后翻译成蛋白质。
这个过程可以通过合适的启动子和转录因子来调控。
7.蛋白质纯化：通过细胞裂解和各种分离技术，获得纯度较高的目标蛋白质。
这包括离心、超滤、电泳等技术，可以去除其他细胞组分和杂质。
8.蛋白质功能研究：对纯化的目标蛋白质进行功能研究，了解其生物学功能和相互作用。
这可以通过基因敲除、突变、结构分析、生物活性检测等方法进行。
9.结果分析和确认：对实验结果进行数据分析和统计，确保实验结果的可靠性和重复性。
这包括基因表达水平、蛋白质功能、相互作用准确性和可靠性的验证。
10.应用和进一步研究：根据实验结果，根据需要对目标基因进行进一步改造或利用。
这可能涉及到设计新的实验和技术，以满足具体的应用需求。
总结：基因工程实验流程是一个复杂的过程，需要多个步骤和技术的相互协作。
这个过程涉及到基因选择、分离、克隆、转化、鉴定、蛋白质表达和纯化等多个关键步骤。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
基因工程实验操作作业指导书
基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。
本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。
一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。
2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。
确保实验室电源和排风系统正常运行。
二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。
b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。
c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。
d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。
e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。
2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。
b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。
c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。
d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。
3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。
b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。
c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。
4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。
b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。
c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。
三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。
全长克隆实验步骤
HBV 全基因克隆一病毒DNA的提取1.在1.5ml螺旋盖塑料离心管加入480μl病毒DNA out溶液。
2.加入160μl血清样品，彻底振荡30s混匀后室温放置10min。
3.再振荡30s混匀，加入560μl异丙醇，振荡30s，15000g室温离心15min，带管盖柄的方向一致向外。
4.先用1ml移液枪遗弃上清，分两次吸取（注意不要触及沉淀或者让吸起的液体污染枪），留少量液体，再短暂离心1min，用100-200μl移液枪小心地弃所有残留液体，此步作用尽量去除液体中杂蛋白。
5.加入800μl 70%的乙醇，轻柔颠倒混合3次，不要摇散底部沉淀，然后15000g室温离心5min，按照4的方法分两次遗弃上清，此步作用在于去除残留异丙醇和盐分。
6.开盖8min蒸发，使DNA更易于融解于水，此时加入80μl Tris缓冲液，等待2-3min，使沉淀变得松散，用移液枪吹打管壁和管底的膜状沉淀，使其融解。
7.15000g离心1min后，-20℃保存。
二 HBV全长基因组的扩增Sense primer F1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA--3’（1821-1841）antisense primer R1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-- 3’（1825-1806）引物设计合成以HBV负链开口处序列为起始点，引物3’末端最后一个碱基硫代磷酸化修饰（抵抗Pfu的3’－5’外切酶活性），引物包含Sal I与Not I酶切位点。
PCR反应液组成，20μl体系如下：(两管共计40μl)10×LA PCR Buffer 2μl2.5mmol/L dNTP Mixture 1.6μl1/5 F1(25μmol/L) 1μl1/5 R1(25μmol/L) 1μlTaKaRa LA Taq (5U/μl) 0.4μl蒸馏水 4μlDNA模板 10μlPCR的循环参数：94℃ 5min94℃ 40s, 60℃ 1min40s, 72℃ 4min 共35个循环72℃ 7min 4℃ forever三 PCR产物的加A与回收TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
基因克隆的一般流程
平端连接图示
匹配粘端连接图示
不匹配粘端连接图示
连接反应的建立
连接反应的温度：
粘性末端，按A-T，G-C含量计算，±5℃。 如 Pst I（CTGCA↓G，12℃ ），EcoRI（G↓AATTC，8℃）。 平末端，如EcoRⅤ（GAT↓ATC），可在室温进行，不超过30℃， 酶的用量要比粘性末端加大10-100倍 。
DNA量：
摩尔数之比 载体:目的 DNA ＝ 1 : ( 1~3 ) 载体摩尔数 目标DNA摩尔数 目标基因片段碱基数×载体重量 目标基因片段重量×载体碱基数
载体和目标基因的连接反应
如未定量可以按回收效率75％计算DNA浓度，按载体与 目的基因摩尔数比1:3进行连接。
连接反应在灭菌的 0.5ml离心管中进行。 15 l 体积反
重组子筛选
下游工作
载体的选择
基因工程载体一般要求：
能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细 胞和在细胞中的复制。
易从宿主细胞中分离纯化出来， 便于重组操作。
有筛选标志，当其进入宿主细胞、或携带着外源序列进入宿主细胞都 能容易被辨认和分离出来。便于克隆操作。
NGF-sense: NGF-antisense:
6
5
pEGFP 荧光质粒表达载体
质粒DNA的酶切反应结果
质粒 M 酶切反应 M 酶切反应
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟， 使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集 管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1 分钟，9000g×1分钟。备用。
原核或真核细胞基因克隆的实验方案
原核或真核细胞基因克隆的实验方案
基因克隆是指将一个生物体的基因序列复制并导入到另一个生物体中。
下面是一个原核或真核细胞基因克隆的实验方案的概述：
原核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的质粒(vector)，如pUC19。
2. 从原核细胞中提取目标基因的DNA序列。
3. 将目标基因的DNA序列连接至质粒上的适当限制酶切位点，形成重组质粒。
4. 将重组质粒转化至宿主细菌中，如大肠杆菌。
5. 在含有适当选择性培养基的培养皿中培养转化后的细菌。
6. 通过筛选克隆检测获得目标基因被成功插入质粒的细菌。
7. 最后，提取重组质粒中的目标基因。
真核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的真核细胞载体(vector)，如pCDNA3.
2. 将目标基因的DNA序列放入真核细胞载体中，形成重组载体。
3. 将重组载体转染入真核细胞中，如哺乳动物细胞。
4. 在培养基中培养转染后的真核细胞。
5. 筛选和收集含有目标基因的克隆细胞。
6. 验证克隆细胞中目标基因的存在，如通过PCR或DNA测序等方法。
7. 最终，可通过克隆细胞培养、提取目标基因的方式获得目标基因。
在进行任何实验操作前，请确保遵守实验室的安全规范和伦理要求，并获得相应的研究伦理审批。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告一、实验目的基因克隆是分子生物学研究中的重要技术手段，本次实验旨在通过克隆特定基因，深入理解基因克隆的原理和方法，掌握相关实验操作技能，并获得目的基因的克隆产物。
二、实验原理基因克隆的基本原理是利用限制性内切酶将目的基因从基因组DNA 中切割出来，然后将其连接到合适的载体上，形成重组 DNA 分子。
再将重组 DNA 分子转化到宿主细胞中，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的克隆细胞。
三、实验材料与设备（一）材料1、含目的基因的基因组 DNA 样本。
2、限制性内切酶、DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶缓冲液。
3、载体（如质粒）。
4、感受态细胞（如大肠杆菌）。
5、琼脂糖、琼脂糖凝胶电泳缓冲液。
6、 DNA 分子量标准。
（二）设备1、恒温培养箱。
2、离心机。
3、移液器。
4、电泳仪。
5、紫外透射仪。
四、实验步骤（一）目的基因的获取使用限制性内切酶对含目的基因的基因组 DNA 进行酶切，使其产生与目的基因大小相符的片段。
（二）载体的制备选择合适的载体（如质粒），同样用限制性内切酶进行切割，使其具有与目的基因相匹配的粘性末端。
（三）连接反应将酶切后的目的基因片段与切割后的载体在 T4 DNA 连接酶及缓冲液的作用下进行连接，形成重组 DNA 分子。
（四）转化将重组 DNA 分子加入到感受态细胞中，通过热激等方法促进其进入细胞。
（五）筛选与鉴定1、抗性筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的培养基上，只有含有重组质粒的细胞才能生长。
2、菌落 PCR 鉴定：挑取单菌落进行 PCR 扩增，检测是否含有目的基因。
（六）DNA 提取与电泳检测从鉴定为阳性的菌落中提取质粒 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因的大小和纯度。
五、实验结果（一）抗性筛选结果在含有抗生素的培养基上观察到了部分菌落生长，初步判断这些菌落可能含有重组质粒。
（二）菌落 PCR 鉴定结果对挑取的菌落进行 PCR 扩增后，经琼脂糖凝胶电泳分析，部分菌落出现了与目的基因预期大小相符的条带，表明这些菌落中含有目的基因。
基因的克隆纯化实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握基因克隆的基本原理和操作方法。
2. 掌握基因纯化的实验技术。
3. 熟悉实验器材和试剂的使用。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，形成重组DNA分子，并使其在宿主细胞中复制和表达。
基因纯化是指从复杂的混合物中提取目的基因片段，并去除其他非目的物质。
本实验以人颗粒酶B基因为例，进行克隆和纯化实验。
三、实验材料1. 实验器材：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、载体、质粒提取试剂盒、琼脂糖、DNA marker、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）提取肿瘤组织中的淋巴细胞，抽提RNA。
（2）以RNA为模板，进行RT-PCR，扩增人颗粒酶B基因全长。
（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
2. 重组质粒的构建（1）将扩增产物与pGEX24T21载体进行连接。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，进行菌落培养。
（3）挑选阳性克隆，进行PCR验证。
3. 重组质粒的鉴定（1）提取重组质粒，进行限制性内切酶酶切。
（2）进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
（3）对阳性克隆进行DNA测序，验证基因序列的正确性。
4. 重组质粒的表达与纯化（1）将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，进行菌落培养。
（2）以IPTG诱导重组质粒表达。
（3）进行SDS-PAGE电泳，观察表达产物。
（4）采用Ni亲和树脂对表达产物进行纯化。
5. 纯化产物的鉴定（1）对纯化产物进行SDS-PAGE电泳，观察结果。
（2）对纯化产物进行Western blot分析，验证其特异性。
五、实验结果与分析1. RT-PCR扩增结果：成功扩增出人颗粒酶B基因全长。
2. 重组质粒构建结果：成功构建了pGEX2GrB重组质粒。
3. 重组质粒鉴定结果：限制性内切酶酶切结果与预期相符，DNA测序结果与GenBank数据库中的人颗粒酶B基因序列一致。
简述基因克隆主要过程
基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。
基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。
本文将对这些过程进行详细的介绍。
二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。
通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。
选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。
2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。
3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。
三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。
构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。
构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。
2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。
3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。
四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。
1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。
具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。
2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。
3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。
2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。
具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。
以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。
这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。
2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。
这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。
3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。
4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。
这将产生目标基因的特定片段。
5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。
6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。
需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。
在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。
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整个基因克隆实验流程(完整)-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。
当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
二、逆转录（RNA逆转录成cDNA）相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl冰盒，制冰机，PCR管）根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下：试剂使用量（μl）Rnase Free H2O11.75-YOligo（dT）1Total RNAY（<1000ng）Total Volume12.7565℃，5min后，立即置于冰上。
试剂使用量（μl）上一步变性后RNA溶液12.755×RT Buffer42dNTP Mixture（各10mM）0.25Rnase Inhibitor（10U/μl）Rever Tra Ace1Total Volume20然后放置于PCR仪上，反应程序为： 42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。
所得cDNA放置于-20℃保存。
三、PCR反应相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）试剂使用量（μl）ddH2O 6.0反转录产物 1.010×PCR Buffer 1.0dNTP（10mmol/l）0.2Taq酶（1U/μl）0.4Ghrelin-F（10μmol/l）0.4Ghrelin-R（10μmol/l）0.4MgCl2（25mmol/l）0.6Total Volume10反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
四、PCR产物的分离，回收和纯化相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。
将所得DNA贮存于-20℃。
五、目的片段与载体的连接相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。
pMD-18T载体 1μlDNA 2μlddH2O 2μl然后加入5μl Ligation Mix，4℃/16℃放置过夜连接。
六、转化相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。
（1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h；（2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h；（3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低）（4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min；（6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min；（7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清；（8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl 在冰上分装。
-80℃保存备用。
连接产物转化到感受态细胞（1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；（3）加入890μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min；（4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，均匀涂布于含Amp的LB固体培养基平板上；（5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。
（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生）七、菌液PCR检测相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。
3000rpm离心3min后吸掉上层400μl上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。
挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。
附注：主要溶液和培养基的配制1）电泳缓冲液10×TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0；2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存；3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存；4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。
使用时终浓度为100ug/ml。
5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存；7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm 滤膜除菌，-20℃保存备用；3’RACE（dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 17 3’接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’2.cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。
最后使用20μl TE洗脱沉淀。
5’RACE2.cDNA的纯化利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。
最后使用20μl TE洗脱沉淀。
行下游实验。
反应条件：降落PCR。