肝干细胞的研究状况及其在肝病方面的运用前景

肝干细胞的研究状况及其在肝病方面的运用前景摘要阐述肝干细胞的特性、起源、分化和发育的特点，以及肝干细胞在治疗肝病方面可能发挥的作用。

方法采用中外文献综述方式。

结果肝干细胞是具有双分化潜能的细胞，它可源于卵圆细胞、胎肝前体细胞、骨髓造血干细胞以及胰腺前体细胞。

肝干细胞可通过流式细胞仪分离，可在特殊的培养条件下长期培养。

肝干细胞在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面有着广阔的前景，它给众多的肝病患者带来了新的希望。

关键词：肝干细胞分化培养近年来有关干细胞的研究是国内外研究热点之一，干细胞在医学领域的应用前途也极为广阔。

肝干细胞属于前体细胞，是存在于成熟肝组织中的分化细胞，不能自我修复，不具有分化能力。

肝干细胞在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面有着巨大的潜力，对于了解肝细胞的发育及肝癌、肝硬化等疾病的发生机制都有重要帮助。

我国是“肝炎大国”，是各型发病率较高的国家，多种病毒性肝炎及相关肝病严重危害着我国人民的身体健康。

因此可以说，目前有关于肝干细胞在基础与临床方面新的科学研究进展给以上疾病患者带来了新的希望。

1、肝干细胞的特性及起源一般认为，干细胞就是那些具有无限或有限但可被延长自我修复能力的细胞，它们可形成两种或两种以上高分化的后代。

千细胞是具有多分化潜能的细胞，按其来源一般可分为成体干细胞和胎干细胞。

肝干细胞是具有双分化潜能的细胞，可向肝细胞和胆管上皮细胞分化发育。

胚胎期肝干细胞来源于肝始基，成年期肝干细胞可能来源于管细胞和骨髓造血干细胞。

1.1、成体肝干细胞成体肝细胞正常情况处于静止期，增生分裂非常缓慢。

当肝脏部分切除或药物损伤肝脏后，肝细胞开始活化增生。

如果肝严重受损或肝细胞增生受到抑制时，肝干细胞开始活化，这就是一般所说的卵圆细胞或前体细胞这些细胞具有克隆形成能力和双分化能力，可分化为肝上皮细胞和胆管上皮细胞。

通常状况下，成体肝干细胞的数量非常少，细胞的直径约10~12mm，核成卵圆形，核浆比例高。

在实验中一般都采用肝细胞大量丢失的方法，导致肝细胞生长反馈信息缺失，促使卵圆细胞的快速生长。

一般来说，卵圆细胞是先变为嗜碱性肝细胞再分化为成熟肝细胞，它的来源是由胆管周围逐渐迁入肝实质。

1.2、胚胎肝干细胞由于成体肝干细胞含量非常少，人们开始关注胚胎干细胞，大部分实验研究基于鼠的胚胎肝。

在鼠的胚肝中，卵圆细胞含量相对较高，大约2%~5%。

肝脏源于肝始基(hepatoblast)，在鼠的胚肝形成早期，大鼠胚龄9.5~15天（小鼠胚龄8.5~15天间），肝脏细胞形态均一，核浆少，此间的肝细胞大部分被认为有双向分化能力。

jaswinderpal等将从fischer344大鼠肝脏中分离出的胎肝上皮经门静脉输入二肤酶IV（DPP IV)，阴性fischer344大鼠肝脏(受体鼠肝脏2/3肝切除术，然后用“restrosine”处理）移植一个月后检测，发现DPP IV(+)细胞延长伸入肝实质内，表现为肝细胞和胆管细胞显型，形成新的肝板和胆管样结构。

现在许多类似的实验都支持这一观点。

1.3、肝干细胞的分离与培养肝干细胞的分离与培养是进行体外研究的关键，同时也为肝干细胞的临床应用奠定了基础。

目前对于肝干细胞的分离多采用荧光激活细胞筛选法(FACS) ，利用流式技术结合免疫荧光标记单克隆技术来分离，这种方法分离效率和细胞纯度较高，但需要较高特异性的细胞膜表面标志。

体外培养和体内移植实验证实，在小鼠胎肝中可分离出具有肝干细胞特征的细胞。

monga等运用微切割技术分离肝干细胞，用含有肝细胞生长因子(HGF)、flt-3因子、干细胞(SCF)因子的培养液进行干细胞培养，并可获得生长良好的肝前体细胞。

1.4、肝干细胞的起源目前多数学者认为，在胚胎发育过程中，一些原始的多能干细胞始终保持着未分化状态，滞留在机体组织内。

肝干细胞作为一种定向双能干细胞，可能是多起源的。

造血干细胞是可以分化为所有成熟血细胞系的多潜能细胞，虽然这些血细胞系来源于中胚层，最近的资料显示，这些造血干细胞可以分化为不同的内胚层系，如肝细胞。

采用流式细胞术的方法从脊髓血中纯化出的CD34(+)Lin（+）造血前体细胞可以表达变异型AFPcDNA序列。

这些变异型类型可以在造血细胞K562系出现之外，还可以在正常的骨髓、胸腺和脑中找到，但在正常的脾、肠、肝或肝肿瘤细胞系却HePG2找不到。

啮齿类动物实验资料显示，人类骨髓细胞能够分化为肝细胞和胆管细胞。

人们己经通过异性骨髓移植的方法证实卵圆细胞可以来自肝外。

2000年Alison MR等将一个男性患者的骨髓移植入女性患者体内，结果在受体肝细胞中检测到了Y染色体，不过转化细胞的数量较少，这说明骨髓移植后，受者肝细胞可能表达供者造血系的基因阎。

另外，Zuleuski H 等从胰腺分离的胰岛前体细胞在特殊的培养条件下进行体外培养也获得了肝上皮细胞阎。

现在认为肝干细胞的候选者有卵圆细胞、胎肝前提细胞、骨髓造血干细胞、胰腺前体细胞等洲。

研究显示，卵圃细胞和造血干细胞有许多共同的表面标志。

己经有实验证明，将小鼠骨髓移植入没有明显损伤的肝脏，发现一些细胞表达移植细胞的标志。

2、肝干细胞的分化和发育目前肝干细胞的发育机制还不十分清楚，经典的理论认为肝脏起源于肝始基，不久又分化为头、尾两部。

在胚胎合成的晚期，肝干细胞分化为小细胞，小细胞分化为成熟细胞。

体外培养实验证明，肝非实质细胞贴近小细胞时，小细胞增长的速度迅速减慢。

在细胞外基质的刺激下，小细胞开始成熟，胞质增多，富含线立体、粗面内质网、过氧化体、糖原等，一些细胞开始出现双核。

随后，肝板样结构形成，细胞间开始形成胆小管。

随着肝脏非实质细胞的侵入，分泌细胞外基质形成窦间隙，肝细胞逐渐成熟，肝板的厚度逐渐变薄。

成年以后，大部分死亡肝细胞被临近的肝细胞分裂增生补充。

肝脏严重受损时，包括由于药物、毒素、病毒引起的肝硬化和较大面积的肝坏死，肝干细胞开始激活并向肝细胞分化。

同时，循环血中或肝内滞留的骨髓造血干细胞补充一部分Hering管内的死亡细胞侧网。

现在普遍认为肝干细胞的分裂增生是不对称的，子代的两个细胞中，一个分化为组织细胞，参与组织损伤修复，正常肝脏干细胞不分裂增生，另一个保持干细胞的特性，在门静脉的周围存在少量处于静止期的卵圆细胞，卵圆细胞是干细胞的前体细胞。

干细胞被激活后，必须在适宜的微环境中才能分化成熟。

研究者发现，分离出的肝前体细胞在移植前必须经过retrosine处理后，才能分化为肝细胞和胆管细胞造血干细胞也只能在肝脏分化为肝细胞和胆管细胞。

肝干细胞的分化和发育是一个复杂的过程，其确切的机制还不十分清楚。

我们己经知道在体外培养的条件下，胚胎肝干细胞在没有任何生长因子的培养基中可以自主生长，地塞米松、转化生长因子是胆管上皮细胞分化形成的促进因子。

最近，人们从细胞系HUH-7分离出肝细胞瘤源性生长因子，这种来源于肝细胞瘤的细胞可以在无血清的培养基中自主生长。

此外，生长因子、白介素、整合素对于调控肝干细胞分化的不同阶段都有重要作用。

随着基因芯片技术的日益成熟，人们可以进一步确定在肝细胞的不同分化阶段中，各种细胞因子的不同含量。

3、肝干细胞在肝病方面的应用肝干细胞的研究在基础与临床方面都有广泛的应用前景。

3.1、肝干细胞在基础研究方面的应用体外培养实验间接模拟了肝细胞的成熟过程，一方面，肝干细胞的分化和发育研究有助于阐明肝脏的发生、发展、成熟的发育规律，以及一些疾病如肝纤维化的发生机制另一方面，干细胞的异常增生分裂与肿瘤的发生密切相关，研究人员Libbrecht L等在肝细胞腺瘤中，用免疫组化的方法发现了介于肝原始细胞和正常肝细胞的中间细胞。

肝原始细胞和这些类似肝细胞的中间细胞分布在整个肿瘤中，不同的部位分布密度不同。

Vessy Cj等采用富含乙基硫氨酸、无胆碱的饮食喂养一种P53缺失的小鼠，这种方法建立的模型小鼠体内卵圆细胞数量会大大提高。

将卵圆细胞注射到无胸腺的裸鼠体内，可以看到这些细胞系可以形成类似肝肿瘤的结构，采用的检测手段包括，分析Northern blotting基因表达和免疫组化检测卵圆细胞白蛋白、转铁蛋白的表达，以及卵圆细胞的标记AFP、M(2)-丙酮酸激酶和A6等，这一实验证实卵圆细胞直接参与肝肿瘤的生成团。

现在多数学者认为肝干细胞可能与结节性发育不良、肝细胞癌和胆管细胞癌的发生有关系，但由于没有直接的证据，目前存在着较大的争议。

因此研究干细胞的增生和分化规律，有助于阐明肿瘤的发生机制。

3.2、肝干细胞在药物或化学物质评估方面的应用目前新药的药理、药效及药物代谢方面的研究所用的细胞系多来源于肿瘤细胞系或其它种属，干细胞的研究进展使得我们还可选用鼠胚胎来进行药物的敏感性、光毒性和胚胎毒性实验。

具体方法包括，鼠的全胚胎培养，鼠枝芽微细胞团实验、鼠胚胎干细胞实验等。

人胚胎干细胞系的建立除了可以从细胞水平来研究人对药物的反应，还可对化学物质的毒性和效能进行评估，对农业、化肥工业等领域的发展也有重要意义。

3.3、肝干细胞在临床研究方面的应用利用胚胎干细胞（Escell）进行基因介入治疗对于遗传性肝脏代谢障碍疾病，可以通过转基因技术将缺陷基因导入干细胞，筛选出阳性细胞后移植入患者肝脏，纠正肝脏代谢紊乱。

胚胎干细胞在人工肝、肝移植方面的应用体外培养的干细胞为人工肝和肝自体移植提供了细胞来源，临床上可用于治疗肝衰竭、肝坏死等严重肝脏疾病。

目前，限制肝干细胞研究的瓶颈主要是肝干细胞的分离和鉴定方面的困难。

如何克服这些困难，深入开展干细胞的研究，为广大肝病患者提供更加切实有效的治疗手段，已经日益成为科研和医务工作者的关注热点。