庆大霉素的毒副作用及其残留检测

庆大霉素的毒副作用及其残留检测摘要：就庆大霉素(GM)的作用机理､体内代谢､毒副作用､在动物体内的残留及其检测方法等进行了详尽阐述｡关键词：庆大霉素(GM)；毒副作用；残留；检测Detection Methods of Residue of gentamicin and Its Toxicity and Side－effectAbstract：The function mechanism，internal metabolism，toxicity and side effect，residues in animal body，detection methods of residues of gentamicin were reviewed in the paper．Key words：gentamicin(GM)；toxicity and side effect；residue；detection庆大霉素(Gentamicin，GM)属于氨基糖甙类抗生素，主要作用于革兰氏阴性细菌，由于其抗菌谱广､疗效佳且价格低廉而广泛应用于兽医临床和动物饲料添加剂｡但GM的血清有效浓度与毒性浓度很相近，安全范围较小，在其应用过程中易产生毒副作用，尤其大剂量不规范使用，易导致动物性食品中GM残留超标，对人体健康构成危害，造成肾毒性和耳毒性[1]｡许多国家在动物生产中严禁使用GM或规定有严格的最高残留限量(MRL)，我国农业部235号公告规定，动物性食品中GM的MRL为100 ng·mL－1｡尽管我国对GM残留给予了高度重视，但目前尚未建立国家检测标准，GM在动物生产中的滥用现象仍十分严重｡1 gM的毒性作用机理肾毒性和耳毒性是GM的两个主要毒副作用｡目前研究表明，GM在正常生理pH值时，含有带正电荷的自由氨基基团因与肾小管上皮细胞或毛细胞表面的特异性受体结合后进入细胞内形成囊泡，后者与初级溶酶体结合形成次级溶酶体，由于溶酶体膜的通透性增加，大量的溶酶体酶释放，作用于线粒体，特异性地抑制线粒体呼吸酶的合成，细胞能量代谢障碍，细胞结构破坏｡此外，GM还可直接破坏血管纹，造成内､外淋巴循环障碍，引起药物积蓄，加重其对毛细胞的毒性作用｡在GM的两个毒性作用中，一般肾功能损害会明显早于听功能的损害，而在肾小管上皮细胞出现明显坏死之前，先有溶酶体和线粒体的损害[2－4]｡2gM的体内代谢及毒副作用2．1体内代谢GM内服难以吸收，肠内浓度较高｡肌注后吸收快而完全，约0．5～1 h血药浓度达到峰值｡吸收后主要分布于细胞外液，可渗入胸腹腔､心包､胆汁及滑膜液中，亦可进入淋巴结及肌肉组织｡有效血药浓度可维持6～8 h｡被吸收的GM约70%～80%以原形药通过肾小球滤过从尿中排出｡新生仔畜排泄显著减慢，肾功能障碍时半衰期亦明显延长｡2．2毒副作用2．2．1耳毒性前庭功能失调，表现为眩晕等，耳蜗神经损害表现为听力减退，甚至耳聋｡与强效利尿药合用可加强耳毒性｡2．2．2尿毒性主要损害肾近曲小管，可出现蛋白尿､血尿，严重可致肾衰竭，肾毒性与药物在肾中的浓度成正相关｡2．2．3神经肌肉阻滞本类药物有类似于箭毒的作用，大剂量使用可引起骨骼肌收缩､呼吸困难等｡2．2．4变态反应可引起皮疹､药热等，也可引起过敏性休克，但发生率低于青霉素｡3动物性食品中GM残留的检测方法3．1理化分析法GM在动物性食品中残留分析方法，主要以免疫学法进行筛选，以气相色谱法(GC)､高效毛细管电泳法(HPCE)､高效液相色谱法(HPLC)进行定量，以液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)进行确证｡3．1．1 gCmayhew和Gorbach等[5]于1978年建立了GC法，用电子捕获检测器测定血清中的GM，将血清样品净化提取后，用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步进行衍生化处理，之后上机检测，由于这种方法较为烦琐费时，现已很少使用｡3．1．2HPCEHPCE法是由Jorgenson[6]于1981年提出的，可分为毛细管区带电泳(CZE)､毛细管胶束电动色谱(MEKC)､毛细管凝胶电泳(CGE)､毛细管等电聚焦(CIEF)､毛细管等速电泳(CITP)和毛细管电色谱(CEC)等6种模式｡尽管毛细管电泳的模式不同，其作用原理和特点各不相同，但其有着共同的基本原理，以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的迁移速度的差异而实现分离的一类液相分离技术，不同组分的迁移速度是指电渗和淌度两个速度的矢量和｡由于各组分迁移速度不同，因而经过一定时间后各组分按其速度的大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳谱图，根据谱峰的迁移时间和峰面积或峰高即可进行定性和定量分析｡Kaale等[7]研究表明，用邻苯二甲醛和巯基乙酸衍生化，检测器为UV，检测波长为330 nm，电解质包括30 mmol·L－1硼砂，7．5 mmol·L－1 β－环糊精和12．5%(v/v)甲醇(pH=10)，此方法在美国药典和欧洲药典上已被规定｡3．1．3HPLC①电化学HPLC：由于GM中有电活性分子，Europe Pharma －copoeia 4．5版采用脉冲电化学检测器(PED)，使GM在外加电压的作用下，在检测池内产生电解反应，即在工作电极表面进行氧化还原反应，产生不同的电流，从而检测器能检测GM的各组分｡齐雪琴等[8]采用电化学检测器液相色谱测定GM组分及杂质，无需采用衍生化反应，可以直接进样，且检测灵敏度高､分离效果好｡该方法在所测定的范围内具有良好的线性(r>0．99)，重复测定及耐用性的相对标准偏差组分均小于2%，杂质均小于10%，C2a组分的最小检测浓度为2 μg·mL－1｡结果表明该方法测定GM组分及杂质是一种简便､准确的分析方法｡②反相HPLC：由于GM化合物的主要特征是缺少紫外荧光发色基团和亲水性强，因此用反相HPLC－UVD/FLD分析时，为改善其可检性和分离效果，常在柱前或柱后对GM进行衍生化，使极性降低，以改善其在色谱柱的分配特性｡最常用的衍生化试剂是邻苯二醛和1－氟－2，4二硝基苯(FDNB)｡Abdulsalam和Brian等[9]使用C18和C8分离柱，流动相一般由醋酸缓冲液和甲醇和乙氰组成｡GM 具有极性和离子特征，它们通常在反相色谱柱上不易分离，但通过在流动相中加入醋酸缓冲液，可以改善它们在C18柱上的分配性能，醋酸离子起平衡离子的作用，与GM形成离子对｡3．1．4LC/MSCherlet等[10]于2000年将内标物GM和托普霉素的色谱分离，用10 mM戊氟代丙酸和已睛作为流动相，用LS/MS方法测定出了GM的4种主要组成成分C1a､C2､C2a和C1，LC/MS方法灵敏准确，其检测限可达到0．5 ng·mL－1｡Horie[11]等于2001年用C18柱分离样品，以0．18 mL·min－1流速5 mmol·L－1七氟丁酸酐－已睛(88∶12)作为流动相，其最后在猪和牛肌肉中的GM回收率达73．2%～82．6%，检测限达到 2 ng·mL－1｡LC/MS作为一种确证方法，不需要衍生化处理，操作简便，灵敏度高，检测限低，有很强的检测和确证能力，目前作为理想的残留确证方法已进入实际应用阶段｡3．2免疫分析方法免疫分析方法(IA)是以抗原抗体特异性､敏感性､可逆性反应为基本原理，以不同的抗原抗体反应载体为技术建立起来的分析方法，包括放射免疫测定法(RIA)､酶联免疫吸附测定法(ELISA)､底物标记荧光免疫测定法(SLFIA)､固相免疫传感器法(SIS)和胶体金免疫层析法(GICA)｡3．2．1RIA其基本原理是样品中待测的GM(Ag)和放射性标记已知量的GM(Ag*)与相应已知量的GM Ab竞争反应，最终形成的Ag*Ab与Ag的含量呈负相关｡当Ag浓度高时，大部分GM Ab与之结合成抗原抗体复合物AgAb，而Ag*大多被分离，检测到的放射性强度较低；反之，当Ag浓度低时，大部分GM Ab与Ag*结合成抗原抗体复合物Ag*Ab，Ag*不被分离，检测到的放射性强度也较高｡通过GM标准品与放射性强度关系绘制标准曲线，可建立GM的RIA检测方法｡常用的标记物是同位素3H､14C､125I等｡Broughton等[12]早在1976年用125I 标记的酰化剂3－(4－羟苯基)丙酸N－羟基琥珀酰亚胺酯使GM产生了碘化的偶合，碘化GM的放射免疫测定法检出灵敏度是80 pg·mL－1｡RIA的优点在于灵敏､特异､简便，但标记物易衰变，影响了其准确性｡3．2．2ELISA其基本原理是抗原抗体的特异性､可逆性反应，ELISA 采用的是非均相竞争模式，又包括直接竞争模式和间接竞争模式｡直接竞争模式可表示为：Ag+Ag*+mAb=AgmAb+Ag*mAb+Ag+Ag*+mAb，间接竞争模式可表示为：Ag+Ag**+mAb=AgmAb+Ag*mAb+Ag+Ag*+mAb｡其中Ag 为待测游离GM，Ag*为酶标记GM，Ag**为包被抗原，mAb为GM单克隆抗体，AgmAb为游离GM与GM单克隆抗体复合物，Ag*mAb为酶标记GM与GM单克隆抗体复合物，Ag**mAb为包被抗原与GM单克隆抗体复合物｡Ag 与Ag*共同竞争mAb上的有限位点，反应达到平衡后洗脱多余的Ag与Ag*，用HRP及其底物显色系统显示AgmAb､Ag*mAb的结合情况，进而定量检测GM在样本中的含量｡Standefer 等[13]最先通过与放射免疫方法的比较，建立了用ELISA对GM的测定，但由于对ELISA法反应条件把握不准和对GM半抗原设计不够合理，其最终检测限为0．4 mg·L－1｡但ELISA 用于小分子药物残留检测目前已成为成熟技术，不仅避免了RIA存在的稳定性问题，而且更加简便､灵敏，许多ELISA试剂盒的检测限达到pg级，同时可检测多数样品，是十分理想的快速筛选手段，缺点在于出现假阳性的概率较大，易引起误判｡3．2．3SLFIA其基本原理是用4－甲基伞形酮－β－D－半乳糖苷(4－MUG)标记药物(AgMUG)与待测药物(Ag)竞争结合限量特异性抗体(Ab)，待测抗原(Ag)越多，形成AgMUG－Ab越少，剩余AgMUG越多｡由于大分子的空间位阻效应，酶对AgMUG－Ab复合物种的底物失去催化作用，加入β半乳糖苷酶(β－Gal)后，酶催化分解AgMUG上的4－MUG产生4－MU(4－甲基伞形酮)越多，激发后发出的荧光越强，即待测抗原浓度与荧光强度成正比｡即：AgMUG(定量)+Ag(待测)+Ab(限量)=AgMUG－Ab+Ag－Ab+AgMUG｡Hospes等[14]于1982年用SLFIA检测血浆中的GM含量，得到了较好的检测结果｡Place等[15]研究表明，当底物荧光标记GM的单克隆抗体时，其灵敏度为2 μg·mL－1，且具有较高的重复性｡此法由于操作烦琐，且检测限较高，目前在残留检测中已很少使用｡3．2．4SIS其基本原理是将免疫测定法与传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器，利用抗原抗体特异性吸附反应的性质，将抗原或抗体固定在传感器基体上，通过传感技术使抗原抗体反应时产生的物理､化学､电学或光学上的变化转变成可检测的信号来测定待测分子的浓度，可分为非标记型和标记型两类免疫传感器，其关键步骤是抗原､抗体的制备和抗原或抗体的固定｡Valerie等[16]用ELISA和生物传感器方法检测了牛奶中的GM 残留量，与ELISA试剂盒比较，样品预处理简单，不仅检测结果准确，还可消除假阳性结果，防止漏检｡因此，免疫传感器是一种稳定､灵敏､准确､重复性好的检测筛选方法，但目前实际应用较少｡3．2．5 gICA其基本原理是HAuCl4在还原剂作用下聚合成金颗粒，由于金颗粒之间的静电作用和布朗运动，使其保持水溶胶状态，胶体金富含电子和强大的给电子能力，在胶体溶液pH8．2条件下，以非共价键与GM单克隆抗体结合形成金标抗体(Ab－Au)，将金标抗体干燥在玻璃纤维棉上，一端与固定有GM 完全抗原(检测线)和二抗兔抗鼠IgG(质控线)的硝酸纤维素膜(NC膜)相连，另一端与样品垫相连，加入待测样品后，金标抗体重新水化并与样品相互反应，在毛细管的扩散作用下沿着吸水纸方向移动，至检测线时，若样品中不含GM，金标抗体就会与完全抗原反应而被部分截获，金颗粒富集而出现明显直观的红色条带，至质控线时，金标抗体与兔抗鼠IgG反应同样会出现红色条带；若样品中含有GM，GM已与金标抗体反应而占据了金标抗体上的有限位点，不再与完全抗原反应而越过检测线，不出现红色条带，仅在质控线与兔抗鼠IgG反应，p参考文献：[1]WALKER E M，FAZEKAS M A，BOWEN W R．Nephrotoxic and ototoxic agents[J]．Clin Lab Med，1990，10(2)：323－54．[2]YAMADA T．Studies on the mechanisms of renal damages induced by nephrotoxic compounds[J]．Nihon Hoigaku Zasshi，1995，49(6)：447－457．[3]DU X H，YANG C L．Mechanism of gentamicin nephrotoxicity in rats and the protective effect of zinc－induced metallothionein synthesis[J]．Nephrol Dial Transplant，1994，14：135－140．[4]WU W J，SHA S H，SCHACHT J．Recent advances in understanding aminoglycoside ototoxicity and its prevention[J]．Audiol Neurootol，2002，7(3)：171－174．[5]MAYHEW J W，gORBACH S L．gas－liquid chromatographic method for the assay of aminoglycoside antibiotics in serum[J]．Journal of Chromatogrphy，1978，151：133－146．[6]ORGENSON J W．Zone 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