植物病原菌分离方法

➢ 囊菌和半知菌等大多数真菌 用常规组织分离法分离
组织分离法步骤
环境的清洁和消毒 分离用具的消毒 分离材料的选择 培养基平板制备
病组织用水冲洗 分离材料表面消毒 分离材料接种
将剪成24-5块，排放均匀。
贴标签和培养
如果不熟悉1种细菌菌落的性 状，就应选择几种不同类型的 菌落，分别培养以后接种测定 其致病性，最终确定病原细 菌。
一种细菌病害一般是由一种 病原细菌引起的，琼胶平板上 出现几种不同类型的菌落，实 质上只有一种是真正的病原 细菌。
腐烂型的细菌病害即是混合
侵染的，但也有一种是主要 的。 各种植物病原细菌生长快慢 不同
从病斑边缘分不到等 ➢ 有些材料污染严重时可先接种再分
离：即将病组织接种到健康材料等 发病后分离
组织表面消毒
➢ ⑴升汞：1‰
升汞 1g HCl(浓)25ml 水 1000ml 升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也
可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl
能增强杀菌能力。 处理时间：30’S-30min不等，常3
较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。
幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真 菌，消毒时间应尽量缩短。比较 安全的方法是不用药剂消毒，而 以灭菌水换洗八九次。
培养基的准备 分离失败的原因，有时是由于培
养基不适宜。
➢ 寄生性细菌对培养基的要求要比腐 生性细菌严格。
➢ 一种适宜于纯培养的培养基不一定 适宜于分离（杂菌太多）
➢ 加抗生素，除氯霉素外，其余均灭 菌后加入
金霉素：抑制多数细菌（30ug/ml） 青霉素：抑制G+细菌，20ug/ml 多粒霉素B：抑制G-细菌（5ug/ml） 链霉素：40ug/ml 氯霉素：50ug/ml，大部分细菌
➢ 真菌有菌丝可穿透培养基，而细菌 无这种能力，先将真菌接种倒平板 上，然后再加一层Agar，菌丝透过 而在表面生长
－5min；所需时间因材料不同而异， 消毒后灭菌水3－5次
➢ 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂
不能与寄生表面直接通气影响消毒 效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒
➢ ⑵漂白粉
常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子
成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使 用。
最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙
重。 如细菌一个细胞一般重
10-12~10-13g。
过滤法
✓ 丝状真菌用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤 维膜等滤膜过滤。
✓ 过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空 干燥（40℃以下），称干重。
间接法 生理指标法
➢ 与生长量相平行的生理指标很多， 它们均可用作生长测定的相对值。
测细胞总含氮量
✓ 大多数细菌的含氮量为干重的12.5%， 酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%
三、 植物病原细菌的
分离技术
植物病原细菌一般用稀释分 离方法。
➢ 因为在病组织中病原细菌数量 巨大，分 离材料中所带的杂菌 又大多是细菌， 用稀释培养的 方法就可以使病原细菌与杂菌 分开，形成分散的菌落，从而 较容易获得植物病原细菌的纯 培养。
植物病原细菌分离常用的消 毒方法
➢ 漂白粉溶液处理3～5min，然后 用无菌水冲洗
✓ 曲霉
特殊类型真菌的分离 采用特殊的方法分离
特殊的培养基；如
集孢粘菌：（Acraciomycetes） 以E.coli为食
专性寄主的用诱饵分离
采用特殊的培养条件
温度 pH
如立枯丝核菌的分离方法
➢ 诱饵法 ➢ 离心法 ➢ 快速生长法
五、影响病原菌分离失
败的原因
从以下几个方面寻找原因
➢ 混菌法
灭菌水冲洗→大致稀释（每皿30个菌 左右）→取一定量菌液悬浮液与熔化后 45℃培养基混匀→合适温度培养→形 成菌落→移植
➢ 平板涂布法
取菌液0.1ml→涤布→静5min或无菌 风吹干→倒置培养
➢ 应用范围
细菌、酵母、产孢多真菌纯化
➢ 优点：操作简便 ➢ 缺点：不能看到和不能一个菌落是
植物病害方面，培养真菌的目
的主要是观察它的性状和研 究环境条件对它的影响，或者 是大量繁殖后用于接种或其 他试验。 培养的方法是将纯化的菌种， 根据试验的要求，移植在适当 的固体或液体培养基上培养， 后者可以静止或振荡培养。
➢ 固体培养 ➢ 液体培养
静→动
培养性状的观察
➢ 观察和记载的项目主要是：
挑取单菌落，转入斜面培养基。
平板划线分离法
➢ 制备细菌悬浮液 ➢ 划线（动画）
用灭菌移植环蘸取以上悬浮液 在表面已干的琼脂平板上画线， 先在平板的一侧顺序画3～5条 线，再将培养皿转60º，将移植 环经火焰灼烧灭菌后，从第2条
线末端用相同方法再画3～5条 线。也有其他画线形式，如四分 画线和放射状画线等，其目的都 是使细菌分开形成分散的菌落。
将培养皿翻转放置于23-25℃培养3-4 日
纯化
挑选由分离材料上长出的典型而无杂 菌的菌落，在菌落边缘用移菌针挑取带 有菌丝的培养基一小块，转入试管斜面 培养基中央，于25℃温箱中培养。
细菌的排除
➢ 将培养基调节至酸性环境，10ml培 养基中加3滴25％的乳酸
➢ 加孟加拉红，配培养基时加入 35mg/L
➢ 培养性状的描述，要注明培养基的 种类、培养温度和有无光照等。
真菌培养性状的观察，最好多用几种培 养基。
✓ 如镰刀霉属(Fusarium )和青霉属 （Penicillium）等，在各种培养基上的 培养性状在鉴定上是很重要的。
八、植物病原菌的生长
量测定
植物病原微生物特别是单细
胞微生物，体积很小，个体生 长很难测定，意义也不大。 通常测定微生物的生长是测 群体的生长，测定繁殖则都要 建立在计数基础上。
配制不同稀释度的细菌悬浮液
➢ 准备3-5个灭菌培养皿，每个皿加 200ul无菌水
➢ 用灭菌移植环从第1个培养皿中移 植1-2环细菌悬浮液到第2个培养
皿中，充分混合后再从第2个培养 皿移植 1-2环到第3个培养皿中， 依次类推，稀释的次数根据病组织 中细菌的数量而定。
置带菌平板
➢ 将熔化的琼脂培养基冷却到45℃ 左右，分别倒入培养皿中， 摇匀后 静置冷却，凝固后在培养皿盖上标 明分离材料、 日期和稀释编号等。
➢ 加玻片，加玻棒，利用气生菌丝甩 掉细菌。
病原真菌的分离举例
斑点病病原真菌分离：取5×5 mm2组织→70％消毒几秒→ 无菌水洗3次→升汞消毒3－ 5min→无菌水洗3次→接种
维管束内病原真菌分离：70％ 酒精表面消毒→切去表面→
接种 根腐病菌病原真菌分离：
由材料大小决定：大→②；小→ ①
➢ 次氯酸钠溶液处理2min，然后
用无菌水冲洗。
分离培养基
➢ 肉汁胨培养基（NA） ➢ 马铃薯葡萄糖（或蔗糖）培养
基pH调节至6.5，
稀释分离法 制备细菌悬浮液
➢ 取灭菌培养皿加无菌水适量，切取 约4mm见方的小块病组织，经过表 面消毒和无菌水冲洗3次后，移在 无菌的研钵中将病组织研碎，静置 10～15min ，使组织中的细菌进入 水中置成悬浮液。
➢ 植物病原细菌菌苔形状的差异 一般是比较小的。菌苔的表面 有光滑的、不平整的和有皱褶 的、易挑取、质地均匀 。
➢ 菌苔的颜色也不同，质地有粘 质的、膜质的或蜡质的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的， 表面有暗色的或发亮的。
➢ 菌落正反面或边缘与中央部位 颜色一致等特征。
四、植物病原真菌的分
离
病原真菌的种类繁多，其分 离的方法不同，而同一种材 料又可用不同的方法分离。 常用的分离法可以分为两大 类，即组织分离和稀释分离 法。
稀释分离法
适用于分离细菌和酵母,一般 很少用于分离真菌，但大量产 孢的病原真菌和霉菌也用
将孢子悬浮液与熔化并冷却 到45℃的培养基混匀，倒平 板，但难于掌握温度，也可平 板涂布。
组织分离法（真菌）
➢ 切取小块病健交界处的病组 织，经表面消毒和灭菌水洗过 以后，移在琼胶培养基平板上 培养，待真菌长出后挑取菌丝 进行纯化，得到植物病原真菌 的分离方法。
植物病原细菌生长量测定法 直接法
➢ 测体积
粗放的方法，将待测培养液放在刻度离 心管中作自然沉降或进行一定时间的 离心，然后观察沉降物的体积。
➢ 称干重
采用离心法或过滤法测定，一般干重为 湿重的10%~20%。
离心法（细菌）
✓ 将待测培养液离心，再用清水洗涤离心 1~5次后干燥，可用105℃、100℃或 红外线烘干，或在较低的温度（80℃ 或40℃）下进行真空干燥，然后称干
好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。
一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。
➢ 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不 会遗留在组织上影响分离结果，其杀 菌能力小于升汞。
➢ （3）酒精：70％，浸很短时
间（几秒到1min）灭菌水洗。
肉质组织中病原真菌分离：采 用②
种子内病原真菌分离：
整粒种子表面消毒，水洗后→接 种到平板
种子如在未裂开果荚中可不消 毒接种到平板
孢子分离法
配成孢子悬浮液以稀释法或划 线分离法
✓ 青霉（Pencillium） ✓ 链孢菌属（Alternaria） ✓ 小丛壳属（Glomerelia） ✓ 茎点菌属（Phoma） ✓ 拟茎点菌属（Phomopsis）
✓ 含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定 氮法。
含碳量的测定
✓ 微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或 产生一定量的物质，以表示微生物的生 长量。
➢ 贴标签
分离材料和日期等
➢ 培养及结果观察
挑取单个菌落接种于斜面培 养基上，如果不纯，再移植纯 化，最后得到纯培养。