第二章蛋白质样品的制备32

第二章 蛋白质样品的制备
2020/3/22
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一 步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
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⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为 1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋 白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因 此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（ DTT）或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果 可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时 候加入。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸 和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（ aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素 (bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价 格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱 中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶 。
求为止。
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3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
悬浮处理。
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4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
样品处理应在冰浴中进行。
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2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
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3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
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样品制备的原则
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 ➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和
蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 ➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反
复冻融已制备好的样品。 ➢ 通过超速离心清除所有的杂质。 ➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
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（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
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二、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
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Байду номын сангаас
1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L ，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低 。但
2是020/3A/22EBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨 。
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4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
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5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
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二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
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1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
胀而释放出细胞内容物。
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2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
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三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会 严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备 。另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会 失活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和 载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这 些方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述 条件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应 用蛋白酶抑制剂。
白。
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第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。