核酸的分离与纯化
核酸提取经验及原理总结
核酸提取经验及原理总结核酸提取是分子生物学研究中的一项重要技术，它可以从生物样品中分离和纯化出目标的核酸分子，为后续的实验操作提供基础。
本文将对核酸提取的经验和原理进行总结，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
核酸提取的经验总结：2.样品的预处理：在核酸提取前，需要对样品进行一些预处理，如细胞裂解、组织破碎等。
这些步骤有助于释放和保护核酸分子，促进提取效果。
3.溶解和裂解：核酸提取的第一步是将样品溶解和裂解，以释放核酸分子。
溶解缓冲液常用于裂解样品，并加入蛋白酶进行蛋白质降解。
此时需要考虑样品的特性和实验要求，选择合适的裂解缓冲液和裂解方法。
4.核酸分离：核酸分离是核酸提取的关键步骤，常用的分离方法有酚-氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
在选择分离方法时需考虑样品的类型和实验要求，以及各种方法的特点和优势。
5.纯化和浓缩：提取的核酸分子中常含有杂质，需要进行纯化和浓缩。
常用的纯化方法有酚-氯仿法、琼脂糖凝胶电泳法和商用纯化试剂盒等。
纯化后的核酸可以进行浓缩，以提高其浓度和纯度。
6.质量检测：核酸提取后，需要对提取的核酸分子进行质量检测。
常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、比色法和荧光分析等。
通过检测可以了解核酸的浓度、纯度和完整性，为后续实验提供准确的数据。
核酸提取的原理总结：1.细胞裂解和溶解：细胞裂解是将细胞壁和细胞膜破坏，使细胞内容物暴露在溶液中。
细胞溶解液中常含有裂解缓冲液和蛋白酶等物质，以促进细胞的裂解和蛋白质的降解。
2.核酸分离和纯化：核酸在细胞溶解液中可以与其他细胞成分分离，常用的方法有酚-氯仿法。
酚可溶于水，而氯仿可溶于有机溶剂，通过两相溶剂的分层，可以将核酸沉淀到有机相中，从而实现核酸的分离。
3.杂质去除和浓缩：通过纯化方法，可以将核酸与其他杂质分离。
如硅胶柱和磁珠法通过静电吸附和洗脱来除去杂质，商用纯化试剂盒则通过离心柱等固相材料来实现。
纯化后的核酸可以进行浓缩，以提高其浓度和纯度。
4.质量检测：核酸提取后，需要对提取的核酸进行质量检测。
核酸分离与纯化的原理及其方法学进展
作者单位:518000深圳市人民医院检验医学部微生物室(唐曙明、何林);524023湛江,广东医学院生化教研室(周克元)・讲座・核酸分离与纯化的原理及其方法学进展唐曙明 何林 周克元 【关键词】 核酸; 分离与纯化; 核酸提取 核酸的分离与纯化技术是生物化学与分子生物学的一项基本技术。
随着分子生物学技术广泛应用于生物学、医学及其相关等领域,核酸的分离与纯化技术也得到进一步发展。
各种新方法、经完善后的传统经典方法以及商品试剂方法的不断出现,极大地推动了分子生物学的发展。
现就核酸分离与纯化的原理及其方法学进展作一综述。
核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。
在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。
核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。
每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。
1.细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。
细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。
(1)机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。
这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。
有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从<500bp ～>20kb之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般<10kb。
(2)化学作用:在一定的p H环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。
上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X2100、Tween20、N P240、CTAB、sar2 cosyl、Chelex2100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。
而p H环境则由加入的强碱(NaO H)或缓冲液(TE、STE等)提供。
核酸的分离与纯化.
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
核酸分离与纯化的技术路线与原则
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
第六章核酸的分离与纯化
三、鉴定、保存与应用
（一）核酸的鉴定
1．浓度鉴定核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。
（1）紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，最大吸收波长在250nm～270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后，其最大吸收波长为260nm，该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下，1个OD值的光密度大约相当于50µg/ml的双链DNA，38µg/ml的单链DNA或单链RNA，33µg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度，就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数，根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐，则会使A260的读数偏高，尚需测定A310以扣除背景，并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
2．纯度鉴定紫外分光光度法还是荧光光度法，均可用于核酸的纯度鉴定。
核酸的分离与纯化讲解
• 二.质粒和噬菌体DNA的提取和纯化
• （一）质粒DNA的提取 • 基本步骤 • 1.细菌的培养 • 2.细菌的收集与裂解 • 3.质粒DNA的纯化 • 提取方法
• 煮沸法： • 碱法：最常用的质粒DNA提取方法。 • SDS法：
• （二）噬菌体DNA的提取
• 1.细菌培养 • 2.细菌的感染及裂解 • 3.噬菌体的沉淀及纯化 • 4.噬菌体DNA的提取
• 图1 玻璃砂研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
• 图2 氧化铝研磨提取总DNA的电泳结果
• 1-4孔为低pH值法，5-8孔为CTAB法，9-12孔为苯酚法 • 1,2为西洋参；3.鲜品布渣叶；4.干品布渣叶
一、概述
• 核酸分离提取的原则 • 常用方法及基本原理 • DNA的分离纯化 • RNA的分离纯化
第一节 核酸分离提取的原则
• 一、基本原则
• 1.保证核酸一级结构的完整性。 • 2.排除其它分子的污染。
• 二、注意事项
• 1.简化操作步骤，减少对核酸的破坏。 • 2.避免过酸（碱）等化学因素的影响（pH4～10）。 • 3.减少物理因素对核酸的降解。 • 4.防止核酸的生物降解。
• ③分离浮力密度不同的DNA分子或其他分子颗粒， 如图1。
图1 氯化铯梯度纯化λ噬菌体
噬菌体在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间形成一肉眼可 见的带。在1.45g/ml与1.50g/ml氯化铯界面之间可看到一个 由噬菌体颗粒形成的浅蓝色带。
• ④纯化DNA分子。在中性CsCl溶液中，DNA的 浮力密度为1.7g/ml，RNA为2.0g/ml，蛋白 质的浮力密度为1.3～1.4g/ml。在起始密度 为1.7g/ml的CsCl溶液中进行超速离心，可 以很好地将三者区分开。蛋白质浮在上层液 面，DNA分子在离心管中间形成区带，RNA沉 于管底，从而达到从DNA样品中去除微量RNA 和蛋白质的目的。
核酸的分离和纯化
琼脂糖凝胶电泳操作注意细节
1） 根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率），片段越小， 需要胶浓度越大。 2） 胶要现制先用 3） 选择合适的Marker 4） 配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种，且浓度一致（1倍） 5） 点样时要加入loading buffer，并注意，不要将样点到点样 孔之外（飘样），也不要将胶戳漏（漏样） 6） 根据片段大小及电泳检测目的，选择合适的电压及电泳时间 7）EB染色。
检测原理：
溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中， 在紫外光照射下，发射荧光。
EB: 先染与后染
核酸凝胶电泳技术
溴化乙锭染料的化学结构及 其 对 DNA 分 子 的 插 入 作 用 。 由于插入了溴化乙锭分子， 在紫外光照射下，琼脂糖凝 胶 电 泳 中 DNA 的 条 带 便 呈 现 出荧光，易于鉴定。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的 能力
凝胶类型及浓度 （bp）
分离DNA的大小范围
0.3%琼脂糖
50 000~1 000
0.7%琼脂糖
20 000~1 000
1.4%琼脂糖
6 000~300
4.0%聚丙烯酰胺
1 000~100
10.0%聚~1
琼脂糖凝胶电泳的原理
rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列， 特别是28S和18S特征性条带是电泳鉴定总 RNA纯度和完整性的重要参数。
3、 琼脂糖凝胶电泳
• 3. 1 原理： • 3. 2 用途：
琼脂糖凝胶电泳的原理
DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益
（1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构 型（超螺旋 > 线性 > 开环）； （3） 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成 反比（分子量越大，跑得越慢）；
核酸分离纯化的技术原理
核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。
核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。
核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。
在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。
一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。
因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。
核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。
有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。
苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。
蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。
含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。
异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。
其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
简述核酸分离纯化的主要步骤。
大家好，今天我们来聊聊核酸分离纯化这件事。
说到这个话题，很多人可能会觉得这就像是从泥巴里找金子，难得不得了，但其实只要掌握了步骤，简直就像是在玩一场化学版的捉迷藏。
核酸分离纯化是为了从各种样本中提取出我们的DNA或RNA，并且把它们从其他杂质中清理出来。
要做到这一点，我们得一步步来，每一步都不容马虎。
接下来，就让我带大家一起走进这个过程，看看如何让这些细小的分子从一堆混乱中脱颖而出。
2. 主要步骤详解2.1 样本准备首先，咱们得从头开始，准备好样本。
想象一下，我们要从一杯混合果汁中找出果肉，首先就得把这杯果汁倒进一个干净的容器里。
具体来说，我们通常会从细胞中提取核酸，所以需要将细胞破碎以释放出核酸。
这个过程就像是在打开一罐罐头，一切都要小心翼翼。
为了让细胞破裂，我们会用到一些化学试剂或者物理方法，比如用研磨机或者超声波处理。
就像是把一个充满秘密的小盒子打开，里面的核酸就这样被释放了出来。
2.2 核酸提取一旦细胞被破坏，释放出的核酸就是我们接下来要处理的对象。
这时候我们需要把这些核酸从其他杂质中分离出来。
这个步骤就像是在海滩上捡贝壳，我们需要把那些不起眼的沙子和海藻去掉，剩下的才是我们真正想要的。
核酸提取的方法有很多，比如利用试剂盒或者化学溶液。
常见的有酚氯仿提取法和柱纯化法。
酚氯仿法就像是用一招老派的武功，把核酸和蛋白质分开，而柱纯化法则像是用现代化的设备，让核酸在特定的柱子上游刃有余地被吸附下来。
2.3 核酸纯化好啦，提取出核酸之后，接下来就是纯化了。
纯化这一步，就像是用细网筛选掉杂质，只留下最珍贵的部分。
我们通常会使用一些化学试剂来清洗掉剩余的杂质，比如盐、酒精等。
这个过程有点像给你的衣服做干洗，把那些不干净的部分都清理干净。
纯化的目的是为了确保你得到的核酸足够干净，以便后续的实验能顺利进行。
3. 检测与保存3.1 检测最后一步，我们得检测一下核酸的质量，看看它是不是达到了要求。
核酸检测技术讲解
多重PCR（multiplex PCR）
A Typical Multiplex PCR Reaction
Sterile Water 10X PCR Buffer MgCl2 (50mM) dNTP’s (10mM each)
Primer1FWD Primer1REV Primer2FWD Primer2REV Primer3FWD Primer3REV DNA Polymerase DNA Template
荧光定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系 对起始模板进行定量分析。
与常规 PCR技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无 法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
（1）定量原理
如何对起始模板定量？
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人 发明了聚合酶链反应（PCR）
• 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由 于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力， 且易出错
• 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率 的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台 PCR自动化热循环仪
第2章 核酸检测技术
核酸检测技术
直接对动植物有害生物基因序列和结构进
行测定。
核酸的分离纯化 PCR技术 核酸杂交技术
第1节 核酸的分离纯化
核酸的分离纯化的原则
1. 保持核酸一级结构的完整性 2. 提高核酸制品的纯度
技术路线的设计
机械 （匀浆、超声破、研磨等）
破碎细胞的方法
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化引言核酸提取与纯化是生物学研究中常用的操作步骤之一。
核酸提取是指从生物样本中分离出DNA或RNA分子，纯化则是指将提取得到的核酸分子除去杂质，获得纯净的核酸样品。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项。
核酸提取原理核酸提取的基本原理是利用生物样本中DNA和RNA分子与其他组分（如蛋白质、细胞壁等）之间的化学或物理性质的差异，将核酸分子从样本中分离出来。
常见的提取方法有有机溶剂法、盐析法和离心法等。
有机溶剂法有机溶剂法是一种常用的核酸提取方法。
其原理是利用有机溶剂（如酚-氯仿混合液）与生物样本中的其他组分之间的亲和性差异，将核酸分子从样本中提取出来。
这种方法操作简单，适用于提取DNA和RNA。
具体操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞培养物或组织样本。
2.加入细胞裂解缓冲液，破坏细胞膜、核膜等结构，释放核酸分子。
3.加入酚-氯仿混合液，与细胞裂解液混合，形成两相体系。
4.离心分离两相，核酸分子会在有机相中分配到有机相中，而其他杂质会在水相中。
5.取出有机相，加入异丙醇或乙醇等沉淀剂，沉淀核酸分子。
6.离心沉淀，弃去上清液。
7.用乙醇洗涤沉淀，去除残留的盐和有机溶剂。
8.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
盐析法盐析法是利用核酸分子与盐溶液中的离子交互作用的原理进行分离。
该方法适用于高含量的核酸样本（如DNA或RNA）。
其操作步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入适量的盐溶液，使盐浓度达到一定程度。
3.离心分离沉淀，核酸分子会与高浓度盐溶液结合形成沉淀，而其他杂质会在上清液中。
4.取出沉淀，用盐溶液洗涤核酸，去除杂质。
5.干燥沉淀，加入适量的去离子水溶解核酸。
离心法离心法是一种快速分离核酸的方法。
其原理是利用离心力将核酸分子从样本中沉淀下来。
离心法适用于小样本量和快速提取的情况。
具体步骤如下：1.准备生物样本，如细胞裂解液。
2.加入高盐缓冲液，增加核酸与其他组分之间的亲和性差异。
核酸的提取及纯化
核酸的提取与纯化一 DNA的提取与纯化（一）实验目的与主要原理DNA存在于细胞核中。
通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎，暴露出DNA与蛋白质的混合物。
此时，通过蛋白酶的消化，使DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去除蛋白质，从而提取高纯度DNA。
（二）实验材料蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/l Tris(pH8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。
（三）实验方法DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。
其中酚：氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。
而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广大实验者所使用。
目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见，主要步骤如下。
1 样本前处理哺乳动物细胞：提前准备55℃冰浴。
（1）对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。
用PBS洗3次。
（2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到500ug/ml，37℃孵育4~6小时。
动物组织：提前准备55℃，70℃水浴。
（1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。
（2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h,可以过夜裂解，每小时颠倒2~3次）。
（3）如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A于样品中，室温孵育2min。
核酸与蛋白质的分离与纯化
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。 沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子 可选择有机溶剂沉淀核酸 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后可用有机溶剂（如乙醇、 异丙醇等）沉淀核酸，少量共沉淀的盐，可使用70~75%的乙醇洗涤。
质粒DNA (双链环状)
核酸分离与纯化的基本原则
1 保持核酸结构的完整性
控制缓冲液酸碱度：pH 4~10 注意机械剪切力 提取温度：0~4度 注意核酸酶
2 尽量排除其他分子的污染
蛋白质、多糖和脂质这类生物大分子杂质 对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子 其他核酸分子
1 核酸分离与纯化的基本原则及技术路线
核酸分离与纯化的技术路线
5 核酸的保存
（1）DNA的保存
TE缓冲液中-70℃保存数年 TE缓冲液的 pH与DNA 贮存有关，pH为8.0时，可减少
DNA脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。 在DNA溶液中加少量氯仿可有效防止细菌和核酸的污染
（2）RNA的保存
可溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液，-70℃保存 可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，-20 ℃保存。 以焦碳酸二乙酯水溶解可抑制RNA酶对RNA的降解。
核酸分离与纯化的技术路线
3 核酸的浓缩、沉淀与洗涤
（1）核酸的浓缩
核酸浓缩常选用有机溶剂沉淀法 ①固体聚乙二醇（PEG）浓缩 将DNA溶液装入透析袋，包埋于PEG使DNA脱水。 ②丁醇抽提浓缩 正丁醇或仲丁醇具有吸水能力，但DNA不溶于丁醇，振荡 混合后离心，去除有机相，可显著减少DNA体积。
核酸分离与纯化的技术路线
只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液
核酸的分离和纯化
RNA制备前的准备
玻璃器皿 在使用前应180℃烤至少4小时 塑料器皿 用0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）或用氯仿洗涤 电泳槽 用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥，再浸泡于
3%H2O2 液中10分钟，然后0.1%DEPC处理水彻 底冲洗。 配制的溶液应用0.1% DEPC在37℃处理12小时以上，再高 压灭菌去除 DEPC。 不能高压灭菌的溶液用
EDTA/0.1 SDS的试管收集洗脱的RNA溶液。
35
6）按步骤2重新平衡柱子，重复步骤2-4的poly(A)选 择吸附和洗脱过程。
7）调整收集的RNA溶液的乙酸钠浓度至 0.3mol/L, 加2.5倍体积乙醇，移至2个硅化的SW-55离心管 中，-20℃放置过夜 。
8）4℃离心, 30, 000g 30分钟沉淀RNA（极稀浓 度 ）。弃去乙醇，晾干沉淀，重溶于150微升无 RNA酶的TE缓冲液，合并样品。取5微升在70℃ 加热5分钟后，在1%琼脂糖凝胶电泳中检查RNA 的质量。
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方法 一、异硫氰酸胍法制备总RNA
二、TRIzol试剂提取细胞总RNA
步骤：
1） 组织标本需在预冷的碾钵中捣碎，收获1x106-5x106细
胞, 移入1.5 ml管中。
2） 加TRIzol试剂1 ml，混匀，冰浴5 mins。
3） 加氯仿0.2毫升，混匀，冰浴10 mins。
4） 4℃,10, 000g离心5 mins。
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
植物 环状 100~150 kb
动物(扁虫到人)环状 15~18 kb
锥虫 网状
第五章 核酸的分离纯化
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 （二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段
六、 DNA片段的回收
（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法
电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有 负电荷的DNA分子。 在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但 不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
第二节 真核基因组DNA的分离纯化
一、酚抽提法 二、甲酰胺解聚法 三、玻棒缠绕法 四、其它方法 五、DNA片段的纯化 六、DNA片段的回收
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
一、酚抽提法
• 该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使 用的是改进的方法
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放 （二）核酸的分离与纯化 （三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤
二、技术路线的设计
（一）核酸的释放
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因 此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释 放核酸。
表５-１ 各种组织细胞破碎方法
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
第五章 核酸的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则 第二节 基因组DNA的分离纯化 第三节 质粒DNA的提取与纯化 第四节 RNA的分离纯化
第一节 核酸分离纯化的设计及原则
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核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
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5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
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（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
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为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
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1. 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
主要包括二乙基氨基乙基（DEAE） 纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、 冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块 回收法等。
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（1）DEAE纤维素膜插片电泳法
DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以结 合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素 膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条 带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段 刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜， 低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出 DNA分子。
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一、材料的选择
临床常见的标本血液、组织及体外培 养的细胞等都可作为提取核酸的原料， 具体实验材料的选择应根据实验的目 的来确定。
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二、核酸的释放
（一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻 融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些 方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可 引起高分子量线性分子的断裂，因而不适 用于染色体DNA的分离纯化。
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一、碱裂解法
碱裂解法示意图
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2. 煮沸裂解法
是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓 冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后， 沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对， 并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但共 价闭环质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下 降后，共价闭环质粒DNA可重新恢复其超螺旋结 构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA， 然后回收上清中的质粒DNA。 适用于小质粒DNA（＜15kb）的制备。
验技术。
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选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制
4．细菌的培养与收集
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1. 碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下， 用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同 使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性， 释放出共价闭环的质粒DNA。 细胞裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色 体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐 条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清 中。通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的 乙醇洗涤，获得的DNA纯度可满足测序与PCR 等实验的要求。
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（3）CsCl-EB法
是一种沉降平衡离心法。经超速离心，离 心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过 量EB存在的条件下，各种不同密度的物质 经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度 小（1.3 g/cm3～1.4g/cm3），浮于 液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉 于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA 之间，处于中部。
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五、质粒DNA的纯化
EB—CsCl密度梯度离心法示意图
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过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构 型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难 以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的 DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不 一致，可有效分离。 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入， 结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3。 染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状 质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多， 约为1.54 g/cm3。
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（三）质粒DNA的分离纯化
质粒
质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小 环状DNA分子。
其大小范围从lkb至200kb以上不等，已经在形
形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是
独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助
性遗传单位。
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质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表 达的重要媒介物，这种基因运载工具在基 因工程中具有极广泛的应用价值，因而质 粒的分离与提取则是最常用、最基本的实
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4．异丙醇沉淀法
通过SDS和蛋白酶K消化与DNA结合的蛋 白质，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋 白质后，用2倍容积的异丙醇来沉淀含 0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉 淀是丝状，而RNA在异丙醇溶液中仍为可 溶状态，利用这一物理特性从DNA中去除 RNA，省去了加RNA酶消化RNA的步骤 。
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。
蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能
力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可
同时使用。
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酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。
PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入
水相，减少在蛋白质层滞留。
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（二）化学法
在一定的pH 环境下，加入表面活性剂或强 离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加 入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性， 保护核酸不被降解。
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（三）酶法
通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞 破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的 蛋白质，促进核酸的分离。 溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖 胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-1,4 键水解。蛋 白酶K能催化水解多种肽键，且在65℃及有 EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或 1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对 于高分子量核酸的提取有很大的优势。
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3. SDS裂解法
是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶 菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细 菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒 DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。 该法有利于大质粒DNA（＞15kb）的 提取。
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4. 小量一步提取法
直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完 成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后 离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后 从上清中回收质粒DNA。 该法简单快速、经济可行，可用于内切酶 图谱分析。
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该法操作比较简单，可同时回收多个DNA 片段，对500bp～5kb的DNA片段回收 率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。 DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回 收率下降。至10kb或为单链DNA时，其 与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此， 本法不适合于分子量大于10kb的DNA片 段的回收，也不能回收单链DNA。
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三、核酸的分离与纯化
（一）核酸分离纯化的基本方法
1. 酚抽提法
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀 后离心分离。蛋白质被分配至有机相，核 酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中 加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸 盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核 酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐 分，即可获得一定纯度的核酸。
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（二）基因组DNA的分离纯化
生物体组织细胞 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 酚抽提法 玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品 甲酰胺解聚法 粗分离 前处理
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离 精分离
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品
离子交换层析纯化
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线