核酸的分离与纯化
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30
2018/7/20
一、碱裂解法
碱裂解法示意图
2018/7/20 31
2. 煮沸裂解法
是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓 冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后， 沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对， 并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但共 价闭环质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下 降后，共价闭环质粒DNA可重新恢复其超螺旋结 构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA， 然后回收上清中的质粒DNA。 适用于小质粒DNA（＜15kb）的制备。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
2018/7/20
21
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离与纯化
Fra Baidu bibliotek
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
2018/7/20
2
核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
2018/7/20
22
2. 甲酰胺解聚法
细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相 似，但不进行酚的抽提，而是以高浓 度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合 物（即染色质），然后通过火棉胶袋 的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。
2018/7/20
23
3. 玻棒缠绕法
以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量 只有大约80kb，其长度不适用于构建 基因组DNA文库，但用于Southern 杂交和PCR反应都可以获得很好的结果。 该法简单快速，可同时提取多个样品。
37
2018/7/20
五、质粒DNA的纯化
EB—CsCl密度梯度离心法示意图
2018/7/20 38
过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构 型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难 以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的 DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不 一致，可有效分离。 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入， 结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3。 染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状 质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多， 约为1.54 g/cm3。
42
2018/7/20
1. 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
主要包括二乙基氨基乙基（DEAE） 纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、 冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块 回收法等。
2018/7/20
43
（1）DEAE纤维素膜插片电泳法
DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以结 合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素 膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条 带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段 刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜， 低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出 DNA分子。
1.酚抽提法
以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA 酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处 理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提 DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不 同需要行透析或沉淀处理，获得所需的 DNA样品。
2018/7/20
16
一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
2018/7/20 17
34
2018/7/20
5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
2018/7/20
35
（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
13
（二）基因组DNA的分离纯化
生物体组织细胞 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 酚抽提法 玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品 甲酰胺解聚法 粗分离 前处理
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离 精分离
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品
离子交换层析纯化
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
2018/7/20 36
（3）CsCl-EB法
是一种沉降平衡离心法。经超速离心，离 心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过 量EB存在的条件下，各种不同密度的物质 经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度 小（1.3 g/cm3～1.4g/cm3），浮于 液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉 于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA 之间，处于中部。
25
2018/7/20
（三）质粒DNA的分离纯化
质粒
质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小 环状DNA分子。
其大小范围从lkb至200kb以上不等，已经在形
形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是
独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助
性遗传单位。
2018/7/20
27
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表 达的重要媒介物，这种基因运载工具在基 因工程中具有极广泛的应用价值，因而质 粒的分离与提取则是最常用、最基本的实
主要试剂的作用： EDTA：
二价金属螯合剂，抑制核酸酶；
降低细胞膜的稳定性
2018/7/20
18
SDS的作用：
溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来；
对RNA、DNA酶有抑制作用；
与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。
2018/7/20
19
蛋白酶 K：
2018/7/20
24
4．异丙醇沉淀法
通过SDS和蛋白酶K消化与DNA结合的蛋 白质，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋 白质后，用2倍容积的异丙醇来沉淀含 0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉 淀是丝状，而RNA在异丙醇溶液中仍为可 溶状态，利用这一物理特性从DNA中去除 RNA，省去了加RNA酶消化RNA的步骤 。
44
2018/7/20
该法操作比较简单，可同时回收多个DNA 片段，对500bp～5kb的DNA片段回收 率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。 DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回 收率下降。至10kb或为单链DNA时，其 与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此， 本法不适合于分子量大于10kb的DNA片 段的回收，也不能回收单链DNA。
验技术。
2018/7/20
28
选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制
4．细菌的培养与收集
2018/7/20
29
1. 碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下， 用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同 使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性， 释放出共价闭环的质粒DNA。 细胞裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色 体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐 条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清 中。通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的 乙醇洗涤，获得的DNA纯度可满足测序与PCR 等实验的要求。
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。
蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能
力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可
同时使用。
2018/7/20
20
酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。
PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入
水相，减少在蛋白质层滞留。
32
2018/7/20
3. SDS裂解法
是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶 菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细 菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒 DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。 该法有利于大质粒DNA（＞15kb）的 提取。
2018/7/20
33
4. 小量一步提取法
直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完 成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后 离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后 从上清中回收质粒DNA。 该法简单快速、经济可行，可用于内切酶 图谱分析。
2018/7/20
3
一、材料的选择
临床常见的标本血液、组织及体外培 养的细胞等都可作为提取核酸的原料， 具体实验材料的选择应根据实验的目 的来确定。
2018/7/20
4
二、核酸的释放
（一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻 融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些 方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可 引起高分子量线性分子的断裂，因而不适 用于染色体DNA的分离纯化。
7
2018/7/20
三、核酸的分离与纯化
（一）核酸分离纯化的基本方法
1. 酚抽提法
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀 后离心分离。蛋白质被分配至有机相，核 酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中 加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸 盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核 酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐 分，即可获得一定纯度的核酸。
2018/7/20 10
2. 层析法
包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析 等。因分离和纯化同步进行，并且有商品 试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。 在一定的离子环境下，核酸可被选择性地 吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生 物分子分离。
2018/7/20
11
3.密度梯度离心法 双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质 具有不同的密度，因而可经密度梯度离心 的方法形成不同密度的纯样品区带，该法 适用于大量核酸样本的制备。
39
2018/7/20
2018/7/20
40
（四）DNA片段的回收
无论采用何种方法从何种支持介质中回收 DNA片段，都要注意两个原则，一是要提 高DNA片段的回收率；二是要去除回收 DNA样品中的污染。
2018/7/20
41
DNA的回收率与DNA片段的大小有一定 关系，随着分子量的增大，回收率明显下 降，大于20kb时，回收率低于20%。 DNA片段的含量与回收率也有密切关系， 量越少回收率越低，若DNA片段量小于 500ng时，几乎很难回收。因此回收 DNA片段时，要正确选择回收方法，并要 注意提高DNA上样量，减少DNA回收时 的洗脱体积以达到提高回收率的目的。
2018/7/20 5
（二）化学法
在一定的pH 环境下，加入表面活性剂或强 离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加 入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性， 保护核酸不被降解。
2018/7/20
6
（三）酶法
通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞 破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的 蛋白质，促进核酸的分离。 溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖 胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-1,4 键水解。蛋 白酶K能催化水解多种肽键，且在65℃及有 EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或 1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对 于高分子量核酸的提取有很大的优势。
2018/7/20
12
氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化 大量质粒DNA 的首选方法。 氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质， 梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后 形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而 被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透 析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核 酸。
2018/7/20
2018/7/20
一、碱裂解法
碱裂解法示意图
2018/7/20 31
2. 煮沸裂解法
是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓 冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后， 沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对， 并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但共 价闭环质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下 降后，共价闭环质粒DNA可重新恢复其超螺旋结 构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA， 然后回收上清中的质粒DNA。 适用于小质粒DNA（＜15kb）的制备。
在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以
减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保
持分相的稳定性。
2018/7/20
21
为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生 自由基，如果直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过 高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-Hcl饱和酚， 并调节至中性。使用饱和酚可以减少酚吸收更 多的DNA，降低DNA的损失率。
核酸的分离与纯化
Fra Baidu bibliotek
核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多 糖、脂肪等生物大分子分开。 在分离核酸时，应遵循两个原则：一是保 证核酸一级结构的完整性；二是尽量排除 其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。
2018/7/20
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核酸分离与纯化的过程一般都包括了材料 的选择、核酸的释放、核酸与其它生物大 分子的分离、核酸的纯化与鉴定、核酸的 浓缩、保存等几个主要步骤。 每一步骤又可由多种不同的方法单独或联 合实现。
2018/7/20
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2. 甲酰胺解聚法
细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相 似，但不进行酚的抽提，而是以高浓 度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合 物（即染色质），然后通过火棉胶袋 的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。
2018/7/20
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3. 玻棒缠绕法
以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量 只有大约80kb，其长度不适用于构建 基因组DNA文库，但用于Southern 杂交和PCR反应都可以获得很好的结果。 该法简单快速，可同时提取多个样品。
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2018/7/20
五、质粒DNA的纯化
EB—CsCl密度梯度离心法示意图
2018/7/20 38
过量EB处理前，细菌染色体DNA与不同分子构 型的质粒DNA的密度均为1.7g/cm3左右，难 以区分。经过量EB处理后，不同分子构型的 DNA与EB的结合能力不一样，因而密度下降不 一致，可有效分离。 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构，EB不易插入， 结合量少，密度下降小，约为1.59 g/cm3。 染色体DNA、开环质粒DNA以及带切口的环状 质粒DNA可以嵌入更多的EB，密度下降较多， 约为1.54 g/cm3。
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1. 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
主要包括二乙基氨基乙基（DEAE） 纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、 冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块 回收法等。
2018/7/20
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（1）DEAE纤维素膜插片电泳法
DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以结 合带负电荷的DNA分子。将DEAE纤维素 膜插入到经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸条 带前，继续电泳直至所需回收的DNA片段 刚好转移到膜上。取出DEAE纤维素膜， 低盐条件下洗去杂质，高盐条件下洗出 DNA分子。
1.酚抽提法
以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA 酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处 理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提 DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不 同需要行透析或沉淀处理，获得所需的 DNA样品。
2018/7/20
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一、酚抽提法
DNA酚抽提法示意图
2018/7/20 17
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2018/7/20
5. 质粒DNA的纯化
（1）聚乙二醇沉淀法 质粒DNA的粗制品首先用LiCl沉淀大分子 RNA，并用RNase消化小分子RNA；然 后在高盐条件下，用PEG选择性地沉淀大 的质粒DNA；沉淀的质粒DNA进一步用 酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。
2018/7/20
35
（2）柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。 树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来 纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附 的相互作用进行纯化。 以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是 在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合 来进行纯化。通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附 到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖 类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA 分子重新水合，并通过离心洗脱出来。
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（二）基因组DNA的分离纯化
生物体组织细胞 细胞裂解 蛋白质变性沉淀降解 DNA释放 酚抽提法 玻棒缠绕法 基因组 DNA粗品 甲酰胺解聚法 粗分离 前处理
AGE分离
PFGE分离 特定的DNA片段
PAGE分离 精分离
有机溶剂抽提 乙醇沉淀洗涤 基因组DNA纯品
离子交换层析纯化
哺乳动物基因组DNA分离纯化的一般技术路线
2018/7/20 36
（3）CsCl-EB法
是一种沉降平衡离心法。经超速离心，离 心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过 量EB存在的条件下，各种不同密度的物质 经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度 小（1.3 g/cm3～1.4g/cm3），浮于 液面；RNA密度大（2.0g/cm3），沉 于管底；各种DNA密度介于蛋白质与RNA 之间，处于中部。
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（三）质粒DNA的分离纯化
质粒
质粒是细菌内独立于染色体并能自我复制的小 环状DNA分子。
其大小范围从lkb至200kb以上不等，已经在形
形色色的细菌类群中发现质粒，这些质粒都是
独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助
性遗传单位。
2018/7/20
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质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表 达的重要媒介物，这种基因运载工具在基 因工程中具有极广泛的应用价值，因而质 粒的分离与提取则是最常用、最基本的实
主要试剂的作用： EDTA：
二价金属螯合剂，抑制核酸酶；
降低细胞膜的稳定性
2018/7/20
18
SDS的作用：
溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂；
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸
释放出来；
对RNA、DNA酶有抑制作用；
与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。
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蛋白酶 K：
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4．异丙醇沉淀法
通过SDS和蛋白酶K消化与DNA结合的蛋 白质，并失活DNA酶，酚氯仿抽提去除蛋 白质后，用2倍容积的异丙醇来沉淀含 0.1mol/L NaCl的DNA溶液，DNA沉 淀是丝状，而RNA在异丙醇溶液中仍为可 溶状态，利用这一物理特性从DNA中去除 RNA，省去了加RNA酶消化RNA的步骤 。
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该法操作比较简单，可同时回收多个DNA 片段，对500bp～5kb的DNA片段回收 率好，纯度高，能满足大多数实验的要求。 DNA片段大于5kb时，因结合力增大而回 收率下降。至10kb或为单链DNA时，其 与膜的结合变得很牢固而难以回收。因此， 本法不适合于分子量大于10kb的DNA片 段的回收，也不能回收单链DNA。
验技术。
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选择哪种方法制备质粒DNA，应考虑以下因素： 1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制
4．细菌的培养与收集
2018/7/20
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1. 碱裂解法
在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下， 用SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同 使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性， 释放出共价闭环的质粒DNA。 细胞裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色 体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐 条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清 中。通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的 乙醇洗涤，获得的DNA纯度可满足测序与PCR 等实验的要求。
水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质。
蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能
力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可
同时使用。
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酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性。
PH 8.0的Tris溶液可以使得抽提出的DNA进入
水相，减少在蛋白质层滞留。
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3. SDS裂解法
是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶 菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细 菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒 DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提。 该法有利于大质粒DNA（＞15kb）的 提取。
2018/7/20
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4. 小量一步提取法
直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完 成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后 离心去除大部分胞核DNA与蛋白质，最后 从上清中回收质粒DNA。 该法简单快速、经济可行，可用于内切酶 图谱分析。
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一、材料的选择
临床常见的标本血液、组织及体外培 养的细胞等都可作为提取核酸的原料， 具体实验材料的选择应根据实验的目 的来确定。
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二、核酸的释放
（一）机械法 包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻 融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些 方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可 引起高分子量线性分子的断裂，因而不适 用于染色体DNA的分离纯化。
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三、核酸的分离与纯化
（一）核酸分离纯化的基本方法
1. 酚抽提法
细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入 等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，混匀 后离心分离。蛋白质被分配至有机相，核 酸则被留于上层水相。在含核酸的水相中 加入醋酸钾或醋酸钠，形成核酸盐，核酸 盐可被一些有机溶剂沉淀，离心得到的核 酸可以用70%乙醇洗涤以除去多余的盐 分，即可获得一定纯度的核酸。
2018/7/20 10
2. 层析法
包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析 等。因分离和纯化同步进行，并且有商品 试剂盒供应而被广泛应用于核酸的纯化。 在一定的离子环境下，核酸可被选择性地 吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生 物分子分离。
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3.密度梯度离心法 双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质 具有不同的密度，因而可经密度梯度离心 的方法形成不同密度的纯样品区带，该法 适用于大量核酸样本的制备。
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（四）DNA片段的回收
无论采用何种方法从何种支持介质中回收 DNA片段，都要注意两个原则，一是要提 高DNA片段的回收率；二是要去除回收 DNA样品中的污染。
2018/7/20
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DNA的回收率与DNA片段的大小有一定 关系，随着分子量的增大，回收率明显下 降，大于20kb时，回收率低于20%。 DNA片段的含量与回收率也有密切关系， 量越少回收率越低，若DNA片段量小于 500ng时，几乎很难回收。因此回收 DNA片段时，要正确选择回收方法，并要 注意提高DNA上样量，减少DNA回收时 的洗脱体积以达到提高回收率的目的。
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（二）化学法
在一定的pH 环境下，加入表面活性剂或强 离子剂使细胞裂解，蛋白质和多糖沉淀， 核酸被从细胞内释放出来。向缓冲液中加 入一些金属离子螯合剂抑制核酸酶的活性， 保护核酸不被降解。
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（三）酶法
通过加入溶菌酶或蛋白酶（如蛋白酶K）使细胞 破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的 蛋白质，促进核酸的分离。 溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖 胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-1,4 键水解。蛋 白酶K能催化水解多种肽键，且在65℃及有 EDTA、尿素和去垢剂如0.5%SDS 或 1%Triton X-100 存在时仍保留有酶活性，对 于高分子量核酸的提取有很大的优势。
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氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化 大量质粒DNA 的首选方法。 氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质， 梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后 形成的核酸区带经紫外灯照射产生荧光而 被检测。用注射针头穿刺回收后，通过透 析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核 酸。
2018/7/20