酶工程的概念其主要研究内容和任务有哪些
酶工程考试复习重点
盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶
17. 酶干燥的主要方法？
在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥
18. 试述酶分子修饰的方法和意义。
酶固定化：借助各种物理或化学方法，将酶或细胞固定于水不溶性载体上的过程，称为酶与细胞固定化
固定化酶：固定在载体上，并在一定空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶
固定化菌体： 固定于载体上的菌体或菌体碎片， 称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式
包埋法：将酶或含酶菌体包埋于各种多孔载体中，使酶固定化的方法，称为包埋法。
酶活力：即酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。通常以测出的酶促反应速度表示
酶活力单位：在标准条件下（25 ℃ ，最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。1 IU= 1 mol / min
比活力：表示酶的纯度和活力高低，是酶纯度的一个指标。指在特定条件下，单位质量（mg）酶蛋白或RNA所含的酶活力单位数。
12 酶提取的主要方法？
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。盐溶液提取 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶.酸溶液提取 用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性好的酶碱溶液提取 用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶
一、基本概念
酶：具有生物催化功能的生物大分子。蛋白质：催化体内99%以上的反应；核酸：ribozyme，小于1%
酶工程：是生物工程的主要内容之一，是随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的交叉科学技术。
5酶工程
粉酶。
1969年，日本科学家首先在工业上应用固定化氨基 酰化酶生产出 L-氨基酸。同年，开始使用“酶工程” 这代表生产和使用酶制剂这一新兴的科技领域。
1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召 开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。 20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定 化细胞技术。 1978年，日本科学家用固定化 细胞成功地生产出α -淀粉酶。 1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵 生产 碱性磷酸酶 和 葡萄糖氧化酶 等获得成 功，为酶工程的进一步发展开辟了新的途径。
（二）发酵法
发酵法主要通过微生物发酵来获得人们所需要 的酶。
1、微生物酶发酵生产概念：
微生物酶的发酵生产：是指在人工控制的条件 下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶， 其技术包括培养基和发酵方式的选择及发酵条 件的控制管理等方面的内容。
2、生产流程：
1）优良产酶菌种的筛选
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生 产需要的菌种是发酵产酶的首要环节,优良的产酶 菌种应具备：
2、细胞固定化的主要方法
（1）包埋法 将细胞包埋在多微孔载体内 部制备固定化细胞的方法，可分为凝胶 包埋法、纤维包埋法和微胶囊包埋法。 其中凝胶包埋法是应用最广泛的细 胞固定化方法，适用于各种微生物、动 植物细胞的固定化。 优点：能较好地保持细胞内的多酶 反应系统的活力，可以像游离细胞那样 进行发酵生产。
心、过滤、浓缩、干燥这几个步骤，对某些纯
度要求很高的酶则需经几种方法乃至多次反复 处理。 难度大、成本高（占50-80%）
(1)破碎细胞
除了胞外酶的提取以外，所有
胞内酶均需将细胞壁破碎后方可进一步抽提。
酶工程的概念其主要研究内容和任务有哪些
1.酶生物合成法生产的主要工艺过程包括那几个步骤？(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水2.如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。
参数中，对发酵过程影响较大的有温度、ＰＨ、溶解氧浓度等。
(1)温度:温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。
例如：枯草杆菌的最适温度为34--37℃，黑曲霉的最适温度为28--32℃(2)pH:发酵过程中pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。
微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5，霉菌和酵母生长的最适pH4-6，放线菌生长的最适pH7-8。
(3)溶解氧浓度:对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。
好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。
简述凝胶层析、亲和层析、离子交换层析的原理和操作要点？离子交换层析原理：根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法。
操作:a上样：上样体积不十分严格。
b洗脱:增加溶液的离子强度c梯度洗脱法:改变溶液的pH d再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液或0.5mol/L HCl处理。
凝胶层析原理：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。
大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。
操作：a凝胶的选择和处理,根据相对分子质量范围选择相应型号的凝胶介质。
酶工程复习资料一
酶工程复习资料一酶工程（Enzyme Engineering）是研究和应用酶的性质、结构和功能，以及改造和设计酶的方法和技术的学科。
它是生物工程的重要分支之一，与生物技术、食品工程、医药工程等领域密切相关。
本篇文档将为读者提供关于酶工程的基本概念、酶的结构与功能、酶的改造和设计等内容的复习资料。
一、酶工程的基本概念酶是生物体内的催化剂，能够在相对较低的温度和压力下加速化学反应速率。
酶工程是指利用化学和生物学的原理和方法，对酶进行改造和优化，使其在特定条件下具有更高的催化活性和稳定性。
酶工程的研究内容主要包括酶的筛选与鉴定、酶的改造与优化、酶的应用与产业化等方面。
二、酶的结构与功能酶是由蛋白质组成的，具有特定的空间结构和功能部位。
酶的空间结构由其氨基酸序列决定，而功能部位则与其所催化的反应类型相关。
酶通过与底物结合形成酶底物复合物，从而降低反应的活化能，加速反应的进行。
酶的催化活性受到pH、温度、离子浓度等环境因素的影响，最适条件下表现出最高的催化效率。
三、酶的改造与优化为了使酶具有更好的催化性能和稳定性，科学家们通过酶的改造与优化来实现这一目标。
常用的方法包括基因工程技术、蛋白工程技术、酶体外修饰等。
基因工程技术可以通过改变酶的基因序列来改变其氨基酸组成，进而改变酶的结构和功能。
蛋白工程技术则可以通过局部改变酶的氨基酸序列来提高酶的催化活性和稳定性。
酶体外修饰则是指在酶的外部添加辅助因子或改变环境条件来改善酶的催化效果。
四、酶的应用与产业化酶在生物技术、医药、食品、农业等领域具有广泛的应用前景。
在生物技术领域，酶被广泛应用于基因工程、蛋白质表达、酶联免疫法等技术中。
在医药领域，酶被应用于药物合成、药物代谢等方面。
在食品和农业领域，酶被应用于食品加工、酿酒、饲料添加等。
酶工程与生物催化
酶工程与生物催化酶工程是一门利用生物催化技术对酶进行研究、应用和开发的科学。
生物催化是利用酶作为催化剂来促进和加速化学反应的过程。
在现代生物技术的推动下，酶工程和生物催化已经成为生物制药、食品加工、环境保护等领域中重要的研究和应用方向。
一、酶工程的基本概念与原理酶是生物催化过程中起关键作用的大分子催化剂，能够在温和的条件下加速化学反应的速率，提高反应的选择性和效率。
酶工程的基本概念是指通过改变酶的结构和性质，使其在特定条件下具有更高的催化活性和稳定性。
酶工程主要包括两个方面的内容：一是通过基因工程技术改变酶的基因序列，使其具有更好的性能；二是对酶进行物理化学性质的调控，提高酶的稳定性和催化效率。
酶工程的原理是通过对酶进行定向进化和有针对性的改造，提高酶的催化活性和选择性。
定向进化是利用自然选择的原理，在实验室中对酶进行多次重复的遗传突变和筛选过程，筛选出表现出更高活性和稳定性的突变酶。
有针对性改造是通过改变酶的结构和特性，使其适应特定反应条件，提高催化效率和产物选择性。
二、酶工程在生物制药中的应用1. 酶在药物合成中的应用酶催化合成药物的方法相对传统化学合成方法更加温和、高效和环保。
通过酶工程技术可以改变酶的催化性能，使其适应特定反应条件，提高反应产物的选择性和纯度。
同时，酶工程还可以提高酶的稳定性和催化活性，延长酶的使用寿命，降低生产成本。
2. 酶在生物催化合成药物中的应用利用酶催化合成药物可以降低合成工艺的复杂性和成本，提高产物的纯度和选择性。
在生物催化合成药物中，酶通过催化底物的转化，生成所需的目标产物。
酶工程技术可以有效提高酶的催化效率和选择性，降低反应副产物的生成，从而提高合成药物的产量和质量。
三、酶工程在食品加工中的应用1. 酶在食品加工过程中的应用酶在食品加工过程中有广泛的应用，例如面包、啤酒、乳制品、果汁等的生产中都涉及到酶的应用。
酶可以促进面团发酵、提高啤酒的醇味、改善乳质口感和提高果汁的澄清度。
酶工程的主要研究内容
酶工程的主要研究内容
酶工程是一种利用生物催化剂酶来进行工业化生产的学科。
其主要研究内容包括：
1.酶的筛选与改造：酶的筛选是指从自然界中或者人工构建的酶库中寻找具有所需反应活性和特异性的酶。
改造则是通过基因工程、突变、化学修饰等手段对酶的催化性能进行改良。
2.酶反应工艺设计：酶反应工艺设计是指将酶催化反应过程从实验室规模扩大到工业化生产的过程。
研究酶反应过程的条件优化、反应机制分析、反应器设计等方面。
3.酶催化反应过程控制：酶催化反应过程的控制包括反应物浓度、pH值、温度、反应时间等因素的控制。
为了保证反应的高效性和稳
定性，需要对反应条件进行严格控制。
4.酶催化反应的规模化生产：酶工程的最终目的是实现酶催化反应的规模化生产。
为此需要对反应过程进行优化，降低成本，提高产量和纯度。
总之，酶工程旨在利用酶催化剂进行高效、环保、低成本的工业化生产。
其研究内容涵盖酶的筛选与改造、反应工艺设计、反应过程控制和规模化生产等方面，是一门应用前景广阔的学科。
- 1 -。
酶工程 复习资料
第一章绪论1.何谓酶工程，试述其主要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂，与非酶催化剂相比，具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3.简述影响酶催化作用的主要因素。
酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。
5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法，酶柱测定法，连续测定法，固定化酶的比活力测定，酶结合效率与酶活力回收率的测定，相对酶活力的测定。
或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史：4000多年前的夏禹时代——酿酒技术。
3000多年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。
1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。
19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。
1913年——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出米氏方程。
1926年——萨姆纳得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。
1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。
1982年——切克发现核酸类酶。
1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA 部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。
酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。
相对专一性又可分为键专一性和基团专一性米氏方程：酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
-酶工程简介
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生物酶工程示意图
酶工程原理和基本过程
菌种 → 扩大培养→ 发酵→ 发酵酶液 →酶的提取 → 酶成品
原料→ 前处理→ 杀菌→ 酶反应器 ← ↓ 反应液→ 产品提取→ 产品
酶的固定化
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酶工程研究热点
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新酶或已有酶的新功能的开发 根据已有底物开发新的酶反应 利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能 利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂 利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系 体内或体外合成的多酶体系 克服底物和产物抑制 精细化工品或医药合成技术的放大 辅因子再生 生物催化剂的修饰 生物催化剂的固定化
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The Nobel Prize in Chemistry 1946
― for his discovery "for their preparation of enzymes and that enzymes virus proteins in a pure form" can be crystallized"
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The Nobel Prize in Chemistry 1907
"for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation"
Eduard Buchner Germany Landwirtschaftliche Hochschule (Agricultural College) Berlin, Germany b. 1860 d. 1917
核心目标：大规模利用生物体系（如细胞 或酶）作为催化剂实现物质是生物技术的重要组成部分
酶工程
一. 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
二. 蛋白类酶和核酸类酶的分类和命名有何异同？按照分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为蛋白类酶和核酸类酶两大类别。
它们的分类和命名总原则是相同的，都是根据酶作用的底物和催化反应的类型进行分类和命名。
两者分类与命名的显著区别是蛋白类酶只能催化其他分子进行反应，而核酸类酶既可以催化酶分子本身也可以催化其他分子进行反应。
三. 蛋白类酶的分类原则如下：1.按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为六大类：第一大类，氧化还原酶；第二大类，转移酶；第三大类，水解酶；第四大类，裂合酶；第五大类，异构酶；第六大类，合成酶；2.每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类；3.每一亚类中再分为若干小类；4.每一小类中包含若干个具体的酶。
四. 核酸类酶采用以下分类原则：1.根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶（自我剪切酶、自我剪接酶）和分子间R酶（RNA剪切酶、DNA剪切酶、多肽剪切酶、多糖剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能酶）两大类；2.在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类。
五. 酶活力单位：在特定条件下，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，单位为UI。
六. 酶活力的测定方法：1.根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制一定浓度的底物溶液；2.根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件；3.在一定条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间；4.反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量七. 酶的生物合成有生长偶联型、中期合成型、延续合成型和非生长偶联型4种模式。
酶工程制药
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
半透膜，颗粒
颗粒直径通常为几微米到
几百微米，
勇于开始，才能找到成 功的路
比网格型要小得多，有利
于底物与产物的扩散
包埋法
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
网格型、微囊型 优点： 1、酶活回收高
——不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应 2、适合于小分子底物和产物 缺点：酶也易失活
急性心梗，脑中风， 肺栓塞
肺栓塞
Laronidase，粘多糖--L艾杜糖醛酸水解酶
Imiglucerase，葡糖脑苷脂 酶
Algasidase beta，半乳糖 苷酶-
dornase alfa，DNA酶
Tenecteplase，t-PA突变体
Aldurazyme (CHO) Cerezyme (CHO) Fabrazyme (CHO) Pulmozyme (CHO) TNKase (CHO)
化学法：共价结合法
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
勇于开始，才能找到成 功的路
化学法：交联法
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
双功能/多功能试剂，酶-酶以共价键结合 （不需要载体！）
酶-反应基团 氨基（N末端）、ε-氨基、
巯基、酚基、咪唑基
天然酶
10.5 8.0 3.5 8.2
修饰酶
7.4-8.5 9.0
4.5-5.5 9.0
改变最适pH值
提高抗失活能力
提高抗失活能力
消除抗原性 延长体内半衰期
改变组织分布能力
失活因子主要是水解酶和酶抑制剂
过氧化氢酶：PEG修饰，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水 解的能力明显提高
酶工程教学大纲
《酶工程》课程教学大纲总学时数：30一、课程的地位、性质和任务酶工程（enzyme engneering）是生物技术专业的主干必修课，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的一门新的科学技术，在生物技术人才培养中处于至关重要的地位。
它涉及细胞工程、基因工程、发酵工程、生物分离工程和化学工程等诸多学科，主要内容包括酶的发酵生产、酶的分离纯化、酶和细胞固定化以及酶的分子工程。
学生通过酶工程的学习，能够掌握酶的生产与分离纯化的基本理论、基本技术以及自然酶、化学修饰酶、固定化酶的研究和应用，了解酶在各行各业中的最新发展及研究趋势。
二、课程教学的基本要求学生通过酶工程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，在一定生物反应装置中利用酶的催化性质的研究路线，掌握酶的生产与应用的基本理论、基本技术、酶的分离纯化、固定化酶以及酶的化学修饰的研究和应用，进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。
本课程理论课30学时，于本科三年级第二学期开设。
讲授方式：1．讲授2．利用CAI课件三、各章主要内容、学时分配及教学要求第一章绪论 2学时【单元目标】1．了解酶工程的研究意义；2．掌握酶工程的概念及研究内容。
【授课内容】一．酶与酶工程发展简史（一）酶学研究简史（二）酶工程研究简史二. 酶工程简介1.酶工程2.组成3.分类第二章微生物发酵产酶 4学时【单元目标】1.掌握酶生物合成的调节类型及调节机制2.了解产酶微生物的分离和选育方法3.了解动植物细胞与微生物细胞发酵产酶的异同【授课内容】第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成（一）RNA的生物合成--转录(transcription) （二）蛋白质的生物合成--翻译(translation) 1．翻译2．翻译过程即蛋白质的合成过程二、酶生物合成的调节（一）基因调控理论（二）酶合成调节的类型1.诱导 (induction)2.阻遏 (repression)（三）酶合成的调节机制三、提高酶产量的策略（一）菌种选育1.诱变育种2.基因工程育种（二）条件控制第二节酶发酵动力学一、细胞生长动力学（Monod方程）二、产酶动力学(一) 酶生物合成的模式1.生长偶联型2.部分生长偶联型3.非生长偶联型(二) 产酶动力学第三节微生物发酵产酶一、产酶微生物的分离和选育二、微生物发酵产酶方法1.固体培养2.液体培养3.固定化细胞三、微生物酶的类型1.胞外酶2.胞内酶第三章动、植物细胞培养产酶2学时一、动植物细胞与微生物细胞主要特性差异二、植物细胞培养产酶1.植物细胞培养的特点、提取法缺点2.培养基特点3.培养方法4.培养条件的影响与控制5.植物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点2.培养基3.培养方法4.培养条件的影响与控制第四章酶的提取与分离纯化 12学时【单元目标】1．掌握酶分离纯化的常用方法及其原理2．掌握几种常用的电泳方法及操作步骤2．了解酶的纯化方案的设计【授课内容】第一节酶的分离4学时一、发酵液预处理(一)发酵液的相对纯化(二)发酵液的固液分离二、细胞破碎（一）细胞壁组成（二）细胞破碎的方法（三）细胞破碎确认三、酶的提取(extraction)（一）理想提取液具备的条件、目标原则（二）提取方法四、离心分离（一）基本原理（二）离心机的种类（三）常用离心方法1．差速离心2．密度梯度离心3. 等密度梯度离心又称沉降平衡离心（四）应用五、沉淀分离（根据溶解度的不同）（一）盐析沉淀法（改变离子强度）（二）有机溶剂沉淀（降低介电常数）（三）等电点沉淀(isoelectric precipitation) （四）有机聚合物沉淀法（五）选择性变性沉淀法六、萃取（extraction）分离（一）溶剂萃取法（二）双水相萃取技术（三）超临界流体萃取（四）反胶团萃取第二节酶的精制5学时一、膜分离技术（一）扩散膜分离（二）加压膜分离（三）电场膜分离二、层析法（一）吸附层析（adsorption chromatography）1.原理2.吸附剂3.洗脱剂4.应用（二）凝胶过滤层析)(gel filtration chromatography)1.基本原理2.凝胶的种类和性质3.操作4.应用（三）离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）1. 原理2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程3. 操作4. 应用- 制备纯化生物大分子（四）疏水层析（hydrophobic interaction）1、原理2. 吸附剂3. 操作4. 应用（五）亲和层析(affinity chromatography)1. 原理2. 基质的选择3. 配体的选择4. 偶联（亲和吸附剂的制备）5. 操作及应用(六) 高效（压）液相层析（HPLC：high performance（pressure）liquid chromatography)1. 基本原理2. 分类3. 色谱仪组成第三节电泳一、电泳的基本理论1. 原理2. 电泳的分类3. 电泳常用设备二、聚丙烯酰胺凝胶电泳1.原理2.分离效应三、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 原理2. 操作四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )1. 原理2. 操作3. 应用第四节酶的浓缩、干燥与结晶2学时一、酶的浓缩(一)蒸发浓缩(二)超滤浓缩(三)吸水剂(四)反复冻融浓缩(五)沉淀法二、酶的干燥三、酶的结晶（一）结晶的条件（二）结晶的方法第五节纯化方案的设计与评价１学时一、纯化方案的设计（一）纯化方法的选择依据（二）纯化方法的排序二、纯化方案的评价（一）酶活力测定（二）蛋白质浓度测定（三）提纯倍数与回收率第五章酶分子的化学修饰 2学时【单元目标】1．掌握酶活性中心的概念及共性2．了解酶化学修饰的目的及原理3．了解酶化学修饰的种类及应用【授课内容】第一节酶的活性中心一、活性中心的概念二、活性中心的共性三、研究酶活性中心的方法1.物理学方法2.化学修饰法3.蛋白质工程第二节酶化学修饰及修饰目的一、酶化学修饰1.限制酶大规模应用的原因2.改变酶特性有两种主要的方法3.酶化学修饰的概念二、酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围第三节酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第四节酶化学修饰的设计一、充分认识酶分子的特性二、修饰剂的选择三、反应条件的选择第五节酶化学修饰的种类及应用一、酶的表面化学修饰（一）大分子修饰（大分子结合修饰）1．定义2．修饰剂3．应用（二）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）1．定义2．侧链基团修饰剂3．几种重要的修饰反应（三）交联修饰（交联法）（四）固定化修饰（共价偶联法）二、酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（三）金属离子置换修饰第六章酶与细胞的固定化 2学时【单元目标】1．掌握固定化酶和固定化细胞的定义及特点2．了解固定化酶和固定化细胞的性质及应用【授课内容】第一节酶与细胞的固定化一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点1.固定化酶 (immobilized enzyme)2.固定化细胞（immobilized cell）二、固定化方法（一）酶的固定化方法1.吸附法（adsorption）2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）3.交联法（crosslinking）4.包埋法(encapsulation)（二）各种固定化方法的优缺点比较（三）细胞的固定化方法1.固定化细胞的分类2.固定化方法（四）原生质体的固定化方法第二节固定化酶和固定化细胞的性质与表征一、固定化酶的性质二、固定化细胞的性质三、固定化酶（细胞）的评价指标第三节固定化酶与固定化细胞的应用一、在工业生产上的应用1．氨基酰化酶（Aminoacylase）2．葡萄糖异构酶二、固定化酶在医学上的应用1．消血栓2. 人工肾三、在分析检测中的应用1. 酶传感器1）酶传感器的原理2）酶传感器的应用2. 酶联免疫测定第七章酶反应器 2学时【单元目标】1．了解酶反应器的几种类型2．了解酶反应器的设计原理及操作【授课内容】第一节酶反应器的特点与类型一、酶反应器的类型（一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ）（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR)（四）膜式反应器(Membrane Reactor)（五）鼓泡塔型反应器二、酶反应器的发展第二节酶反应器的设计与选择一、酶反应器的设计1.设计目的2.设计原理（依据）二、酶反应器的选择（一）酶的应用形式（二）底物的物理性质（三）反应操作要求（四）酶的稳定性（五）应用的可塑性及成本三、酶反应器的操作第八章酶的应用 4学时【单元目标】1．了解酶在医药方面的应用2．了解酶在食品方面的应用3．了解酶在化工方面的应用4. 了解酶在环境保护方面的应用5. 了解酶在生物技术领域的应用【授课内容】第一节酶在医药方面的应用第二节酶在食品方面的应用第三节酶在化工方面的应用第四节酶在环境保护方面的应用第五节酶在生物技术领域的应用四、使用教材与主要参考书目录1教材《酶工程》（第二版）作者：郭勇科学出版社 20042 主要参考书目郭勇现代生化技术，华南理工大学出版社， 1996郭勇酶的生产与应用，化学工业出版社个，2003罗贵民酶工程，化学工业出版社，2002张树政酶制剂工业，科学出版社，1984邹国林酶学，武汉大学出版社， 1997五、考核方法和成绩构成本课程为考试考核，包括两部分：期中及平时为30%，期末70%。
酶工程——精选推荐
酶⼯程酶的定义：酶是具有⽣物催化功能的⽣物⼤分⼦，按分⼦中起催化作⽤的主要任务不同，⾃然界中天然存在的酶可以分为蛋⽩类酶和核酸类酶。
模拟酶：⼜称⼈⼯酶，酶模型，是在分⼦⽔平上模拟酶活性部分的形状、⼤⼩及微环境等特征以及酶的作⽤机理和⽴体化学等特征的⼀门科学。
⽣物印迹：⼀种通过酶与配体间的相互作⽤、诱导，从⽽改变酶的构象的⽅法。
酶：活细胞产⽣的、能在细胞内外起作⽤（催化）的⽣理活性物质。
酶⼯程：酶的⽣产性与与应⽤的技术过程。
酶⼯程的主要任务：经过预先设计，通过⼈⼯操作获得⼈们所需要的酶，并通过各种⽅法使酶的催化特性得以改进充分发挥其催化的功能。
酶的活性中⼼：酶分⼦中能同底物结合并催化反应的空间部位。
提起分离法：采⽤微⽣物细胞、植物细胞或动物细胞的⽣命活动⽽获得⼈们所需酶的技术过程同步合成型：酶的⽣物合成在细胞的⽣长阶段开始，⽽在细胞⽣长进⼊平衡期后，酶的⽣物合成也随之停⽌。
滞后合成型：酶在细胞⽣长⼀段时间或者进⼊平衡期以后才开始其⽣物合成并⼤量积累，⼜称为⾮⽣长偶联型。
固定化酶：固定在⼀定⽔不溶性载体上并在⼀定的空间范围内进⾏催化反应的酶。
固定化细胞：固定在载体上并在⼀定的空间范围内进⾏⽣命活动（⽣长、繁殖、新陈代谢）的细胞、也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。
定向进化：是模拟⾃然进化的过程、进⾏⼈⼯随机突变，并⼦啊特定的环境条件下进⾏选择，使进化朝着⼈们所以需⽅向发展的技术过程。
酶反应器：⽤于酶进⾏催化反应的容器机器附属设备。
共价调节酶：由于其他酶对其结构进⾏了共价修饰，使其能在⾮活性与活性形式之间相互转变的酶，也是调节酶的⼀种类型。
分⼦印迹：合成对其某种特异选择性结合的⾼分⼦聚合物技术。
酶原的激活：酶原在⼀定条件下经过适当的切割肽键，可以转变为有活性的酶。
酶活⼒：⼜称为酶活性，是指酶催化某⼀化学反应的能⼒，可在⼀定条件下，酶催化某⼀化学反应的反应速率表⽰。
酶反应动⼒学;是研究反应速度及各种因素对酶反应速度影响的学科。
酶工程
二、酶工程简介由酶学与化学工程、基因工程、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。
它从应用目的出发，研究酶的产生、酶的制备与改造、酶反应器以及酶的各方面应用。
（酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程）分为：化学酶工程与生物酶工程。
1.化学酶工程（初级酶工程）酶化学与化学工程技术相结合的产物。
主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
2. 生物酶工程（高级酶工程）在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
生物酶工程主要研究内容（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）（2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）（3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。
利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。
固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅助因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。
用微生物和动植物组织研究生物传感器。
非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。
一、酶的分类（一）根据酶的化学组成可将酶分为：1.单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分2.结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为单体酶：以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
寡聚酶：以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。
多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的一系列相关反应。
国际酶学委员会（EC）规定，每个酶都有唯一的特定标码，其书写方式是：EC 数字.数字.数字.数字乙醇脱氢酶的编码是： EC1.1.1.1第一个“1”——第1大类，即氧化还原酶类；第二个“1”——第1亚类，供氢体为CHOH；第三个“1”——第1亚亚类，受氢体为NAD+；第四个“1”——在亚亚类中的顺序号。
酶工程课程教学大纲
《酶学》课程教学大纲课程名称：酶学课程类型: 必修课总学时： 45 讲课学时： 45 学分：2.5适用对象: 生物技术专业先修课程：有机化学，生物化学一、课程性质、目的和任务酶学是研究酶生物催化剂的一门理论性科学，是生物化学的分支学科。
其主要阐述酶分子的组成、结构、性质、功能、生物合成及其调节等方面的基本理论与基本知识。
它在研究酶的性质、作用机制的基础上着重探讨酶的催化功能问题，旨在对酶的动力学特性进行详细的分析。
酶作为一种主要的工业催化剂，势必对工业生产的发展模式、发展形态产生深远的影响，酶学是酶工程的理论基础，指导酶工程研究内容向分子水平的拓展，也势必对基因工程等生命前沿学科的发展产生不可估量的影响。
二、教学基本要求通过本课程的教学，要使学生系统地掌握酶的组成、结构、性质、功能、生物合成及调节等方面基本理论与知识，特别是酶的结构与功能关系，酶的催化机制，酶催化动力学等。
四、课程的重点和难点第一章绪论重点：①酶的催化作用特点；②酶活力测定；③酶的分离纯化难点：①层析分离；②电泳分离；③萃取分离。
第二章酶的结构与功能重点：①酶的空间结构；②酶的活性中心特征与鉴定；③酶的结构与功能关系；难点：①酶活性中心基团检测；②酶分子修饰方法学及影响。
第三章酶的催化机制重点：①酶催化机制的基本内容（趋向与定向效应,构象变化效应；酸碱催化效应；共价催化机制；微环境效应）；②酶作用机制研究方法难点：①酸碱催化机制；②共价催化机制；③微环境的形成原理及对酶催化过程的影响例子。
第四章酶催化反应动力学重点：①单多底物反应动力学；②抑制作用动力学（可逆抑制作用的类型及特征）；③多底物反应动力学推导及参数求解；④别构酶反应动力学模型；难点：①米氏方程的讨论与参数求取；②抑制反应动力学推导及类型判断，抑制动力学参数Ki的二次作图法求解；③多底物反应动力学推导（Alberty方程与Daziel方程参数的作图法求解）；④别构酶的动力学模型特征（MWC模型与KNF模型及饱和分数推导）。
酶工程概念问题回答
酶工程概念
酶工程是一门综合性的学科，它涉及到生物学、化学、工程学等多个
领域。
酶工程的主要目的是利用酶的特殊性质，通过改变酶的结构和
功能，来实现对生物过程的控制和优化。
酶工程的应用范围非常广泛，包括食品、医药、化工、环保等多个领域。
酶是一种生物催化剂，它可以加速化学反应的速率，同时不参与反应
本身。
酶的特殊性质使得它在生物过程中起着至关重要的作用。
酶工
程的主要任务是利用现代生物技术手段，对酶进行改造和优化，以满
足不同领域的需求。
酶工程的主要内容包括酶的筛选、酶的改造、酶的表达和纯化等方面。
其中，酶的筛选是酶工程的第一步，它是通过对大量的酶进行筛选，
找到具有特殊性质的酶。
酶的改造是酶工程的核心内容，它是通过对
酶的基因进行改造，来改变酶的结构和功能。
酶的表达和纯化是酶工
程的最后一步，它是将改造后的酶大规模生产，并纯化出高纯度的酶。
酶工程的应用非常广泛，其中最为重要的应用领域之一是食品工业。
酶可以用于食品加工中，如面包、啤酒、奶酪等的生产过程中。
酶还
可以用于医药领域，如制药、诊断等方面。
此外，酶还可以用于化工、环保等领域，如生物降解、废水处理等方面。
总之，酶工程是一门非常重要的学科，它在现代生物技术领域中发挥着至关重要的作用。
酶工程的发展将会为人类的生产和生活带来更多的便利和福利。
酶工程-重点整理总结
第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
第二章微生物发酵产酶1、试述酶生物合成的基本过程。
答：（1）RNA的生物合成—转录：转录的起始、RNA链的延伸、RNA链合成的终止、RNA前体的加工；（2）蛋白质的生物合成—翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止、蛋白质前体的加工。
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酶工程电子教案第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎◆细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表3-1 细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法◆通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
◆常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
◆机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法◆通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
◆常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法◆通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
◆常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
◆有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
◆表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法◆通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
◆将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。
◇自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。
◇为了防止其他微生物在自溶细胞液中生长，必要时可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。
◆根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。
2.酶的提取◆酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
也称为酶的抽提。
◆酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
2.1酶提取的主要方法表4-2 酶的主要提取方法2.2影响酶提取的主要因素◆主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。
◆此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响。
(1)温度：提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。
一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度。
(2)pH值：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
为了提高酶的溶解度，提取时pH值应该避开酶的等电点。
(3)提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。
但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。
所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。
此外，在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速率；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。
在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。
如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。
3.沉淀分离◆沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
◆沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。
◆沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。
表4-3 沉淀分离方法3.1盐析沉淀法◆盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
盐蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。
◆一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。
◆而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。
◆盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。
由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。
◆酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。
它们之间的关系可用下式表示：SLog ＝ - K s IS0式中，S：酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）S0：酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L）K s：盐析系数I：离子强度在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数。
所以上式可以改写为：LogS = LogS0 - K s I =β- K s I式中，β= LogS0，主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH值有关。
当温度和pH 值一定时，β为一常数。
K s为盐析系数，主要决定于盐的性质。
K s的大小与离子价数成正比、与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关。
◆离子强度I 是指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。
即：1I = —∑m i Z i2式中，m i ：离子强度（mol/L）Z i：离子价数2◆对于含有多种酶或蛋白质的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。
◇在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为K s分段盐析；◇而在一定的盐和离子强度的条件下（K s I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。
◆在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
◆在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。
饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
3.2等电点沉淀法◆利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。
◆由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,在实际使用时，等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。
◆在加酸或加碱调节pH值的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。
3.3有机溶剂沉淀法◆利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。
◆有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
◆常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右，不同的酶和使用不同的有机溶剂时，有机溶剂的使用浓度有所不同。
◆有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。
3.4复合沉淀法◆在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。
◆常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
3.5选择性变性沉淀法◆选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。
◆根据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。
◆在应用该法之前，必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类，含量及其物理、化学性质有比较全面的了解。
4.离心分离◆离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
◆在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
4.1离心机的选择◆离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、高速离心机和超速离心机3种。
◇常速离心机（低速离心机）：最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104×g 以下。
主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。
也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
◇高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到1×104～1×105 ×g。
主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。
◇超速离心机：最大转速达(2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达5×105×g甚至更高。
主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。
4.2离心方法的选用◆对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果；◆如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。
◆而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。
4.2.1差速离心：◆差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。
4.2.2密度梯度离心：◆密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。
◆为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。
密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。
这种溶质称为梯度介质。
◆常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。
使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5～60%，密度范围1.02～1.30 g/cm2。
◆密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。
制备得到的密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等(图4-1)。
◆密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成，如图4-2所示。
B Aa b c图4-1 三种梯度形式示意图a:线性梯度 b:凸形梯度 c:凹形梯度图4-2 梯度混合器示意图A:混合室 B:贮液室电磁搅拌器◆离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。