常用的载体有质粒
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➢ 在基因工程细胞培养工程中，需根据其固有特点和具体情况，采取相应措 施、提高质粒稳定性，增加质粒拷贝数，实现培养条件优化，提高表达效 率
三、工程菌的培养
高密度发酵
大肠杆菌对糖类的转运能力很强， 由于大肠杆菌的氧化磷酸化和TCA 循环的能力有限，造成碳代谢流 在糖酵解途径中过量，大肠杆菌 主要通过分泌部分氧化的副产物 使碳代谢流得到平衡，而乙酸就 是其中的主要副产物
基因工程菌的发酵
1
工程菌的来源
2
工程菌的应用
3
工程菌的培养
4
氨基酸发酵的氮源选择
一、工程菌的来源
基因工程
➢基因工程（genetic engineering）是指在基因水 平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据 人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼 接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们 所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的 生物类型，并能使之稳定地遗传给后代
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢培养基组成：不同的培养基能影响微生物的代 谢活动，也能影响质粒的稳定性。质粒在丰富 培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定
➢培养温度：含有重组质粒的克隆菌的比生长速 率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后 会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温 有利于重组质粒稳定地遗传
➢ 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而 导致整个质粒丢失
➢ 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒 结构变化ห้องสมุดไป่ตู้
三、工程菌的培养
质粒稳定性
使质粒稳定的措施
➢组建合适载体 ➢选择适当宿主 ➢施加选择压力 ✓抗生素添加法 ✓抗生素依赖变异法 ✓营养缺陷型法 ➢控制基因过量表达 ➢控制培养条件（温度、pH、DO）
➢阻断乙酸的主要产生途径； ➢限 制 糖 酵 解 途 径 上 的 碳 代 谢 流 ； ➢将 过 量 的 碳 代 谢 流 转 化 为 其 它 低毒的副产物；
三、工程菌的培养
质粒稳定性
➢ 在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的 问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。 此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达 越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一 部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降
一、工程菌的来源
基因工程
➢ 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物 质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连 接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或 受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表 现出另外一种生物的某种性状
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢溶氧：携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增 加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵 液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体 生长及产物合成的需要
➢过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体 生长受到抑制，质粒稳定性差
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢ 菌体比生长速率：比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一 致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。有时，比生长速率大有 利于重组质粒稳定地遗传
➢ 基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。 其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长速率及 表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA的 稳定性尤为重要
➢ 基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细胞培 养过程，由于回复突变或分配作用致使DNA丢失，称为脱落性不稳定， 其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变， 不再表达目的产物，称为结构性不稳定
一、工程菌的来源
构建步骤
二、工程菌的应用
苏氨酸基因工程菌构建策略
三、工程菌的培养
➢就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产 物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但 工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出 不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的 培养有着自身所特有的特点
三、工程菌的培养
培养特点
三、工程菌的培养
表达效率及质粒拷贝数控制
➢ 在基因工程细胞培养工程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基 础上，尽可能提高细胞内质粒拷贝数
➢ 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达 到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝 数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加， 目的基因产量提高
一、工程菌的来源
质粒
➢质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位， 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以 外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。在基因工程中 质粒常被用做基因的载体。质粒上常有抗生素 的抗性基因
一、工程菌的来源
构建步骤
➢目的基因的获得 ➢载体的选择与制备 ➢目的基因与载体连接成重组体 ➢转化或转染受体细胞 ➢重组菌的筛选及目的基因的表达
➢ 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快， 则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌 的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到， 因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率
➢ 在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，来 提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某 个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速 率下降，而重组菌仍能正常生长
➢ 除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术、基因的突变技 术、基因的导入技术等
一、工程菌的来源
表达载体
➢基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中 的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置 换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿 主细胞，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒
➢外源基因插入载体中，使其处于一系列的表达 信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。 克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生 产重组蛋白，被称为表达载体
三、工程菌的培养
高密度发酵
大肠杆菌对糖类的转运能力很强， 由于大肠杆菌的氧化磷酸化和TCA 循环的能力有限，造成碳代谢流 在糖酵解途径中过量，大肠杆菌 主要通过分泌部分氧化的副产物 使碳代谢流得到平衡，而乙酸就 是其中的主要副产物
基因工程菌的发酵
1
工程菌的来源
2
工程菌的应用
3
工程菌的培养
4
氨基酸发酵的氮源选择
一、工程菌的来源
基因工程
➢基因工程（genetic engineering）是指在基因水 平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据 人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼 接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们 所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的 生物类型，并能使之稳定地遗传给后代
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢培养基组成：不同的培养基能影响微生物的代 谢活动，也能影响质粒的稳定性。质粒在丰富 培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定
➢培养温度：含有重组质粒的克隆菌的比生长速 率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后 会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温 有利于重组质粒稳定地遗传
➢ 分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而 导致整个质粒丢失
➢ 结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒 结构变化ห้องสมุดไป่ตู้
三、工程菌的培养
质粒稳定性
使质粒稳定的措施
➢组建合适载体 ➢选择适当宿主 ➢施加选择压力 ✓抗生素添加法 ✓抗生素依赖变异法 ✓营养缺陷型法 ➢控制基因过量表达 ➢控制培养条件（温度、pH、DO）
➢阻断乙酸的主要产生途径； ➢限 制 糖 酵 解 途 径 上 的 碳 代 谢 流 ； ➢将 过 量 的 碳 代 谢 流 转 化 为 其 它 低毒的副产物；
三、工程菌的培养
质粒稳定性
➢ 在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的 问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。 此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达 越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一 部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降
一、工程菌的来源
基因工程
➢ 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物 质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连 接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或 受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表 现出另外一种生物的某种性状
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢溶氧：携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增 加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵 液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体 生长及产物合成的需要
➢过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体 生长受到抑制，质粒稳定性差
三、工程菌的培养
控制培养条件
➢ 菌体比生长速率：比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一 致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。有时，比生长速率大有 利于重组质粒稳定地遗传
➢ 基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。 其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长速率及 表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA的 稳定性尤为重要
➢ 基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细胞培 养过程，由于回复突变或分配作用致使DNA丢失，称为脱落性不稳定， 其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变， 不再表达目的产物，称为结构性不稳定
一、工程菌的来源
构建步骤
二、工程菌的应用
苏氨酸基因工程菌构建策略
三、工程菌的培养
➢就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产 物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但 工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出 不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的 培养有着自身所特有的特点
三、工程菌的培养
培养特点
三、工程菌的培养
表达效率及质粒拷贝数控制
➢ 在基因工程细胞培养工程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基 础上，尽可能提高细胞内质粒拷贝数
➢ 在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达 到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝 数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加， 目的基因产量提高
一、工程菌的来源
质粒
➢质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位， 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以 外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。在基因工程中 质粒常被用做基因的载体。质粒上常有抗生素 的抗性基因
一、工程菌的来源
构建步骤
➢目的基因的获得 ➢载体的选择与制备 ➢目的基因与载体连接成重组体 ➢转化或转染受体细胞 ➢重组菌的筛选及目的基因的表达
➢ 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快， 则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌 的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到， 因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率
➢ 在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，来 提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某 个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速 率下降，而重组菌仍能正常生长
➢ 除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术、基因的突变技 术、基因的导入技术等
一、工程菌的来源
表达载体
➢基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中 的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置 换或插入外源(目的) DNA而将目的DNA带入宿 主细胞，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒
➢外源基因插入载体中，使其处于一系列的表达 信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。 克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生 产重组蛋白，被称为表达载体