细胞增殖和活力培训课件

细胞增殖和活力
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细胞增殖检测技术
直接计数 胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)渗入法 5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU） 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)
检测法 CCK8 MTT检测法 ATP检测
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1.直接计数
利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对 数目进行比较。
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5. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂
(CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是 一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特 异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水 解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成 为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基 结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时， CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中， 因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在 一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强 度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。
用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活 性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增 殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
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7. MTT检测法
MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测 细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理 是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱 氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的水不溶性 的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞 无此功能。
胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也 是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢 过程，通过测定细胞 DNA链内标记核苷酸的量 的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细 胞增殖情况。
优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复 性好。
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4.5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（ EdU）
也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细 胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制 的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的 特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU 标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检 测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内 很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶 解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤， 在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等 现象。
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8. ATP检测
细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也 可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死 亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取 物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的 线性关系。
利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素 luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提 供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶 就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比 ，用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以 方便的进行检测。这种方法非常适用于高通量 细胞增殖检测和筛选。
BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选 。
优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实 验，
缺点： 就是需要变性DNA后才能与抗体结合， 但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料 的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问 题
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活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒 ，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值， 可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞 活力成正比。MTT方法用于判断药物、外源性基因、小 RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用 ，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞 活力、增殖、凋亡等方面）。
优点： 简单：不需要特定的试剂和仪器 准确 缺点： 不适合样品数量多的情况 不适合评估特定的亚群
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台盼蓝
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞 膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞 能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与 活细胞。
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பைடு நூலகம்.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法
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检测细胞增殖能力的方法
一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来 评价细胞的增殖能力。
一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测 方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增 殖能力。
细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否 在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序 ，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活 力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我 们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药 物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用 方法一。
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6. CCK8检测法
是一种基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的 快速高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含 有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯基 )‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。 WST‐8是一种类 似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可 以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物 formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性 越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细 胞数目呈线性关系。
缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核 素污染问题。
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3. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在 DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入 ，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。 同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断 增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力 学有重要意义。