病理组织切片制作

实验四病理组织切片制作

一、实验目的

组织切片技术是病理学中不可缺少的一个组成部分。通过实验，能够使学生了解和掌握病理组织切片的基本方法之一，即石蜡包埋的组织切片法。

二、实验原理

根据病变及检查的要求，合理采集病料，经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后进行切片，在进行染色得到结果。固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来，以便观察。脱水是除去组织中的水分，以利于透明和浸蜡。组织的透明是便于透蜡包埋。包埋的是使石蜡透入组织内部，把软组织变为适当硬度的包埋块，以便切成薄片。最后使用切片机，将包埋块中组织切成薄片。

三、主要仪器及试材

已固定好病料，石蜡，手术刀，手术剪，镊子，脱水框，染色缸，梯度脱水酒精和透明剂一套，烘箱，切片机，毛笔，玻片，蛋白甘油，染色架，酒精灯，三角架，大烧杯，温度计，火柴，切片刀，记号笔或铅笔。

四、实验方法与步骤。

（一）固定

采取的病理材料必须立即放入10％福尔马林固定液中。

（二）脱水

组织经固定后，尚含有多量水分，而水与透明剂苯、石蜡根本不相融合。必须先把组织中的水分除去。但脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体，脱水剂常兼有硬化组织的作用。最常用的脱水剂为酒精、丙酮等。

1．酒精沸点78．4℃，为最常用的脱水剂。脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相混合。最终结果表明，只要脱水环节处理好，都会得到好的切片。脱水的程序为70％一80％一95％一100％。各级酒精2—4小时，视材料的大小、厚薄而定。100％酒精有硬化组织的作用，时间不宜太长，一般不超过3小时。脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织，脱水时间要适当延长。

2．丙酮沸点为56℃。脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间l一3小时左右。

（三）透明

透明对组织有脱酒精及透明两种作用。当组织中全部为透明剂占有时，

光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明，具有这种作用的试剂称为透明剂。常用的透明剂有：

1．二甲苯是最常用的良好透明剂，不影响各种染色。二甲苯易溶于酒精，能溶解石蜡，也是封固剂，不吸收水，透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，特别对小动物组织材料必须严格控制好(各种器官的透明差异很大)，通常为半小时到1小时左右。

当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中，这样可减少透明时间，有利于组织透明彻底，在换组织块透明时候，所用的镊子等器具必须干燥，不得将水滴混入二甲苯中，因水滴易被组织吸收而影响透明程度，潮湿天气更应引起注意。2．冬青油（水杨酸甲酯）为无色油样液体，易溶于醇、醚及冰醋酸，难溶于水。透明速度较慢，数小时或数天。一般经无水乙醇脱水后再入冬青油。

（四）浸蜡（透蜡）

组织经脱水透明后要用石蜡等支持剂透入内部，并除去组织中的透明剂，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成切片。

浸蜡的要点有二：①石蜡要完全渗入细胞的每个部分：②石蜡要紧密而均匀的贴在细胞内外两面，使组织与石蜡成为不可分离的状态。

为了减少组织的收缩和提高浸蜡的效果，浸蜡用的石蜡依据熔点不同，先经低熔点石蜡再经高熔点石蜡。一般设置熔点50—52℃为第一缸蜡，52—54℃为第二缸蜡；54—56℃为第三缸蜡，第三缸石蜡的熔点根据季节可进行调节，夏天使用熔点56—58℃或58—60℃石蜡，盛夏使用熔点60—62℃石蜡。

浸蜡的时间根据不同组织类型及其大小而定：组织1—2cm大小，浸蜡2—3小时，2—3cm浸蜡3—5小时，对细胞密集，纤维成分少，如肝、肾应减少时间，含脂肪和纤维成分较多的组织需增加时间。

浸蜡时石蜡在温箱内的温度应与石蜡的熔点相配合，温度不可过高过低，过高会使组织高度收缩变脆，无法切片，过低石蜡将凝固达不到浸蜡的作用。常规的作法是调节至略高于石蜡熔点2—3℃。控制温度是浸蜡极其重要的关键。

（五）包埋

将液态的石蜡倒入金属包埋框或包埋的纸盒中，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框，完全冷却变硬后再修整蜡块，要求组织外围的石蜡保留适中以便切片。

（六）切片前的准备工作

1．修整蜡块石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介。应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡边。留得过少，使连续切片分片困难且易破坏组织；留得过多，徒占地方，同时使标本之间的距离过远而镜检不便。蜡块两边必须切成平行的直线，否则切下的蜡条弯曲，也不可修成圆角，致蜡带容易分开不能成条。

2．玻片处理一般玻片用76X26mm载片，厚度l一1．5mm，厚于1．5mm的玻片不宜用于高倍镜及油镜的观察，选购玻片应注意：从侧面看白色的为优品，带蓝或绿色的为劣品，平面光滑不带波纹者为上品，稍有波纹者为次品，边缘光滑己加工磨边者为上品，边缘粗糙未经磨边者为次品。载玻片上面如有云雾斑点，系受霉菌侵蚀不能使用。

新的玻片也必须擦洗干净，否则染色时引起切片脱落，方法有①煮沸洗涤法、②洗液浸泡法。最后经95％酒精浸泡脱脂、烘干。

将洗净的载玻片上均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油(防止组织脱片)，放置冰箱备用。

（七）切片制作过程

1．将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上，使蜡块的切面与刀口成平行方向，刀的倾斜度通常为15℃，转动轮转推进器，调节切片厚度为6μm，切成厚度均匀的切片。

2．左手持毛笔，右手旋动切片机转把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻镊蜡片，以正面放入展片箱中，其水温40—43℃左右。待摊平整后捞片。

3．贴附切片左手持载玻片之一端，垂直入水去附贴切片，右手用毛笔辅助推动，附贴至玻片上的三分之二处。

4．切片贴附后，放在空气中稍晾干，即可进行烤片。血块组织、皮肤组织须及时烤片。但对脑组织、脂肪组织待完全晾干后才能进行，这样可防止产生气泡而影响染色。烤片的温度以蜡溶解为准。也可以放置60℃烘箱内烘烤过夜。