探针标记
化学生物学中的分子探针技术
化学生物学中的分子探针技术化学生物学是化学和生物学交叉领域的一个研究方向，主要研究生物分子的结构、构象、功能及其与其他分子之间的相互作用等。
而在近几年的化学生物学领域里，分子探针技术成为了一种非常重要的实验方法。
本文主要介绍分子探针技术的相关知识，以及在化学生物学中的应用。
一、分子探针技术的概念分子探针技术，又称为分子探查技术，指的是利用分子识别，结合特异性现象和化学反应等手段，对生物体中特定结构或化学组分进行定位、测量和研究的一种实验手段。
通俗来讲，就是一种可以帮助我们找到分子的“导航仪”。
二、分子探针技术的应用分子探针技术在化学生物学中的应用非常广泛，涉及到很多领域和方面，例如：1. DNA、RNA测序分子探针技术可以通过高通量测序、原位测序等方法，对DNA、RNA的序列和拷贝数进行测定。
同时可以利用不同的标记方式对特定序列进行检测，如荧光标记、放射性标记等。
2. 药物筛选分子探针技术可以通过对药物与靶分子之间相互作用的研究，快速筛选出具有生物活性且具有潜在药物作用的化合物。
这种研究方式一般可以采用亲和层析、表面等离子共振(SPR)等技术。
3. 酶活性测定分子探针技术可以通过对酶与底物之间的相互作用，测定酶的活性和底物的含量。
例如，荧光标记底物可以通过检测荧光强度的变化，判断酶的活性及底物的浓度。
4. 细胞分子定位使用分子探针技术，可以通过荧光标记等方法，直接对生物体内的物质进行定位。
例如，可使用分子探针来成像肿瘤细胞表面的分子，以便快速接收有效信息并帮助诊断和治疗。
三、分子探针技术的类型按照标方法式的不同，可以将分子探针技术分为许多不同的类型，以下是其中常用的几种。
1. 标记分子探针标记分子探针是指使用特定标记的探针，例如荧光标记、酵素标记等，以便于检测某个分子或生物组分。
例如使用荧光标记的分子，可以发出荧光信号，从而实现对分子的定位和测量。
2. 催化分子探针催化分子探针是指通过某些特定的反应机理，实现对分子或生物组分的测量和识别。
DNA3’端生物素标记
1、准备工作：A、取出TdT Buffer (5X)、Biotin-11-dUTP和Ultrapure water溶解，并置于冰浴上备用。
B、取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA 探针浓度为0.5μM。
2、DNA探针的标记：Ultrapure water 29μlTdT Buffer(5X) 10μl待标记探针(1μM) 5μlBiotin-11-dUTP(5μM) 5μlTdT(10U/μl) 1μl总体积50μlA、参考上述设置反应体系。
注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B、用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。
37℃孵育30分钟。
C、加入2.5μl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3、TdT的去除：A、探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
B、12000-14000g离心1-2分钟。
吸取上清备用。
上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4、探针的纯化(选做)：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：A、对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。
B、-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
C、4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。
小心去除上清，切不可触及沉淀。
D、4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用1. 导言核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。
它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。
本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理2.1 核酸杂交原理核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。
当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。
杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术核酸探针通常需要标记以便于检测。
常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。
这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。
探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。
此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用3.1 基因组学研究核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。
通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。
同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。
例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。
此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
3.3 临床诊断核酸探针在临床诊断中有着广泛应用。
通过对特定的核酸序列进行检测，可以实现对疾病的早期筛查和诊断。
常见的应用包括艾滋病病毒检测、乙肝病毒检测、人类乳头瘤病毒（HPV）检测等。
核酸探针的应用具有高度特异性和灵敏性，可以提供准确的诊断结果。
4. 总结核酸探针作为一种重要的生物技术工具，具有广泛的应用前景。
分子生物学中的探针与标记
分子生物学中的探针与标记分子生物学是生物学的一个重要分支，它主要研究生物分子如何在细胞中发挥作用。
具体来说，分子生物学主要研究DNA、RNA和蛋白质等分子的结构、功能以及相互作用。
在研究这些分子的时候，探针和标记是不可或缺的工具。
探针和标记的概念探针是可供精准识别和检测某一个分子的物质。
在分子生物学中，常常需要对一些特定的序列进行检测和定位，这时就需要以这些序列为基础设计探针，用来检测它们在样本中的存在和位置。
探针的种类很多，包括DNA探针、RNA探针、蛋白质探针等。
标记是将一个分子或一组分子和另外一个化合物或分子结合起来，以便其能够被检测到或追踪。
在分子生物学中，标记也是不可或缺的工具。
标记技术主要被用来追踪、定位或者检测分子的存在与否。
常用的标记包括荧光标记、放射性标记等。
探针和标记的应用在DNA和RNA检测中，探针和标记被广泛应用。
比如，基于PCR（聚合酶链反应）技术，可以快速复制出许多相同的DNA分子。
但是，在进行PCR反应之前，需要用探针将要检测的DNA 序列标记起来。
标记后的DNA片段能够被PCR扩增。
另外，在基因芯片技术中，也广泛应用探针和标记。
基因芯片是一种高通量的检测技术，采用芯片上固定的探针对样本中的DNA进行定量分析。
在这个过程中，标记被用来标出探针（或样品）。
这种技术可以用来同时检测成千上万个基因片段的表达情况。
除了DNA和RNA检测，标记技术还应用在蛋白质检测中。
例如，放射性同位素标记常用于酶和蛋白质的研究。
这种标记使得科学家可以准确地定位和测量这些分子在细胞中的存在及其相互作用。
当然，在应用探针和标记的过程中，仍然存在一些技术难点。
比如，标记的选择需要对分子生物学的特性有深入的了解，标记的选择不当会导致结果不准确。
结语总的来说，分子生物学的探针和标记技术为生物科学家提供了有力的工具，极大地推动了分子生物学的研究进展。
在未来的探究中，随着技术的不断创新和发展，探针和标记技术将会更加准确、高效和普遍应用。
地高辛标记核酸探针的标记方法
地高辛标记核酸探针的标记方法Last revision on 21 December 2020地高辛标记核酸探针的标记方法核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
其化学结构如图1 所示。
采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA探针中。
RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。
寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。
对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。
《基因工程》名词解释
名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。
2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。
其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。
3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。
.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。
Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。
plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。
粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。
并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。
使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法
使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法荧光显微镜是一种常用的实验工具，用于观察和研究细胞内各种生物分子的活动和相互作用。
本文将介绍使用荧光显微镜研究细胞器活动与交互作用的操作方法。
第一步：样品准备在进行荧光显微镜实验之前，首先需要准备好样品。
可以选择细胞培养物或组织切片作为观察对象。
对于细胞培养物，可以将细胞培养在培养皿中，待细胞生长至适当密度后，进行下一步操作。
对于组织切片，需要将组织切割成适当大小的薄片。
第二步：标记荧光探针为了观察细胞器的活动和交互作用，需要使用荧光探针标记目标分子。
荧光探针是一种可以与特定分子结合并发出荧光信号的化合物。
选择适当的荧光探针对目标分子进行标记。
例如，可以使用荧光染料如荧光素、荧光素同工异构体、荧光蛋白等。
第三步：荧光显微镜设置在进行实验之前，需要合理设置荧光显微镜的参数。
首先，选择适当的荧光滤光片，以过滤掉非目标波长的光线。
其次，调整荧光显微镜的聚焦和放大倍率，以获得清晰的图像。
此外，根据实验需求，可以设置时间序列拍摄或者三维成像等功能。
第四步：观察细胞器活动将标记了荧光探针的样品放置在荧光显微镜的台板上，调整焦距，观察细胞器的活动。
可以通过实时观察或者录像的方式记录下细胞器的运动轨迹和相互作用情况。
在观察过程中，可以通过调整荧光显微镜的参数来获得更清晰的图像。
第五步：数据分析观察完成后，需要对获得的图像和数据进行分析。
可以使用图像处理软件对图像进行增强、合并或者分割等处理。
通过对图像的分析，可以得到细胞器的形态、数量、分布等信息。
此外，还可以进行定量分析，如测量细胞器的大小、速度、亮度等参数，以研究细胞器的活动和交互作用。
第六步：结果解读和讨论根据数据分析的结果，可以对观察到的细胞器活动和交互作用进行解读和讨论。
可以比较不同样品或条件下的差异，探究细胞器的功能和调控机制。
此外，还可以与已有的研究结果进行对比和验证，进一步加深对细胞器活动和交互作用的理解。
地高辛标记核酸探针
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
地高辛标记的探针是一种非放射性探针。
1设计 Digoxigenin 标记探针的引物。
每种血清型在保守区域设计一对通用引物。
2 标记探针合成(引物来源上述）
（1）各血清型阳性质粒模板的扩增。
（2）利用引物，通过PCR《参照罗氏公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书》，合成标记探针。
（3）电泳、回收、纯化和定量
3 核酸斑点杂交检测
（1）其他病毒核酸作对照，12种血清型PCR扩增产物。
（2）将12种探针和探针PM（混合探针）与同一血清型不同含量的核酸用常规方法进行核酸杂交。
4.显色。
Fish探针标记方法大全
探针标记方法大全1、DNA的缺口平移法缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。
该技术可以制备序列特异的探针。
当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。
但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。
此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。
2、DNA的随机引物法这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。
这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。
由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。
DNA片段的大小不影响标记的结果。
标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。
标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。
随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。
随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。
3、RNA的体外转录法体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。
这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。
4、RNA的寡脱氧核苷酸法克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。
这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。
EMSA操作步骤
EMSA操作步骤EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳迁移转移实验）是一种常用的生物技术方法，用于研究DNA与蛋白质的相互作用。
EMSA可以在体外检测和分析DNA结合蛋白质的形成复合物。
下面是EMSA的基本操作步骤。
1.DNA探针制备首先，需要根据研究目标设计和合成DNA探针。
DNA探针是由与目标蛋白质结合的DNA序列组成的DNA片段。
这个DNA片段可以从已知的基因组DNA中扩增，或者使用人工合成的DNA序列。
2.DNA探针标记将DNA探针标记上荧光或放射性同位素等标记物，以便在电泳中进行检测和定量。
常用的标记方法包括使用荧光染料标记或使用放射性核素标记。
标记DNA需要进行纯化和测定其浓度。
3.蛋白质提取从感兴趣的组织或细胞中提取蛋白质。
常用的方法包括细胞溶解、裂解、超声波溶解等，使用络合剂、蛋白酶抑制剂和还原剂等添加剂来保护蛋白质免受降解。
4.蛋白质净化通过离心、过滤、洗涤等方法获得纯化的蛋白质。
纯化过程中，也需要添加一些保护蛋白质的添加剂。
5.EMSA实验条件优化对EMSA反应条件进行优化，以获得最佳结果。
例如，调节反应的pH 值、离子浓度、反应温度、反应时间等。
6.反应体系制备将合适的缓冲液、DNA探针、蛋白质溶液和其他必要的添加剂混合在一起，形成EMSA反应体系。
通常，反应体系中还需要添加一些非特异性竞争性DNA片段，以确保特异性结合。
7.EMSA实验进行将EMSA反应体系加载到预先制备的聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，进行电泳分离。
电泳过程中，DNA片段会被蛋白质结合形成DNA-蛋白质复合物。
较大的复合物会迁移较慢，而较小的自由DNA片段会迁移较快。
8.凝胶电泳分析将电泳板取出，进行染色或检测DNA探针的标记物，以可视化复合物和自由DNA片段。
常用的染色方法包括乙酰亚胺染色、溴化乙锭染色等。
另外，也可以使用荧光成像系统、放射性成像系统等仪器进行检测和定量。
rna原位杂交步骤
rna原位杂交步骤RNA原位杂交是一种常用的分子生物学技术，可用于检测RNA的表达和定位。
该技术通过使用互补的探针与待检测的RNA序列发生特异性的碱基配对，从而实现对RNA的检测和定位。
RNA原位杂交的步骤主要包括前处理、探针标记、组织切片、杂交、洗涤、显色和显微镜观察等。
进行前处理。
这一步骤旨在使组织切片的细胞固定、渗透和脱脂。
常用的固定方法包括使用福尔马林、乙醛或乙酸洛伦齐进行组织固定。
然后，将组织切片进行脱脂处理，以去除其中的脂肪和蜡质。
接下来，进行探针标记。
探针是一段与待测RNA序列互补的DNA或RNA序列，可用于与待测RNA序列特异性杂交。
探针可以使用荧光标记物（如荧光染料或荧光素）或放射性同位素进行标记。
标记的探针可用于检测RNA的表达和定位。
然后，进行组织切片。
将前处理后的组织固定在载玻片上，并进行切片。
切片厚度一般为5-20μm，可使用切片机进行切割。
切片后，将载玻片上的组织切片进行烘干，以确保切片的附着性和平整度。
接下来，进行杂交。
将标记的探针与组织切片上的RNA序列进行杂交反应。
这一步骤通常在适当的温度和湿度下进行，以保证探针与目标RNA的特异性结合。
杂交的时间和温度可根据不同的探针和待测RNA序列进行优化。
然后，进行洗涤。
洗涤的目的是去除未与探针结合的杂交物。
洗涤一般使用高盐浓度、高温度或低盐浓度等条件进行，以确保杂交物的特异性。
接下来，进行显色。
将洗涤后的组织切片进行显色处理，以显示出与探针结合的RNA序列。
常用的显色方法包括使用荧光染料或酶标记的抗体进行检测。
显色后的组织切片可在显微镜下观察和记录。
进行显微镜观察。
将显色后的组织切片放置在显微镜下，观察和记录RNA的表达和定位。
根据需要，可以使用不同的放大倍数和成像方式来观察组织切片。
总结起来，RNA原位杂交的步骤包括前处理、探针标记、组织切片、杂交、洗涤、显色和显微镜观察等。
通过这一系列步骤，可以实现对RNA的检测和定位，为研究RNA的表达和功能提供重要的技术支持。
杂交技术
注意：Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理， 对NC膜可用80℃真空烘烤2小时，对尼龙膜还可 用短波紫外线(波长254nm)照射几分钟。
4、Southern印迹的操作过程
(1) 酶切DNA,，电泳分离，使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(NC膜)上。 (3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性
3.2.2 杂交
blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹 法”，也有人翻译为“斑渍法”，更为 普通的是直接称为Southern blot)
一、种类
杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。 固相杂交技术目前较为常用，先将待测 核酸结合到一定的固相支持物上，再与 液相中的标记探针进行杂交。固相支持 物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。
Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年 代末，80年代初发展起来的一种蛋白质检测新 技术。其基本过程
2、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western
Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白 质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸 附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特 异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
（二）、Southern印迹(Southern blot)
荧光探针及其生物学研究中的应用
荧光探针及其生物学研究中的应用荧光探针是一种特殊的标记分子，可以通过特定的化学反应与生物分子结合，并发出荧光信号。
荧光探针在生物学研究中有广泛的应用，可以用于细胞成像、蛋白质定位、细胞功能分析等方面。
下面将介绍荧光探针的应用及其在生物学研究中的意义。
荧光探针在细胞成像方面的应用非常重要。
它可以被用来标记细胞器、分子和蛋白质，从而实现对细胞结构和功能的可视化。
例如，荧光探针可以与细胞核酸结合，用来标记DNA或RNA，进而研究细胞的基因表达和转录水平。
同时，荧光探针还常用于标记细胞膜、内质网、线粒体等细胞器，帮助观察细胞的结构和功能。
在蛋白质定位方面，荧光探针也发挥着重要的作用。
通过将荧光探针与特定蛋白质结合，可以实现对蛋白质的定位和追踪。
这种方法被广泛应用于细胞信号转导、病原体入侵以及蛋白质的亚细胞定位研究中。
例如，研究者可以利用荧光探针追踪细胞中一些特定蛋白质的运动过程，从而揭示蛋白质在细胞中的功能机制。
此外，荧光探针还可以用于细胞功能分析。
一些荧光探针具有特异性的化学反应，能够与细胞内特定的生物分子发生反应，并发出荧光信号。
通过检测荧光信号的强度和变化，可以实时观察细胞内分子的水平和活性。
例如，一些荧光钙探针可以用来检测细胞内钙离子的浓度和动态变化，从而研究细胞内钙信号的传递过程。
荧光探针在生物学研究中的应用具有多个优点。
首先，荧光探针可以实现高灵敏度的检测，能够检测到非常低的分子浓度和微弱的信号。
其次，荧光探针具有很好的空间和时间分辨率，可以实现对细胞和组织的高分辨成像。
此外，荧光探针还可以用于定量分析，可以精确测量生物分子的浓度和活性。
最重要的是，荧光探针与生物分子的结合是可逆的，不会对生物分子的功能产生明显的影响。
综上所述，荧光探针在生物学研究中起到了非常重要的作用。
它可以被用来标记细胞和生物分子，实现对它们的定位、追踪和观察。
通过荧光探针的应用，可以深入了解生物体内的结构和功能，揭示细胞的基本生物过程及其调控机制，对于疾病的诊断和治疗也起到了很大的促进作用。
化学生物学中的探针标记技术-20150318
蛋白荧光标记具有灵敏度高、选择性好、动态响应范 围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境等优点。
探针获取
Peptide- or protein-based affinity molecules: antibodies and antibodylike proteins
Target probe generation
双砷染料四半胱氨酸标签体系
As
Science, 1998, 281, 269-272.
双砷染料四半胱氨酸标签体系
Adams SR，Tsien RY，Nature protocols, 3，1527-1533 (2008).
双砷染料-四半胱氨酸体系的优点
Small size of the TC-Tag (6 amino acids, 585 Da) is less likely to interfere with the structure or biological activity of the protein of interest. (蛋白质的N-端和C-端，内环或是a-螺旋的外表
－Fluorophores and their amine-reactive derivatives
Although the thiourea product is reasonably stable, it has been reported that antibody conjugated with fluorescent isothiocyanates deteriorate over time.
A guide to choosing fluorescent proteins
钱永健
• 钱永健是钱学森的堂侄。他家多科学家和工程师。他中学 时获得过西屋天才奖第一名，大学在哈佛念化学和物理， 20岁毕业，后获英国剑桥大学生理学博士。他哥哥钱永佑 （Richard W Tsien）是神经生物学家，曾任Stanford大 学生理系主任。两兄弟分别获Rhodes和Marshall学者奖 （通常认为是美国大学生竞争性最强的两个奖学金，克林 顿总统曾获Rhodes），到英国留学，九十年代双双成为美 国科学院院士。
fish实验室基本原理
fish实验室基本原理
FISH（荧光原位杂交）实验室是一种分子生物学技术，它用
于在细胞或组织样本中检测和定位特定的DNA或RNA序列。
FISH实验室的基本原理可以分为以下几个步骤：
1. 标记探针：FISH实验中使用的探针是一种DNA或RNA序列，经过标记后可以与目标序列特异性结合。
探针通常被标记上荧光染料，以便在显微镜下观察和定位。
2. 去除样本细胞核：FISH实验通常从组织样本或培养细胞中
提取细胞核。
这一步骤可以使用细胞裂解液或其他方法来破坏细胞膜，并释放出细胞核。
3. 杂交：将标记的探针添加到细胞核中，使其与目标序列结合。
在杂交过程中，探针与目标序列的互补碱基进行特异性配对，形成探针-目标DNA或RNA的杂交复合物。
4. 洗涤：将未与目标序列结合的探针和其他非特异性结合的物质洗掉。
通过洗涤的过程，只有与目标序列结合的探针能够留在样本中。
5. 显微镜观察：在荧光显微镜下观察样本。
荧光染料的激发和发射光谱特性使得可以检测到标记的探针，并确定目标序列的位置和存在情况。
FISH实验室是一种高分辨率的细胞遗传学技术，可以用于研
究细胞基因组结构、染色体重排、染色体异常等。
它在研究遗传疾病、癌症等领域具有广泛的应用。
和实杂交仪工作原理
和实杂交仪工作原理
和实杂交仪是一种基于核酸分子杂交技术的实验室设备，其工作原理涉及核酸分子的变性与复性过程。
以下是和实杂交仪的基本工作原理：
1. 核酸变性：在高温或碱性条件下，双链DNA（或RNA）会解离成单链形式。
2. 探针标记：使用已标记的核酸探针（可以是cDNA、RNA或寡核苷酸），这些探针是互补于目标基因序列的核酸片段。
3. 杂交过程：在适当的缓冲液和温度条件下，标记的探针与目标核酸中的互补序列杂交，形成杂交双链分子（heteroduplex）。
4. 洗涤步骤：通过洗涤去除非特异性结合的探针，只保留与目标序列特异性结合的探针。
5. 信号检测：通过检测标记探针产生的信号来定性、定位或相对定量分析目标核酸序列。
探针标记
核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。
目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。
酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。
化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。
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核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。
最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。
而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。
近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。
另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。
在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。
由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。
与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。
地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。
第四节非放射性标记的核酸探针放射性标记核酸探针在使用中的限制，促使非放射性标记核酸探针的研制迅速发展，在许多方面已代替放射性标记，推动分子杂交技术的广泛应用。
目前已形成两大类非放射标记核酸技术，即酶促反应标记法和化学修饰标记法。
酶促反应标记探针是用缺口平移法，随机引物法或末端加尾法等把修饰的核苷酸如生物素-11-dUTP掺入到探针DNA中，制成标记探针，敏感度高于化学修饰法，但操作程序复杂，产量低，成本高。
化学修饰法是将不同标记物用化学方法连接到DNA分子上，方法简单，成本低，适用于大量制备（>50μg）如光敏生物素标记核酸方法，不需昂贵的酶，只在光照10～20min，生物素就结合在DNA 或RNA分子上。
非放射性标记核酸探针方法很多，现介绍常用的几种方法如下：一、生物素标记核酸探针方法生物素标记的核苷酸是最广泛使用的一种，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾标记法。
实验发现生物素可共价连接在嘧啶环的5位上，合成TTP或UTP的类似物。
在离体条件下，这种生物素化dUTP可作为大肠杆菌多聚酶I（DNA酶I）的底物掺入带有缺口的DNA或RNA，得到生物素标记的核酸探针。
这种标记方法称为缺口平移法。
用标记在DNA上的生物素与链霉亲合素-酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记物进行检测。
缺口平移法标记生物素DNA探针：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中）加下列反应液：待标记DNA 0.1μg/μl 5μl10×NTB1μlDNase I 2pg/μl 1μl消毒三蒸水3μl 总体积达10μl混匀，37℃，15min。
离心10000r/min 1min后，放入冰浴中，继续加入下列反应液：dNTP(ACG)0.5μg/ml2μlBio –11 –dUTP 0.5μg/ml2μl10×NTb4μl消毒三蒸水31μl混匀，短暂离心后，加入DNA聚合酶I（5u/μl）1μl总体积50μl混匀，14℃过夜（10h以上），加入终止液2μl经Sephadex –G –50柱分离，回收生物素标记DNA。
10×NTB配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl2；80mmol/L β-巯基乙醇，500μg/ml BSA。
终止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –H Cl (pH7.5)。
缺口平移法标记探针少量多次标记效果较好，即每次标记DNA 不超过1μ.Bio –11-dUTP要浓贮，分装，-20。
C保存，反复冻融常会降解失活。
Bio –11- dUTP贮存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUT P中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀释液，分装成3μl/支，-20℃保存。
地高辛-dUTP标记DNA也可按此法进行。
乙醇沉淀分离回收标记DNA比较方便，即加入5μl4mmol/l LiC l,125μl冷乙醇，混匀，-20℃放置30min,12000r/min离心5min，去上清，用70%乙醇和无水乙醇洗沉淀物，倒置离心管，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl）-20。
C保存。
用LiCl 可较好地分离DNA和可溶性核苷酸，因为dNTPS的锂盐在乙醇中比钠盐溶解性更大。
二、光敏生物素标记核酸探针光敏生物素有一个连接臂，一端连接生物素，另一端有芳基叠氮化合物。
在可见光照射下，芳基叠氮化合物可能变成活化芳基硝基苯，很易与DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特异结合，大约每50个碱基结合一个生物素，所以只用于标记大于200个核苷酸的片段。
光敏生物素的醋酸盐很易溶于水，与核酸形成的共价结合很稳定。
此法有以下优点：方法简便易行，快速省时，不需昂贵的酶和dUTP等；只需光照，探针稳定，-20℃可保存12个月以上。
适用于DNA和RNA，抗体和酶等的标记。
在原位分子杂交，斑点杂交和Southern印迹杂交中应用，其特异性和灵敏性较高，价廉易购，国内已有试剂盒供应，军事医学科学院放射医学研究所马立人教授等研制和生产的光敏生物素核酸探针和检测试剂盒使用良好。
方法步骤：在一灭菌Eppendorf管中加待标记DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混匀，插入冰浴中，置特制光源下10cm处照射20min。
加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmo l/L EDTA 10μl混匀。
再加入等体积仲丁醇，混匀。
离心1min（100 00r/min）吸去上层仲丁醇，弃去。
再加入仲丁醇25μl，重复提取游离的光敏生物素。
吸去上层无色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸钠，充分混匀，加入冷无水酒精100μl充分混匀，沉淀标记DNA，置-20℃过夜（或-70℃15min）15000r/min离心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，离心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，测定探针浓度，分装，保存于-20℃。
三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen）标记法生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。
此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。
灵敏度与放射性探针相当。
标记方法：取DNA或片段0. 5μg加50μlTE（pH8.0）缓冲液中，再加入5μlg生物素-补骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距离5cm，加等体积T E，移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱（高1.0cm），离心法过柱，收集液体即为Bio –DNA探针。
四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA 探针。
此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。
Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。
在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。
新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。
将DNA用超声打成500～800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。
用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5）在40℃下充分透析，浓缩DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入4mm ol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）在40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。
五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bi o –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15 min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。
已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (p H7.5) 150μl,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃过夜。
1 5000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。
使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体D NA。
此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。
六、生物素随机引物标记探针方法以HBV DNA为例。
取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Phar macia）2μg，用TE（pH8.0）补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。
加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/ L MgCl2, 10mmol/L β巯基乙醇），BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l d ATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水补足体积至48μl，加DNA聚合酶（SABC）8u，混匀，37℃，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，终止反应。
在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP /dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。
Bio-11 -Dutp/dTTP（%）比值为35%时，其标记率最高，显色灵敏度达0.2p g，杂交灵敏度为1～2pg。
二步法缺口平移标记HBv DNA探针，其灵敏度低于随机引物标记。
Mackeg等（Focus,1992；14：21）证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。
随机引物中加入一定比例的d TTP，能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。