白酒窖泥新菌种的筛选新方法

白酒产品具有以己酸乙酯为主的复合香，窖香浓郁， 窖香的形成与窖泥微生物菌群关系密切
浓香型白酒微生物菌种的主要来源
浓香型白酒生产过程
大曲 车间环境
窖泥
窖泥微生物群落结构差异，是浓香型白酒风格的重要基础
2、白酒窖泥微生物研究进展
窖泥微生物的研究和应用
• 成果体现的主要几个方面： 经典微生物技术
以己酸菌分离、强化为主的优质窖泥制备和窖泥维护 己酸菌、甲烷菌相互作用理论对人工窖泥制备的指导
菌落原位杂交结果
菌株14细胞形态图
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
结合厌氧培养技术、FISH与色谱技术，筛选到高产己酸的混合菌J30。
FISH检测液体培养中己酸菌的生长情况
窖泥微生物研究的论文
3、窖泥功能性微生物的筛选
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
• 常规微生物菌种的筛选方法及不足
个体形态
窖泥微生态理论及其营养因子对活性窖泥制备的促进
基于免培养技术的窖泥微生物区系的系统研究及大量 未培养菌种的发现 优势菌、特征菌的分类鉴定及窖泥性状的分子生物学 描述 免培育技术指导下的功能菌筛选、分类鉴定及窖泥强 化应用 分子生物学技术
窖泥微生物研究主要分子生物学技术
• PCR-DGGE
T
有一定的差异
C. butyricum CICC10390T
m-DAP
呼吸醌 无 无 无
半乳糖和核糖
呼吸醌
菌株 A C. amylolyticum JCM14823T C. butyricum CICC10390T
无差异
A分类鉴定—形态观察
菌落圆形凸起，白色至灰色，不透明， 直径约为1.5-2.0mm。
高年份窖泥细菌16S rDNA克隆系统发育树
窖泥微生物群落结构分析（高通量测序）
100 90 80 70
others Clostridium XII Olsenella Saccharofermentans Thermobrachium Lactobacillus Garciella Caloramator Parabacteroides Clostridium XlVa Prevotella Bacteroides Tissierella Clostridium sensu stricto Treponema Lactococcus Sedimentibacter Syntrophomonas Proteiniphilum Alkaliflexus unclassified Petrimonas Clostridium IV Bacillus
2 50.6 1.5 41.4 0.8 88.2 3.9 41.6 2.1
H
5.0×105
1.4×109
1.4×1010
3.0×1010 1.0×1011 9.1×1010 2.9×109
10
1.57 10 2.2 67.4
S 4.2×106 1.9×1010 金种子 H 9.5×105 1.0×1010 S 1.0×106 4.1×1010 巴蜀液 H 2.3×103 4.3×107 H：酒厂老化窖泥；S：酒厂老熟窖泥
Abundance of taxa %
60 50 40 30 20 10 0
低年份 窖池
高年份 窖池
低年份与高年份窖池窖泥细菌“属”水平分类丰度图
老熟与老化窖泥微生物丰度分析（qPCR）
不同酒厂不同性质窖泥表征微生物的qPCR结果
A值 • 研究成果—窖泥群落结构解析 (qPCR ) 窖泥 copy数 拟杆菌门copy 数 厚壁菌门 酒厂 氨基酸杆菌属copy数 样品
• PCR-克隆文库技术
• 高通量测序技术 • qPCR
• FISH
• 菌落原位杂交技术
不同年份窖泥细菌群落结构解析(DGGE)
高、低年份窖泥16S rDNA全序列克隆分析
2.窖泥微生物研究现状
• 研究成果—窖泥群落结构解析(16S rDNA全序列克隆)
低年份窖泥细菌16S rDNA克隆系统发育树
窖泥微生物的分离培养与筛选
基于传统分离培养技术筛选窖泥中特定微生物菌落
细菌
细菌
霉菌
放线菌
酵母菌
放线菌
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
基于16S rDNA克隆技术、DGGE分析与厌氧培养技术结合。
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
采用厌氧培养技术与菌落原位杂交技术（斑点杂交技术）对窖泥中的特征 菌Clostridiaceae 1进行分离筛选获得Clostridium kluyveri 14。
3.1×1011 6.1×1011 6.0×109 3.1×1011 1.3×1012 2.0×1012 6 2.1 108 与 8.6R 109 10 A≥1× 10 × ×＜ 2.8×1012 2.3×1012 1.1×108 9.7×109 窖泥老熟与老化重要临界点 7.1×1011 2.8×1012 4.8×108 2.0×1010 1.1×1012 2.3×1012
浓香型白酒
酱香型白酒
清香型白酒
泥窖窖池
石条窖窖池 底窖泥
陶缸 无窖泥
中国传统浓香型白酒主要产地
江苏 四川 安徽
wenku.baidu.com
四川酿酒资源丰富，拥有众多泥窖老窖池
五粮液古窖池
• 建于明代初期，至今600余年 • 宜宾独特弱酸性黄泥黏土建造
泸州老窖古窖池
• 明代万历年间所建 • 细腻无沙黄泥，色泽金黄，绵软细腻，钙、铁 离子含量少，粘性和保水性好
DGGE电泳谱带越少， 菌的纯度可能越高
方法特点
1
根据16S rDNA 克隆测序准确、 快速判断新菌 种DNA，针对性 纯化筛选，减 少盲目性
2
根据DGGE条 带位置及数 量判断目标 菌种及纯化 程度，避免 随机性;
3
与传统方法 比较，能节 约筛选新菌 种时间和成 本。
4、新菌种的鉴定及代谢分析
两株窖泥新菌种的鉴定及代谢特性分析
16S rDNA序列同源性低于 97%能初步显示是新菌种，但不足 以描述一个新菌种，一个菌种的种群地位需要多相分类鉴定，包括 表型特征和分子水平特征。

表型特征

细胞形态 菌落形态 生化指标 最适pH、温度 极性脂、脂肪酸、细胞壁氨基酸和糖类组分 主要呼吸醌组分等 16S rDNA DNA的G+C含量 DNA-DNA杂交等
10.75 tr 4.40 25.08
含有梭菌属共有的 主要脂肪酸，又有 差异较大的成分
极性脂
具有梭菌属特征极性脂DPG、PE、 和PG，又有一些未分类的脂。
主要结论：验证 细胞壁水解液 A是梭菌属的 DAP 糖 菌株 A m-DAP 半乳糖和葡萄糖 新菌种 C. amylolyticum JCM14823 m-DAP 半乳糖、葡萄糖和核糖
剑南春古窖池
• 明、清古窖池群总面积6万平方米 • 天益老号沿用至今古窖池695口
水井坊古窖池
• 明清酒窖600余年
• “前店后坊”格局的酒作 坊遗址
沱牌古窖池
• 清末泰安作坊
• 含有明、清时 代文化遗物的 堆积层
中国传统浓香型白酒生产工艺特点
周期性开 窖闭窖
多菌种泥窖固态发酵
续糟配料
混蒸混烧
液态单一菌种发酵
金酒
液态单一菌种发酵
伏特加
液态单一菌种发酵
固态多菌种发酵是中国传统白酒区别于其他蒸馏酒的典型工艺特征
中国白酒的香型划分
特 型 或 馥 郁
兼 香
凤 型
老白干
芝麻香
酱香
浓香
清香
米香
豉 香
药 香
[中国白酒十二种香型关系图]
中国传统白酒主要香型及发酵窖池特征
主要三类白酒的生产规模及影响力：
• 窖泥潜在新细菌菌种的筛选实例
研究方法
16S rDNA 克隆技术
PCR-DGGE技术 亨盖特厌氧滚管技术 样品 水井坊20年窖底泥
方法路线
获取纯菌落
获取新序列
克隆技术可获得每 一个16S rDNA序列
16S rDNA序列同 源性低于97%是判 断新菌种的初步 条件
相同的序列具 有相同的DGGE 电泳条带
葡萄糖
S11-3-10 1240.45 373.05 0.00 空白 对照 S11-3-10 0.00 55.59 59.50 0.00
0.00 75.84 0.00 0.00
乳酸钠
224.05 0.00
19.56 136.35
0.00 60.26
具有降乳功能
5、窖泥微生物资源研究展望
窖泥微生物研究及应用展望
白酒窖泥菌种的筛选新方法
内容
1、浓香型白酒及其窖泥概述
2、白酒窖泥微生物研究进展
3、窖泥功能性微生物的筛选 4、新菌种的鉴定及代谢分析
5、窖泥微生物资源研究展望
1、浓香型白酒及其窖泥概述
世界六大蒸馏酒的工艺特征
白兰地
液态单一菌种发酵
传统白酒
固态多菌种复合发酵
老姆酒
液态单一菌种发酵
世界 蒸馏酒
威士忌
随着分子生物学技术在白酒酿造微生态研究中的广泛使 用，人们对窖泥微生物群落结构的系统解析不断深入， 技术手段更加丰富
窖泥微生物研究的热点逐步发展为对窖泥中优势菌、特 征菌和功能菌的发现及利用特征菌表征窖泥特性和以及 探讨窖泥微生物区系形成、功能代谢和演变规律的研究
窖泥微生物研究及应用展望
通过微生物细胞培养技术与基因组学、转录组学、代谢 组学技术结合，系统研究中国传统白酒窖泥微生物，可 以全面反映窖泥成熟过程中活性微生物群落演替规律， 以及解析功能基因在不断变化的窖泥环境下的转录调控 规律，从而在基因表达和代谢通路调控水平揭示优质窖 泥形成机制 通过深入挖掘和保护中国传统浓香型白酒窖泥中宝贵的 微生物资源，可以完善和改良中国传统白酒的生产工艺， 提高中国白酒的国际竞争力
分子水平特征

4.两株窖泥新菌种的鉴定及代谢特性分析
研究方法

亨盖特厌氧滚管技术 常规生理生化试验方法 液相色谱 气相色谱 二维薄层层析等
菌株

菌株S11-3-10 菌株S12-27-1-3-5 Clostridium butyricum CICC10390T Clostridium amylolyticum JCM14823T Methanosarcina barkeri B20MA5710
分类鉴定—化学组分
脂肪酸组分
A 8.87 20.96 3.28 10.26 脂肪酸 C14:0 FAME iso-C15:0 FAME C16:1 ω FAME C16:0 FAME
C. amylolyticum JCM14823T
47.38 tr 14.06 10.34
C. butyricum CICC10390T
分类鉴定—基因水平
菌株S11-3-10基于16S rDNA序列的邻接法进化树分析 注图中*表示在采用最大简约法和最大似然法同时计算出
梭菌属的基因组G+C 含量 范围内（22~55 mol %）
基因组G+C含量比较 G+C (mol %) 菌株 S11-3-10 36.4 C. amylolyticum JCM14823T 32.8 C. butyricum CICC10390T 29.9
菌体杆状，0.5μm×2.0-3.3μm， 单个或成对排列，周生鞭毛。革 兰氏阳性，产芽孢，能运动。而 相似菌C. amylolyticu JCM14823T 不产芽孢。
39
分类鉴定—生理生化特征
主要结论：A与相似菌 生理生化特征有明显 差异
代谢产物分析
代谢产物分析
浓度（mg/L） 碳源 样品 空白 对照 乙醇 0.00 乙酸 39.73 丙酸 异丁酸 丁酸 异戊酸 戊酸 己酸 0.00 0.00 0.00 0.00 22.70 16.09 37.28 3.22 0.00 36.84 0.00 0.00 0.00 乳酸 0.00 0.00 1103.90 449.00
窖泥微生物研究及应用展望
有关窖泥微生物的研究思路及手段，可以促进大曲微生 物、其它酒类酿造微生物、其它发酵产品微生物的研究 思路和手段的发展
(copies/g窖泥)
(copies/g窖泥) (copies/g窖泥)
R值
(厚壁菌门copy数 /拟杆菌门copy数)
S 文王 H S1 H1 渔樵仙 S2 H2 S 缘河 H S 沱牌
1. 4×106 1.0×105 1.0×107 6.0×105 1.1×107 8.0×103 3.0×107 1.1×105 7.0×106
常规筛选方法及依据
菌落形态
筛选一般常见菌种
生理生化特征
错判、漏判
复杂环境微生物体系
无法有目的性 筛选新菌种
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
• 窖泥潜在新细菌菌种的筛选方法
培养方法
筛选 分离 纯化
免培养方法
PCR扩增 16S rDNA克隆 基因测序 DGGE分析
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选