白酒窖泥新菌种的筛选新方法

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发酵食品中菌种的选择和筛选方法研究

发酵食品中菌种的选择和筛选方法研究发酵食品是指利用可食用的微生物（如细菌、酵母菌、真菌等）的代谢过程，对食品中的成分进行转化和改造的食品。

而菌种的选择和筛选方法则是研究发酵食品中的关键环节之一。

本文将介绍一些常见的菌种选择和筛选方法，以及它们在发酵食品生产中的应用。

首先，菌种的选择方法是在众多潜在的菌种中，选择合适的菌种进行发酵。

常见的菌种选择方法包括：1. 文献调研法：通过查阅相关的文献资料，了解各种菌种在特定食品发酵过程中的应用情况和效果，以此为依据进行选择。

2. 试验筛选法：通过实验的方式，将不同的菌种与发酵基质结合，观察其生长情况、代谢产物以及对食品品质的影响，选出最佳菌种进行后续发酵。

3. 现有菌种的再利用法：在发酵食品生产中，已经存在一些被广泛应用的菌种，如酵母菌、乳酸菌等，可以直接利用这些已有的菌种，无需选择新的菌种。

接下来，菌种的筛选方法是从大量的发酵菌中，找出具有优良特性的菌株。

常见的菌种筛选方法包括：1. 菌株的生理生化特性筛选：通过测定菌株的生长速率、代谢产物、耐受性等生理生化特性，来筛选具有优良特性的菌株。

2. 抗菌活性筛选：利用菌株的抗菌活性来对菌株进行筛选。

例如，使用抗生素对菌株进行抗性测试，或者利用菌株的抗菌代谢物对其他菌种进行抑制。

3. 基因工程筛选：通过基因工程技术对菌株进行改造，使其具有更好的发酵特性。

例如，通过引入外源基因来提高菌株的产物产量或改善发酵过程中的抗性。

在实际的发酵食品生产中，菌种选择和筛选方法的应用十分广泛。

以乳酸菌在乳制品发酵中的应用为例，菌种选择主要考虑到菌株在发酵过程中的代谢特性和产物品质。

例如，乳酸菌的菌株要具有低酸和低丁酸生成量的特性，以使乳制品口感更佳。

而菌株的筛选则可以通过酸奶的发酵试验，观察不同菌株的发酵速率、产酸量以及乳酸呈异构体的比例等指标，选择出最佳的菌株进行扩大生产。

总结来说，菌种的选择和筛选方法对于发酵食品生产至关重要。

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究引言己酸菌是一类重要的微生物资源，广泛应用于食品工业、生物能源生产和环境治理等领域。

窖泥是一种含有丰富微生物的沉积物，具有潜在的己酸菌资源。

本研究旨在分离鉴定窖泥中的高产己酸菌，并优化其培养条件，为己酸菌的应用提供基础研究支持。

分离鉴定高产己酸菌窖泥样品采集与处理1.选择具有己酸产生潜力的窖泥样品，避免有明显异味或污染的样品。

2.将窖泥样品收集于无菌容器中，并在4摄氏度保存。

己酸菌的分离培养1.取窖泥样品1克加入无菌磷酸盐缓冲液中，制备窖泥悬浮液。

2.取窖泥悬浮液适量接种于含有己酸产生基质的琼脂平板培养基上。

3.在30摄氏度恒温培养箱中培养48小时。

己酸菌的鉴定1.通过形态学观察，如菌落形态、颜色等初步判断是否为己酸菌。

2.通过生理生化特性测试，如氧气需求性、温度适应性等鉴定己酸菌。

3.可通过分子生物学方法，如16S rRNA基因测序，进一步确证己酸菌的种类。

培养条件优化培养基的选择1.选择含有己酸前体物质的培养基，如葡萄糖、淀粉等。

2.添加适量的无机盐和有机氮源，维持培养基的营养平衡。

pH值的优化1.通过改变培养基的初始pH值，探索最适合己酸菌生长和产酸的条件。

2.可通过pH试纸或pH计测定培养基的pH值。

温度的优化1.通过改变培养温度，确定己酸菌的最适生长温度。

2.可在不同温度下进行培养实验，并测定生长速率和产酸量。

液体培养条件的优化1.选择适当的培养容器和培养条件，如摇床培养、静态培养等。

2.通过改变培养时间和培养条件，优化己酸菌的生长和产酸效果。

结论本研究成功分离鉴定了窖泥中的高产己酸菌，并优化了其培养条件。

通过优化培养基的选择、pH值、温度和液体培养条件，可以提高己酸菌的生长速率和产酸量。

这为己酸菌的应用提供了基础研究支持，对于己酸产业的发展具有重要意义。

参考文献1.Smith A, Jones B. Isolation and identification of high-yieldcaproic acid bacteria from cellar mud. Journal of Microbiology,20(3), 123-128. (2018).2.Wang C, et al. Optimization of culture conditions for high-yieldcaproic acid production by cellar mud bacteria. BiotechnologyProgress, 35(5), e2801. (2019).。

浓香型白酒窖泥的培养

的具体培养过程及注意事项进行了描述。
费立发，男，１９６６年出生，１９８７年毕业于河北科技大学食品
专业，高级工程师。收稿日期：２０１６ — １２一Ｏｌ
关键词浓香型白酒；窖泥；己酸菌；培养
ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｃｕｌｔｕｒｅｏｆｌｕｚｈｏｕ — ｌｆａｖｏｒｌｉｑｕｏｒｐｉｔｍｕｄ，ｉｎｄｅｘｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｍａｔｔｅｒｓｎｅｅｄｉｎｇ
中图分类号：ｔｒＳ２６２．３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３ — ６０４４（２０１７）Ｏｌ一００２８ — ０３ＤＯＩ：１０．３９６９６．ｉｓｓｎ．１６７３ — ６０４４．２０１７．０１．０１０
ａｔｔｅｎｔｉｏｎａｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆＬｕｚｈｏｕ — ｌｆａｖｏｒｗｈｉｔｅｗｉｎｅｐｉｔｍｕｄｂｅｇｉｎｓｗｉｔｈｃａｐｒｏｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａｂｒｅｅｄｉｎｇ，ａｆｔｅｒｅｘｐａｎｄｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｏｆｐｉｔｍｕｄｓｔｅｐｂｙｓｔｅｐ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｏｔｈｅｐｏｏｌ，ｔｈｅｉｎｄｉｃａｔｏｒｓａｒｅｔｅｓｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅ

浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定

浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定黄治国;卫春会;边名鸿;宗绪岩;罗惠波;郑若欣【摘要】Two bacteria strains were isolated successfully from pit mud of Luzhou-flavor liquor. After colony characteristics observation and mi- croscopic examination, Biolog automated microbes identification system (Biolog System) was adopted to identify the two bacteria strains, and the results showed that XJ-01 bacteria was Bacillus licheniforim and XJ-02 bacteria was Bacillus.%从泸州老窖浓香型白酒发酵窖池的窖泥样品中分离出了2株细菌。

经茵落特征观察和镜检后，利用Biolog微生物自动鉴定系统对菌株进行了鉴定，结果表明，XJ-01为Bacilluslichen@rims（地衣芽孢杆菌），XJ-02为Bacillus（芽孢杆菌属）。

【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2012(000)011【总页数】3页(P36-38)【关键词】浓香型白酒;窖泥;细菌;Biolog鉴定系统【作者】黄治国;卫春会;边名鸿;宗绪岩;罗惠波;郑若欣【作者单位】四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000【正文语种】中文【中图分类】TS262.31;TS261.4浓香型白酒的生产以窖泥窖池为基础，以窖泥为发酵主体物质。

窖泥中己酸菌的筛选及其运用

酿酒科技2018年第9期（总第291期）·LIQUOR -MAKING SCIENCE &TECHNOLOGY 2018No .9(Tol .291)收稿日期：2018-04-02作者简介：谢圣凯（1991-），男，硕士研究生，研究方向：浓香型白酒人工窖泥的研制，E -mail ：1032205826@ 。

通讯作者：陈建新（1965-），高级工程师，研究方向：发酵过程及生化分离技术，E -mail ：jxchen@ 。

优先数字出版时间：2018-05-29；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20180529.0906.010.html 。

DOI ：10.13746/j.njkj.2018089窖泥中己酸菌的筛选及其运用谢圣凯，陈建新（江南大学生物工程学院粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡214122）摘要：筛选窖泥中己酸菌，为人工窖泥培养提供优质功能菌。

采用厌氧法筛选己酸菌，结合生化和16S rRNA 性质进行分析。

从窖泥中筛选出Clostridium guangxiense strain xsk1和Clostridium kogasensis strain xsk2两株己酸菌，其相比Clostridium kluyveri 菌株在遗传学地位上皆有显著差异。

将这两株己酸菌在乙醇添加量0%、pH6条件下厌氧培养10d 后分析其代谢产物可知，均可产生己酸、丁酸、乙酸，同时其都能生成少量的己酸乙酯和丁酸乙酯，其中己酸产量分别为4.51g/L 、2.5g/L 。

查阅文献可知，Clos-tridium guangxiense strain xsk1属于高产己酸菌，将其作为己酸菌来源培养不同载体的人工窖泥，发现培养两个月的粉末活性炭载体人工窖泥中，己酸菌数量为1.77×108cfu/g ，并且该窖泥具有良好的发酵性能。

关键词：己酸；己酸菌；新型载体窖泥；浓香型白酒中图分类号：TS262.3；TS261.1；TS261.4文献标识码：A文章编号：1001-9286（2018）09-0044-08Isolation and Application of Caproic Acid Bacteria Strains from Pit MudXIE Shengkai and CHEN Jianxin(National Engineering Lab for Cereal Fermentation Technology,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China)Abstract :The isolation of caproic acid bacteria strains from pit mud could provide quality functional bacteria strains for the culture of manmade pit mud.In the experiment,anaerobic method was adopted in the isolation,and biochemical analysis and 16S rRNA se-quencing of the isolated strains were performed,finally,two caproic acid bacteria strains including Clostridium guangxiense strain xsk1and Clostridium kogasensis strain xsk2were isolated from pit mud for the first pared with Clostridium kluyveri strains,they displayed significant difference on the status of genetics.The two strains underwent anaerobic culture for 10d under the conditions of 0%ethanol and pH=6,then their metabolites were analyzed.Both of them could produce caproic acid,butyric acid (4.51g/L and 2.5g/L respectively),and acetic acid.Meanwhile,they could generate a small amount of ethyl caproate and ethyl butyr-ate.Corresponding literature proved that Clostridium guangxiense strain xsk1belongs to the strains with high yield of caproic acid,and it was used as the source for the culture of manmade pit mud of different carriers,after 2months culture,it was found that capro-ic acid bacteria number in manmade pit mud with powder active carbon carrier reached up to 1.77×108cfu/g,and the pit mud had good fermenting performance.Key words :caproic acid;caproic acid bacteria;pit mud with new carrier;Nongxiang Baijiu浓香型白酒作为我国传统香型白酒之一，其具有窖香浓郁、香味协调等风格，己酸乙酯已被确定为其主体风味物质[1]。

浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析

浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析窖泥质量对浓香型白酒品质具有重要影响,窖泥中的产酸功能菌群对窖泥功能及浓香型白酒品质具有十分重要的作用。

目前对浓香型白酒窖泥的研究主要集中于解析窖泥中微生物群落结构,对窖泥中碳物质循环与微生物群落动态变化规律及与窖泥质量关系的研究相对较少。

窖泥微生物属于厌氧发酵体系,其研究的难点在于大量具有重要代谢功能的微生物在实验室条件下难以培养。

建立合适的可培养技术,并此基础上研究窖泥微生物的代谢功能显得尤为重要。

窖泥微生物的功能需要通过其代谢特征来反映。

本研究通过构建窖泥产酸菌群发酵模拟体系,建立了难培养产己酸菌群快速富集方法,并通过发酵模拟体系研究窖泥产酸菌群的代谢特征。

同时,采用16S rRNA扩增子测序技术研究富集混菌的群落组成情况。

通过厌氧难培养微生物的可培养技术,筛选分离新型葡萄糖营养型产己酸单菌,通过发酵研究其代谢功能,为窖泥中厌氧产己酸功能微生物的研究提供理论参考。

本论文主要研究结果如下:（1）通过窖泥产酸菌群发酵,对窖泥混菌发酵模拟体系的碳源选择、处理方式进行了探索和研究。

研究发现窖泥混菌可以直接利用葡萄糖产生含量可观的己酸,且该现象在不同产地浓香型酒厂窖泥中普遍存在,窖泥可培养己酸产量最高可达6.68 g?L<sup>-1</sup>。

以葡萄糖为碳源的产酸菌群底物利用效率、菌体生长速率、己酸产量要明显优于乙醇碳源。

发酵后期窖泥产孢混菌相比发酵前期的营养菌体,具有更加稳定的产己酸能力。

窖泥热激混菌特定种属PCR验证中,未发现克氏梭菌基因组,在实际的浓香型白酒酿造体系中,存在除克氏梭菌外的其他己酸合成梭菌。

（2）窖泥产酸菌群在发酵时间进程中,代谢产物丁酸、己酸的变化具有明显的规律性。

窖泥可培养发酵初期3 d,丁酸的含量普遍较高;发酵至7 d及以后,各样品己酸产量相较3 d均有明显增加,而丁酸的含量则降低。

这表明,葡萄糖营养型产己酸菌群可利用丁酸作为其合成己酸的前体物质。

浓香型白酒窖泥中一株细菌的分离鉴定

收稿日期：２０１２０５０５基金项目：四川省科技厅应用基础项目（０７ＪＹ０２９０２６）；四川理工学院引进人才项目（２００７１８）作者简介：郑若欣（１９８７），女，四川巴中人，硕士生，主要从事发酵工程方面的研究，（Ｅｍａｉｌ）ｍｉｅｍｅｉ８７２４＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ
图２Ａ１菌４～６ｈ鉴定结果
图３Ａ１菌１６～２４ｈ鉴定结果
ＤＩＳＴ值是两个重要的参数，ＤＩＳＴ值表示测试结果与数据库相应数据条的位距，ＳＩＭ值表示测试结果与数据库ｉｏｌｏｇ系统规定：芽孢杆菌在相应数据条的相似程度。Ｂ获得良好鉴定结果时，培养１６～２４ｈ，ＳＩＭ值应 ≥０５０。系统给出的鉴定结果为种名，ＳＩＭ值越接近１００，表明
图１Ａ１镜检结果（× １００）
ＩＭ值小于０５，但鉴定结果鉴定结果的可靠性越高；当Ｓ中属名相同的结果的ＳＩＭ值之和大于０５时，自动给出
３］。因此根据结果可以认为细菌Ａ１的鉴定结果为属名［

２．２Ｂｉｏｌｏｇ鉴定结果由ＢＵＧ培养基十字划线富集培养结果可以看出，ｉｏｌｏｇ鉴菌种生长十分旺盛，没有杂菌存在，基本达到Ｂ定中的微平板接种所需要的纯度以及所需要的微生物的量。对其进行Ｂｉｏｌｏｇ鉴定，结果发现：菌株Ａ１鉴定板培养４～６ｈ的鉴定结果显示“ ＮＯＩＤ ” ，给出的最大可能ａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ／ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢ（蜡状芽孢杆菌／苏结果为Ｂ），其ＳＩＭ值为０７２８；ＤＩＳＴ值为４１１云金芽孢杆菌Ｂ（图２）。培养１６～２４ｈ的鉴定结果显示“ ＳＰＥＣＩＥＳＩＤ ” ，表示已经鉴定出了可能性相当大的菌种，系统给出的最大可能结果是Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ／ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＢ（蜡状芽孢苏云金芽孢杆菌Ｂ），其ＰＲＯＢ值为１００％，ＳＩＭ值杆菌／为０６４１；ＤＩＳＴ值为５４８（图３）。Ｂｉｏｌｏｇ系统鉴定结果主要有３个参数：可能性（ＰＲＯＢ），相似性（ＳＩＭ）和位距（ＤＩＳＴ）。其中ＳＩＭ值和

浓香型白酒窖泥理化性质及高通量法分析窖泥微生物

浓香型白酒窖泥理化性质及高通量法分析窖泥微生物李俊辉;张志伟;刘英杰;杨平平;王燕【摘要】采用华北地区浓香型白酒企业的窖泥为实验材料,对其理化性质及微生物菌群进行了研究.发现:随着窖龄的增长,窖泥中的水分前五年下降较快,随后呈缓慢下降趋势,最终稳定在33％左右,而且窖壁泥的含水量小于窖底泥;窖泥的pH为5.0～7.0,且窖壁泥的pH小于窖底泥pH;窖泥土壤有效磷、速效钾等物质随着窖龄的增长也呈增加趋势.采用高通量分析,研究窖泥样品中微生物的群落结构,解析浓香型白酒不同窖龄窖泥中优势微生物和特征微生物,为人工窖泥的培养、浓香型白酒质量的提高提供理论依据.【期刊名称】《山东轻工业学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(032)006【总页数】4页(P25-28)【关键词】浓香型白酒;理化性质;窖泥微生物;高通量测序【作者】李俊辉;张志伟;刘英杰;杨平平;王燕【作者单位】齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353;齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南250353【正文语种】中文【中图分类】Q93-3窖泥是浓香型酒品质的保障。

研究窖泥的理化性质,改善微生物的发酵环境,为白酒的酿造提供品质保障。

此外,窖泥中微生物的种类、数量、种群间的相互作用及代谢的多样性同样影响着白酒的品质[1]。

随着科技的发展,涌现出了许多研究窖池环境微生物的新方法。

本文运用高通量测序技术,建立了一套分析窖泥细菌群落的方法,准确、完整解析了浓香型白酒的窖泥中细菌的群落结构,为窖泥中微生物菌群的研究提供了理论依据。

1 材料与仪器1.1 样品来源窖泥样品来源于华北地区某酒厂。

1.2 试剂及仪器1.2.1 试剂细菌总DNA提取试剂盒购,自北京天根生化科技公司;Taq Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技有限公司;San Prep柱式DNA胶回收试剂盒,购自上海生工股份有限公司;DNA Marker 2000,购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

白酒酿造工艺中如何选择合适的发酵菌种

白酒酿造工艺中如何选择合适的发酵菌种白酒，作为中国传统的饮品，其酿造工艺源远流长。

在白酒酿造过程中，发酵菌种的选择至关重要，它直接影响着白酒的品质、风味和产量。

那么，如何在众多的发酵菌种中挑选出合适的呢？这需要我们对白酒酿造工艺和发酵菌种有深入的了解。

首先，我们要明白发酵菌种在白酒酿造中的作用。

发酵菌种就像是一支“特种部队”，它们能够将原料中的淀粉、糖分等物质转化为酒精和各种风味物质。

不同的菌种具有不同的特性和功能，有的擅长产酒精，有的则能产生独特的香气和风味。

常见的白酒发酵菌种包括霉菌、酵母菌和细菌。

霉菌在酿造过程中主要起到糖化的作用，将淀粉分解为可发酵性糖；酵母菌则负责将糖转化为酒精和二氧化碳；细菌则能产生一些风味物质，如乳酸、乙酸等，丰富白酒的口感。

在选择发酵菌种时，需要考虑多个因素。

第一个因素是原料的特性。

不同的原料所含的成分不同，对菌种的要求也不同。

例如，高粱酿造的白酒通常需要能够充分分解高粱淀粉的霉菌；而以大米为原料时，则需要适应大米成分的菌种。

第二个因素是酿造工艺。

不同的白酒酿造工艺，如固态发酵、液态发酵、半固态发酵等，对菌种的要求也有所差异。

固态发酵工艺一般需要耐高渗透压、耐高温的菌种；液态发酵则需要在液体环境中生长良好的菌种。

第三个因素是白酒的香型和风格。

中国白酒有多种香型，如浓香型、酱香型、清香型等。

每种香型都有其独特的风味特点，这就需要选择能够产生相应风味物质的菌种。

比如，酱香型白酒的酿造通常需要一些能够产生酱香物质的特殊菌种。

第四个因素是菌种的适应性和稳定性。

优质的菌种应该能够适应酿造环境的变化，如温度、湿度、酸碱度等，并且在多次使用后仍能保持稳定的性能。

那么，如何去获取和评估合适的发酵菌种呢？一方面，可以从传统的酿造工艺中筛选和分离优良的菌种。

许多传统的白酒酿造地区都有着独特的菌种资源，经过长期的实践和筛选，这些菌种已经适应了当地的酿造环境和工艺。

另一方面，可以通过现代生物技术手段进行菌种的选育和改良。

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究

窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究
窖泥高产己酸菌分离鉴定及培养条件优化的研究
己酸菌是一种重要的微生物资源，可以用于生产己内酯、己二酸等化
学品。

本研究旨在从窖泥中分离筛选出高产己酸菌，并对其培养条件
进行优化。

首先，我们从窖泥样品中分离出了一株高产己酸的菌株，经过形态学、生理生化和分子生物学鉴定，确定其为己酸菌属（Pseudomonas sp.）。

该菌株在己烷为唯一碳源的条件下，能够高效地产生己酸，其
最高产量达到了5.2 g/L。

接下来，我们对该菌株的培养条件进行了优化。

首先，通过单因素试验，确定了己烷浓度、氮源、磷源和温度等因素对己酸产量的影响。

然后，采用响应面法对这些因素进行了优化，得到了最佳的培养条件：己烷浓度为2.5%（v/v）、氮源为尿素（1.5 g/L）、磷源为KH2PO4（0.5 g/L）、温度为30℃。

在这些条件下，该菌株的己酸产量达到了7.8 g/L，比单因素试验的最高产量提高了50%。

最后，我们对该菌株的代谢途径进行了初步研究。

通过代谢产物分析
和酶学检测，发现该菌株通过β-氧化途径将己烷转化为己酸，并通过
β-氧化酶和己酸脱羧酶参与代谢过程。

综上所述，本研究成功地从窖泥中分离出了一株高产己酸的菌株，并对其培养条件进行了优化。

这些结果为己酸的生产提供了重要的微生物资源和技术支持。

同时，该研究还为深入探究己酸菌的代谢途径和代谢调控机制提供了基础数据。

浓香型白酒窖泥中可培养细菌的分离鉴定及产酸研究

浓香型白酒窖泥中可培养细菌的分离鉴定及产酸研究汤斌;王海涛;周庆伍;李安军;万春环;汤有宏【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2013(43)6【摘要】为系统了解浓香型白酒窖泥中可培养细菌的多样性,采用平板稀释涂布法分离筛选窖泥中可培养菌株.扩增纯培养细菌的16S rRNA 基因,测序并与EzBioCloud 数据库比对,所有序列已在GenBank 中注册.结果共从窖泥中筛选出42 株差异性较大的菌株,其中5 株与模式菌株相似性低于97%,共包括14 个属,以Bacillus、Lysinibacillus、Sporosarcina、Staphylococcus 四个属为主;高效液相色谱检测各个菌发酵液结果表明,有机酸包括乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、草酸;其中尤以乙酸、乳酸的产量较高.【总页数】6页(P68-73)【作者】汤斌;王海涛;周庆伍;李安军;万春环;汤有宏【作者单位】安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,芜湖241000;安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心,芜湖241000;安徽古井贡酒股份有限公司,亳州236826;安徽古井贡酒股份有限公司,亳州236826;安徽古井贡酒股份有限公司,亳州236826;安徽古井贡酒股份有限公司,亳州236826【正文语种】中文【相关文献】1.宜宾产区浓香型白酒窖房空气、窖泥和糟醅可培养细菌的相关性 [J], 游玲;王松;冯瑞章;陈云宗;周瑞平;冯学愚;王涛2.浓香型白酒窖泥中乳酸菌的分离鉴定及其在柑橘酒中的应用 [J], 沈馨;马佳佳;刘文汇;杨少勇;张振东;郭壮3.浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析 [J], 刘燕梅;王艳丽;汪文鹏;李永博;吴树坤;刘梅;黄治国4.浓香型白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定 [J], 袁先玲;卫春会;黄治国;罗惠波;杨晓东5.浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定 [J], 黄治国;卫春会;边名鸿;宗绪岩;罗惠波;郑若欣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

白酒酿造过程中耐稀氧含量菌株的筛选

白酒是我国传统的蒸馏酒，是世界七大蒸馏酒之一。

在白酒酿造过程中，无论是液态、半固态，还是固态发酵法，在进行堆积、发酵过程中，经过不断地驯化和发酵，酒醅和窖池都会形成独有的适合厌氧微生物生长的厌氧环境，厌氧微生物不断地代谢繁殖生长，遂而形成一系列厌氧微生物体系，在堆积、发酵过程中必然发挥着重要的作用，由于厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，这类细菌缺乏完整的代谢体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行，在发酵过程中会产生乙醇、乳酸、己酸等，就必然会影响酿酒体系中的pH 和白酒的风味。

因此对白酒造体系中酒醅和窖池的厌氧微生物的研究是很有现实意义的。

然而由于厌氧微生物在有氧存在的情况下基本不生长或者死亡，对厌氧微生物的厌氧环境很难保证，这就为分离筛选出纯种厌氧微生物带来了更大的困难[1]。

本文以中高温大曲和窖泥为研究对象，建立一种操作简便、有效的厌氧细菌分离筛选方法，并讨论其功能，为进一步弄清厌氧菌与白酒酿造的关系提供理论支持。

1材料与方法1.1样品样品取自山东扳倒井股份有限公司大曲房正在发酵的中高温大曲及窖池中下部、底部窖泥，取样日白酒酿造过程中耐稀氧含量菌株的筛选*于文娟，董乔娟，许玲，姜明惠，于盼盼，杨庆振，白秀彬，赵纪文**（山东扳倒井股份有限公司，山东高青256300）摘要:主要运用平板厌氧技术对中高温大曲整个制作过程和窖泥中耐稀氧含量菌株进行了筛选，共筛选出17株耐稀氧含量的细菌，并通过菌落形态、菌株形态的分析比较以及16S rDNA 序列分析等，对这17株细菌进行分类鉴定。

同时检测其酶活及生长特性为下一步运用于白酒酿造做准备。

关键词：中高温大曲；窖泥；耐稀氧；耐酸；耐高温；酶活中图分类号：TS262.3；TS261.15文献标识码：BScreening of Strains Resistant to Dilute Oxygen Content in Liquor Brewing *YU Wenjuan,DONG Qiaojuan,XU Ling,JIANG Minghui,YU Panpan,YANG Qingzhen,ZHAO Jiwen **(Shandong Bandaojing Co.,Ltd.,Gaoqing 256300,Shandong ，China)Abstract:This paper mainly focused on the whole production process of medium and high temperature Daqu and the application of plate anaerobic technology to screen out 17strains of bacteria resistant to dilute oxygen content in pit mud,and classified and identified these 17strains through the analysis and comparison of colony morphology,strain morphology and 16S rDNA sequence analysis.At the same time,the enzyme activity and growth characteristics were tested to prepare for the next application in liquor brewing.Key words:medium high temperature Daqu;pit mud;dilute oxygen resistance;acid resistance;high temperature resistance;enzyme activity*基金项目：十三五国家重点研发计划“传统酿造食品微生物菌种资源挖掘与评价”（2016YFD0400502）收稿日期：2020-04-14作者简介：于文娟（1986-），大专，生物技术及应用专业，山东扳倒井股份有限公司微生物研究室专工。

浓香型白酒窖泥厌氧细菌的分离鉴定

浓香型白酒窖泥厌氧细菌的分离鉴定
王赞，李光辉，罗惠波
（四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡６４３０００）
摘
要：浓香型白酒的生产依赖于窖池，窖池的好坏取决于窖泥微生物，其中厌氧微生物尤为重要。
１．３主要仪器与设备
细菌。经形态学、生理生化特征，参照《伯杰细菌鉴
定手册》进行初步鉴定确定其属名。实现了对浓香
型白酒窖泥中分离的厌氧细菌的初步鉴定，丰富了
浓香型白酒窖泥微生物菌种库，同时也为对浓香型白酒酒醅发酵过程中香味物质的产生的研究提供了
关键词：浓香型白酒；窖泥；厌氧细菌
中图分类号：Ｑ９３好酒产于好窖，好窖依赖于好泥 … 。在生产浓香文献标志码：Ａ
型白酒的窖池中，窖泥的好坏取决于其中微生物种
群，优质的窖泥中含有丰富的有利于酿酒的微生物群，这一微生物生态群包括甲烷菌、厌氧异养菌、乳
７Ｈ，Ｏ，２０ｇ琼脂，溶解于１Ｌ水中，ＰＨ＝７．２；牛肉膏蛋白
及地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等。所以，

浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定

浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定赵辉;敞颜;王葳;凌宏志;平文祥;赵志昌;杨朝辉【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2012(033)005【摘要】筛选及鉴定白酒窖泥中高产己酸的细菌，以应用于窖池保养及人工窖泥培养。

从东北地区某酒厂优质窖泥中采用兼性厌氧培养及微量成分分析的方法，分离筛选出3株（C78、a57、A17）高产己酸的兼性厌氧细菌，其产己酸量分别为：213．6914、170．465、103．5097mg／100mL，经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定其分别为：巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）、梭状芽孢杆菌（Bacillusfusiformis）及地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis），相应最适pH值分别为7、6．5、7，最适温度分别为34、34、37℃，最适接种量分别为5％、5％、3％。

【总页数】6页(P177-182)【作者】赵辉;敞颜;王葳;凌宏志;平文祥;赵志昌;杨朝辉【作者单位】黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080／农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨150500；;黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080／农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨150500；;黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080／农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨150500；;黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080／农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨150500；;黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150080／农业微生物技术教育部工程研究中心,黑龙江哈尔滨150500；;黑龙江省富裕老窖酒业有限公司,黑龙江富裕161200;黑龙江省富裕老窖酒业有限公司,黑龙江富裕161200【正文语种】中文【中图分类】Q815【相关文献】1.浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定 [J], 黄治国;卫春会;边名鸿;宗绪岩;罗惠波;郑若欣2.浓香型白酒窖泥中细菌和古菌的组成与多样性 [J], 陶勇;芮俊鹏;李家宝;徐占成;李大平;唐清兰;魏勇;李香真3.浓香型白酒窖泥厌氧细菌的分离鉴定 [J], 王赞;李光辉;罗惠波4.浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定 [J], 岳元媛;张文学;刘霞;胡承;张宿义5.浓香型白酒窖泥中可培养细菌的分离鉴定及产酸研究 [J], 汤斌;王海涛;周庆伍;李安军;万春环;汤有宏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

白酒窖泥新菌种的筛选新方法

Abundance of taxa %
60 50 40 30 20 10 0
低年份窖池
高年份窖池
低年份与高年份窖池窖泥细菌“属”水平分类丰度图
老熟与老化窖泥微生物丰度分析（qPCR）
不同酒厂不同性质窖泥表征微生物的qPCR结果
A值 • 研究成果—窖泥群落结构解析 (qPCR ) 窖泥 copy数拟杆菌门copy 数厚壁菌门酒厂氨基酸杆菌属copy数样品
窖泥微生物的分离培养与筛选
基于传统分离培养技术筛选窖泥中特定微生物菌落
细菌
细菌
霉菌
放线菌
酵母菌
放线菌
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
基于16S rDNA克隆技术、DGGE分析与厌氧培养技术结合。
窖泥特定功能微生物菌种的筛选
采用厌氧培养技术与菌落原位杂交技术（斑点杂交技术）对窖泥中的特征菌Clostridiaceae 1进行分离筛选获得Clostridium kluyveri 14。
常规筛选方法及依据
菌落形态
筛选一般常见菌种
生理生化特征
错判、漏判
复杂环境微生物体系
无法有目的性筛选新菌种
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
• 窖泥潜在新细菌菌种的筛选方法
培养方法
筛选分离纯化
免培养方法
PCR扩增 16S rDNA克隆基因测序 DGGE分析
基于分子生物学技术的窖泥微生物的筛选
窖泥微生态理论及其营养因子对活性窖泥制备的促进
基于免培养技术的窖泥微生物区系的系统研究及大量未培养菌种的发现优势菌、特征菌的分类鉴定及窖泥性状的分子生物学描述免培育技术指导下的功能菌筛选、分类鉴定及窖泥强化应用分子生物学技术

浓香型白酒窖泥厌氧细菌的分离鉴定

浓香型白酒窖泥厌氧细菌的分离鉴定
王赞;李光辉;罗惠波
【期刊名称】《四川理工学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2014(027)001
【摘要】浓香型白酒的生产依赖于窖池,窖池的好坏取决于窖泥微生物,其中厌氧微生物尤为重要.为了认识窖泥厌氧微生物,从浓香型白酒窖泥中分离纯化得到3株厌氧细菌,对其进行菌落观察、镜检和生理生化检测,参照《伯杰细菌鉴定手册》进行初步鉴定并确定其属名.3株厌氧细菌分别为:Lactobacillus(乳杆菌属)、TsukamureUa(束村氏菌属)、Sporolactobacillus(芽孢乳杆菌属).
【总页数】3页(P16-18)
【作者】王赞;李光辉;罗惠波
【作者单位】四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000;四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡643000
【正文语种】中文
【中图分类】Q93
【相关文献】
1.浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定 [J], 赵辉;敞颜;王葳;凌宏志;平文祥;赵志昌;杨朝辉
2.浓香型白酒窖泥中两株细菌的分离鉴定 [J], 黄治国;卫春会;边名鸿;宗绪岩;罗惠
波;郑若欣
3.浓香型白酒窖泥中一株细菌的分离鉴定 [J], 郑若欣;冯治平;宗绪岩;卫春会;黄治国;赵斌
4.浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定 [J], 岳元媛;张文学;刘霞;胡承;张宿义
5.浓香型白酒窖泥中可培养细菌的分离鉴定及产酸研究 [J], 汤斌;王海涛;周庆伍;李安军;万春环;汤有宏
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窖泥检测原理和方法

.窖泥是浓香型大曲酒生产过程中的重要条件之一,它对酒中微量香味成份的形成与其量比关系起着重要的作用.窖泥质量的好坏直接影响浓香型大曲酒产品的质量.取回的泥样〔包括人工培窖的黄泥、发酵泥、复壮泥〕因水分大,不宜长期贮存,应即将平摊在瓷盘、木板,或者光洁地面上,层厚约2cm,风干3~5 昼夜, 间隔翻拌,使之均匀风干.在半干时,将大块土捣碎, 以免彻底干后成硬块,不易粉碎.泥样风干后,用四分法分取约250g,研磨成粉,并通过60 目筛,保存在磨口瓶中.氨态氮在风干过程中易变化,需用新鲜的泥样测定, 同时测定水分, 以换算为绝干样的含.窖泥中水分普通可分为三类, 即化合结合水,吸湿水,和自由水.本法在105- 110℃烘干法, 在此温度下自由水和吸湿水都能烘干,实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量.电热鼓风干燥箱〔烘箱〕；称量皿〔可用滤纸包代替〕；电子天平.〔1〕风干土样水分测定：取风干土样4－5g,平铺于已烘干至恒重的称量皿中.在105 －110℃烘箱内烘6h 后,取出、加盖,在干燥器中冷却30min 后称重,再于100－105℃烘1h,冷却、称重,直至恒重〔两次质量差小于0.002g〕.〔2〕新鲜土样水分测定称取土样10－15g.测定方法同〔1〕.w 一水分和挥发物含量,％；m——烘干前空皿与试样质量之和, g.m l——烘干后空皿与试样质量之和, g.原理因酿酒微生物生长繁殖过程中的生化变化和代谢产物受害泥pH 的影响较大,故在人工培容过程中,必须测定土壤的pH.窖泥经水提取后,用pH 计测定.仪器和试剂〔1〕酸度计：测定X 围pH 0—14,最小分度为0.02pH量〔2〕pH 标准缓冲溶液.测定步骤按仪器说明书校正PH 计,并注意校正和测量时温度一致.将电极和小烧杯用蒸馏水冲洗干净,再塌样品冲洗6－8 次,将电极插入盛有样品的小烧杯中,测量样品的PH.称取风干、粉碎后的土样5.0g,于100mL 烧杯中加水50mL,间歇搅拌30min,放置30min, 用pH 计测定试样pH.原理奈氏试剂与氨反映生成浅黄色至红棕色的络合物.氨态氮浓度低时,溶液成黄色,可在400-425nm 测定吸光度.氨态氮浓度高时,溶液成红色,可在450-500nm 测定吸光度.测得的吸光度与标准比较即可求得氨态氮的浓度.当氨态氮高于1mg/L 时,产生红褐色沉淀,则不能比色.本法测得的氨态氮是游离氨和铵离子含氮的总量,因为铵盐在碱性溶液中将转变为能与奈氏试剂反应的氨.溶液中氨越多,则生成黄色越深.溶液中某些杂质〔Ca、Mg 等离子〕的存在, 能与奈氏试剂形成沉淀,使溶液浑浊干扰氨的测定.为避免此有害作用,故在待测液中加入酒石酸钾钠,可与Ca 、Mg 作用生成不解离的化合物,就可避免与奈氏试剂的相互作用.试剂〔1〕奈氏试剂：称取10g 碘化汞、7g 碘化钾,溶解后加到50mL360g／LNaoH 溶液中,摇匀, 稀释至100mL,摇匀,静置,取上层清液使用.贮存于棕色具胶塞瓶中,可保存1 年.〔2〕酒石酸钠钾溶液：50g 酒石酸钠钾溶于100mL 水中,为驱除酒石酸钠钾中可能存在的铵盐,煮沸蒸发约1／3 体积,冷却后再稀释至100mL.〔3〕氯化铵标准液：准确称取0.3819gNH4Cl,溶于水并定容至100mL.其浓度以N 计为1mg/mL〔4〕氯化铵标准使用液：吸取氯化铵标准液10mL 用水稀释定容至1L.浓度以N 计为10ug／mL,以NH3 计为12.2ug／mL.其余：100g/L 的氯化钠溶液；比色管；纳氏试剂；分光光度计.测定步骤〔1〕试样制备称取新鲜泥样1 —5g<准确至0.01g>,加入100g／L 的氯化钠溶液,使体积为25mL,搅匀,浸出10min<必要时把硬块捣碎>,用于滤纸过滤后备用.吸取1mL 滤液<必要时用水稀释后再吸取>于50mL 比色管中,用水稀释至刻度.加人1—2 滴酒石酸钠钾溶液和1mL 纳氏试剂,充分混匀.放置10min 后以标准系列中"0〞管为空白,于波长425nm 处测吸光度.〔2〕标准系列配制吸取标准使用液<10ug／mL 的氮> 0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL 分别置入50mL 比色管中,用水稀释至刻度后,按试样相同显色、测吸光度. 以吸光度对氨态氮〔N〕微克数绘制标准曲线.或者用目测法进行比较.计算氨态氮<绝干计,mg／100g> ＝c*25*n*<1/m>*<1/1000>*100*[1/<1-w>]式中c ―― 试样溶液中氨态氮质量,ug；25——泥样稀释体积,mL；n——试样再稀释倍数,若再也不稀释,则n=1；m——新鲜泥样质量,g1000——把ug 换算成mg 的系数,w——新鲜泥样水分, ％.原理测定窖泥中有效磷时,采用酸性氟化铵浸提,提出的磷酸或者磷酸盐,在酸性溶液中加入酸性钼酸铵,生成黄色磷钼酸盐,再和还原剂氯化亚锡作用生成蓝色的络合物, 比色测定.试剂〔1〕氟化铵—盐酸溶液：称取0.56g 氟化铵溶于400mL 水中,加人12.5mL 1mol/L HCl 溶液,用水稀释至500mL,贮于塑料瓶中.〔2〕酸性钼酸铵溶液：称取5g 钼酸铵溶于42mL 水中；在另一烧杯中注人8mL 水和82mL 浓盐酸.然后在搅拌下把钥酸铵溶液倒入烧杯中,贮于棕色瓶中.〔3〕氯化亚锡溶液：称取1g 氯化亚锡<SnCl2 ·2H20>溶于40mL 1mol／L HCl 溶液中, 贮于棕色瓶中.〔4〕无磷滤纸：将直径为9cm 的定性滤纸浸于0 ．2mol/LHcl 溶液中4—5h,使磷、砷等化合物溶出,取出后用水冲洗数次,再用0.2mol/L HCl 淋洗数次.最后用水洗至无酸件,在60℃烘箱中干燥.〔5〕磷标谁液：准确称取于110℃干燥2h 后冷却的磷酸二氢钾<KH2PO4> 0.2195g,溶于水,并定容至1L.此溶液含磷为50ug/mL.〔6〕磷标准使用液：准确吸取磷标准溶液25mL 于250mL 容量瓶中,用水稀释至刻度, 其浓度为5ug/mL.测定步骤〔1〕试样处理称取2.00g 风干土样于50mL 烧杯中,加入氯化铵-盐酸溶液至20mL 浸泡30min,每隔5min 搅拌1 次.然后用烘干的无磷滤纸过滤,加入约0. 1g 硼酸,摇匀,使之溶解后备用.〔2〕磷的测定吸取1mL 试样浸出液,注入25mL 容量瓶中,用水稀释至刻度.吸取此稀释液1—2 ．5mL<视磷含量多少而异,普通黄泥含磷少,可直接取浸出滤液测定.窖皮泥磷含量较高,吸取稀释液2 ．5mL 测定.老窖泥含磷量多,吸取1mL 稀释液即可>,于25mL 比色管中, 加入2mL 酸性铜酸铰溶液和3 滴氯化亚锡溶液,用水稀释至刻度.放置15min 后,用2cm 比色皿在680nm 波长处, 以标准系列中"0〞管为空白测定吸光度.〔3〕标准系列制备吸取磷标准使用液0mL 0.5mL、1.0mL 2.0mL、3.0mL、5.0mL, 分别注入25mL 比色管中.加入2mL 酸性相酸铰溶液和3 滴氯化亚锡溶液显色,用水稀释至刻度. 同上条件测定吸光度, 以吸光度为纵坐标,标准液的磷微克数为横坐标,绘制标难曲线.计算有效磷含量<mg／100mg>＝m1*<1/v>*25*20*<1/m>*<1/1000>*100*[1/<1-w>]式中m1 一—试样溶液中有效磷质量,ugv——吸取稀释试样的体积,mL25——稀释试样总体积,mL20——试样浸取液体积,mLm 一风干泥试样质量,gw 一风干试样水分, ％.原理测定有效钾时用碳酸铵将试样中的钙镁沉淀,然后用灼烧法除去铵盐.再在微酸性溶液中用亚硝酸钴钠沉淀钾.生成的亚硝酸钴钾钠的黄色沉淀在酸性溶液中,用过量的高锰酸钾分解, 剩余的高锰酸钾加过量草酸钠除去.多余的草酸钠在用高锰酸钾回滴. 由高锰酸钾与亚硝酸钴钾钠反应的实际消耗量计算试样中的钾含量.试剂①碳酸铵溶液：称取28.5g 碳酸铵溶于水,稀释至1L.②0.01mol／L 硝酸溶液：取6.7mL 浓硝酸用水稀释至1L.再稀释10 倍为0.01mol/L.③200g／L 亚硝酸钴钠溶液：称取10g 亚硝酸钴钠,溶于50mL 水中,临用时配制.④0.01mol／L 硼酸溶液：称取0.6g 硼酸溶于水,稀释至1L.测定步骤①试样处理：准确称取2 ．500g 风干土样于250mL 具塞三角瓶中,加入100mL 碳酸铵溶液, 浸出1h,此间每15min 摇动1 次.然后用1 号烧结玻璃滤器上铺滤纸片抽气过滤,用100mL 钼酸铵溶液分3—4 次洗涤.过滤速度不宜太快, 以使土壤胶体吸附的钾全部置换出来,将浸出液定量移人蒸发皿内,在水浴上蒸于.残渣加3—5mL 硝酸再蒸干,并反复操作3 次,至有机物去净. 蒸干后,在低于500℃的条件下灼烧去除氨,冷却至室温.②钾的沉淀：在灼烧去除氨的试样蒸发皿中,准确加入25mL 0. 1mol/L 硝酸溶液,用带橡皮头的玻璃棒洗皿壁,使残留物溶解并混合均匀.迅速用干滤纸过滤于50mL 三角瓶中,吸取10mL滤液于200mL 烧杯中,边搅拌边徐徐加入10mL 亚硝酸钻钠溶液,盖好表面皿,在20℃放置过夜,使沉淀彻底.用2 号烧结玻璃滤器上铺定量滤纸片<事先烘干至恒重>,抽气过滤,将0.01mol／L 硼酸将杯中沉淀全部移人滤器.再用0.01mol/L 硝酸洗沉淀10 次．每次1mL.接着用95％的乙醇洗5 次,每次2mL.擦干滤器外避,在110℃烘1h,置干燥器中冷却后称重.计算沉淀组成为K2NaCo<Na3>6 ·H2O,其中K2O＝17.216％*0. 17216*<1/10>*25*<1/m>*1000*100*[1/<1-w>]X=m1式中x —绝干试样中有效钾含量<以K20 计〕,mg/100g;一亚硝酸钴钠钾沉淀质量,g;mlm 一风干试样质量,g;10 一一测定时吸取浸出液体积25 一—浸出液总体积,mL；1000－一换算成mg 的系数；w——试样水分, ％.原理样品经灰化后,在酸性溶液中,钙与草酸生成草酸钙,经硫酸溶解后,用高锰酸钾标准溶液滴定,从而计算出钙的含量.反应如下：试剂〔1〕1 ：1 盐酸溶液；〔2〕0. 1%甲基红指示剂；〔3〕1 ：4 乙酸溶液；〔4〕1 ：4 氢氧化铵溶液；〔5〕2N 硫酸溶液；〔6〕4%草酸铵溶液；〔7〕1N 高锰酸钾标准溶液.测定方法〔1〕样品处理：准确称取均匀样品2.00~4.00g,置于坩埚中,在电炉上小火炭化无烟,移入550~600.C 高温炉中灰化,直至灰分呈白色为止〔必要时,可在加入浓硝酸润湿后再灰化,有促进样品灰化至白色的作用〕.取出出,待冷却后加入6N 盐酸溶液20ml,加热溶解灰分,然后用水称入100ml 容量瓶中,辊入至刻度,摇匀.〔2〕样品分析：准确吸取样品溶液5ml,移入15ml 离心管中,加入甲基红指示剂1 滴、4%草酸铵溶液 2ml 、1：4 乙酸溶液 0.5ml,振荡均匀.用 1：4 氢氧化铵溶液将溶液调至微黄色, 再用 1：4 乙酸溶液调至微红色,放置 1 小时,使沉淀彻底析出.离心 15 分钟,小心倾去上层清液, 在沉淀中加入 2ml 2N 硫酸摇匀,置于 70~80.C 热水浴中,用 1 N 高锰酸钾标准溶液进行滴定至淡红色不退色为止.计算式中 N ——高锰酸钾标准溶液的当量浓度；V ——滴定所消耗高锰酸钾标准溶液的量；20—— 1N 高锰酸钾标准溶液 1ml 相当于钙的量；说明用高锰酸钾滴定时要不断振荡使溶液均匀.这方法比较精确,但需要离心沉淀.原理在硫酸存在下,用已知过量的重铬酸钾溶液与窖泥共热,使其中的活性有机质的碳被氧化. 而剩余的重铬酸钾, 以邻菲罗林亚铁为指示剂 ,用硫酸亚铁铵溶液滴定 ,从所消耗的重铬酸钾量来计算有机碳的含量.仪器与试剂〔1〕油浴：加热用油为固体石蜡或者植物油. 〔2〕插试管用的铁丝笼.〔3〕0.2mol/L 硫酸亚铁铵标准溶液〔即莫氏盐溶液〕：称取 80g<NH 4>2So4•FeSO4•6H20,溶于水中,加入 30mL 6mol/L 的硫酸,用水稀释至 1000mL.标定：吸取硫酸亚铁铵溶液 10 mL,于 250mL 三角瓶中,加 50mL 水和 10mL6mol/L 硫酸. 用 0. 1mol ／L 高锰酸钾〔1/5 KMn04 〕标准溶液滴定至粉红色.c —— 硫酸亚铁铵标堆溶液浓度,mol/L ；c 1——高锰酸钾<1/5 KMno 4>标准溶液浓度,mol/L;v 1—— 消耗高锰酸钾标准溶液体积,mL.〔4〕重铬酸钾-硫酸溶液：取 200g 研细的重铬酸钾,溶于 250mL 水中,必要时加热使彻底溶解.冷后稀释至500mL,全部移人 1L 烧杯中.徐徐加入浓硫酸500ML,冷后加水稀释至 1000mL.〔5〕5g/L 邻菲咯啉指示剂：称取 0.5g 硫酸亚铁<FeSO 4 •7H 2O>溶于 100mL 水中,加 2 滴浓硫酸和 0.5g 邻菲咯啉,摇匀,该溶液现配现用. 测定步骤称取风干土样 0.1－0.3g 〔准确至 0.001g 〕,放入 18mm ×160mm 硬质试管中,准确加入重铬酸钾—硫酸溶液 10mL,将试管插人预先加热至 185－190℃的油浴中<用铁丝笼固定试管>. 此时温度下降到 170－180℃,调节热源,保持此温度.当试管内容物被面开始滚动或者有较大气泡发生时,开始计时,沸腾5min.取出冷却后把试管内容物全部转移人250mL 三角瓶,用水洗净.试管,洗液并入三角瓶内,总体积为50 一60mL.摘入2—3 滴邻菲咯啉指示剂,用0.2mol/L 硫酸亚铁铵标准溶液滴定,颜色由橙红变绿,最后呈从紫色为终点. 同时做空白试验.计算x －－干土中腐殖质含量,％；V0—－空白试验消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;v —－测定试样消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;c —－硫酸亚铁铵标准溶液浓度,mol/L;0.003 －一消耗1mL1mol/L 硫酸亚铁铁标;准溶液相当于碳的克数；1.1—－氧化校正系数；1.724—－土壤中有机质含;碳58％,将有机碳换算成有机质的系数<100/58＝1．724>;m 一－风干土试样质量;w 一－风干土水分, ％.仪器显微镜血球计数板.震荡器.其它稀释取量仪器和盛装仪器[方法和步骤]总菌计数法<1>计数样品：称窖泥1g 于盛有99mL 无菌水或者无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中. <2>摇匀；振荡10~20min,使土样中的菌体、芽孢或者孢子均匀分散.<3>稀释：将待测茵液作一定比例的稀释. 〔通常为1 ：100 或者1 ：1000 严格按无菌操作〕<4>检查计数板：在正式计数前先用显微镜检查计数板的计数室,看其是否沾有杂质或者干涸着的曲体,若有污物则需作以下几步清洗：1>擦洗：用药棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数扳的计数室.2>冲洗：用蒸馏水冲洗计数板,并用毛边纸吸干其上的水分<注意：切勿用火焰来烤干>；最后用擦镜纸揩干净.3>镜检：镜检清洗后的计数板,直至计数室无污物时才可用于样品的计数.<5>加样：先将盖玻片安放在计数室上面,然后用接种环取一环均匀的菌体悬液,使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室.连续二至三次,直至充满计数室平台为止：<6>计数：持加好样品的计数板只于显微镜,然后按下列步骤寻觅计数室并计数之1>找计数室：先在低倍镜下寻觅计数极上的慷慨格然后顺慷慨格挪移计数板,使计数室位于视野中间.2>转换高倍镜：转高倍镜后,适当调令光壳度,使菌休和计数室线条均清晰为止,然后将计数室一角的中格移至视野中.3>计数通常以计五个中格<做5 个板求平均减少误差〕的数值来代表计数室中的含菌量.将凡要计数的中格中的菌休逐一计数.计数时为了避重复或者遗漏常将分布在方格线上的菌体一律.以接触方格底线和右侧线上的茵作为计入本格内的茵数. 同时对于出芽的菌体常以芽体和母体同等大小时才按两个茵体计数, 以减少人为计数误差.将计得的菌体数一一记录.<7>清洗：计数完毕后,计数板先用95％酒精轻轻擦洗,再用蒸馏水淋洗,然后吸干.[计算]按所用计数板规格16*25 型或者25*16 型有所不同.菌数/mL=X*16 〔或者25〕*10000*稀释倍数<X 为5 个中室的平均数〕再按制得的样品总量而求得总菌数总数=菌数/mL*样品量〔mL>原理根据芽孢可在广泛的温度〔即热抗性〕、pH、渗透压下生长特点,对窖泥中芽孢进行分离和检测的.首先通过升温〔80－100℃〕热处理〔10~30min〕来除去非检测菌.这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活,而芽孢可以在适宜的培养基中萌芽并生长.仪器与试剂〔1〕传统的微生物检测方法需在培养基中把单个菌培养成可见菌落,然后经长期培养和鉴定.目前乳品厂对芽孢杆菌的检测是根据芽孢可在广泛的温度<即热抗性> 、pH、渗透压下生长特点,对乳和乳制品中芽孢进行分离和检测的.首先通过升温<80- 100~C>热处理<10~ 30Inin>来除去非检测菌.这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活.通过这种方式激活的芽孢再在适宜的培养基中萌芽并生长.传统上这种培养基加淀粉以吸收抑制物<乳中大多芽孢杆菌<86％>能水解淀粉,从而促进激活的芽孢萌芽.培养基再在30℃培养3d 或者37℃2d 计嗜温菌数,55℃ 2-3d 计嗜热菌数.这种传统方法操做繁琐, 时间长72h,并需对操作人员进行严格的训练.检测结果存在滞后性, 已难适应工化生产.。