微生物限度检查方法及其验证报告(修改)
《中国药典》微生物限度检查法及其方法学验证
微生 物 限 度 检 查 法 是 检 查 非 规 定 灭 菌 制 剂 及 其 原 、 料 受 微 生 物 污染 程 度 的 方 法 ， 查 项 目包 括 细 菌 辅 检 数 、 菌 数 、 母 菌数 及 控 制菌 检查 。与 《 国药 典 》 霉 酵 中
２０ ０ ０年 版 （ 下 简 称 ２ ０ 以 ０ ０版 ） 比 ，０ ５版 微 生 物 限 度 相 ２０ 检 查 法 在 以 下 几 方 面 进 行 了增 修 订 。 １ 标准的制订原则 ：
２ 标 准的分类 ：
微 生物 试 验 的 结 果 易 受 试 验 条 件 的 影 响 ， 别 是 特
药 品 中 含 有 对 微 生 物 生 长 有 抑 制 作 用 组 分 时 表 现 较 为 突 出。 因 此 ， 进 行 微 生 物 限 度 检 查 时 ， 保 证 在 检 验 在 应 条 件 下 的样 品 浓 度 不 足 以抑 制 污 染 微 生 物 的 生 长 ， 以 保 证结 果 的 准 确 性 。所 以 任何 产 品 的 微 生 物 限 度 检 查 法 均需 验 证 ， 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 样 品 的 微 生 物 确 限 度 检 查 ， 可 使 用 。为 此 ，０５年 版 ＜ 国药 典》 录 方 ２０ 中 附
维普资讯
２ ０ 年 ６月 ０８
《 国 药 典 》 生 物 限 度 检 查 法 及 其 方 法 学 验 证 中 做
６ ５
《 国药 典》 生 物 限度 检 查 法及 其 方 法 学 验 证 中 微
肖庆 青
（ 西 省 医药 学 校 江西 南 昌 ３００ ） 江 ３２０
中 的微 生 物 限 度 Fra bibliotek 查 法 增 加 了方 法 验 证 试 验 的要 求 。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史..目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊;产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查..参照中国药典2015版四部附录1105：微生物计数法;以及1106：控制菌检查法的规定;本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证..通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用..人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分;文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性;对霉菌和酵母菌无抑菌活性..甲硝唑在水中微溶;可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响..本验证方案通过试验菌株的回收率测试;首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用;则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查..本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件;按制定的方法进行试验;根据验证结果判断是否符合验证标准..2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性;对其有效性进行评价;保证检验结果的可靠性..本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊;进行微生物限度检查方法的验证..3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草;由质量部审核;最终由质量负责人批准..验证方案实施完成后;由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告;由质量部审核;最终由质量负责人批准报告..3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后;;由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作;并将该次的培训记录归档..3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差;质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施..3.4 验证工作小组成员表4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月..5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认5.1.主要检验仪器设备确认表检查人/日期：复核人/日期：5.2.验证所需文件的确认表检查人/日期：复核人/日期：6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表检查人/日期：复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查检查人/日期：复核人/日期：6.3.检验样品确认表检查人/日期：复核人/日期：7.验证项目和验证方法7.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml沙氏葡萄糖液体培养基中;20～25℃培养2～3天;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上;20～25℃培养5～7天;直到获得丰富的孢子..加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液;将孢子洗脱;吸至无菌试管中;取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/m的孢子悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ;在验证过的贮存期内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.3.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液..7.3.2.试验组取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养5天;点计菌落数..另取1：10的供试液1ml注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置30～35℃培养箱中培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml和7.2项下制备的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉;分别注入平皿中;立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml混匀;每株试验菌株平行制备2个平皿..置20～25℃培养箱中培养5天;点计菌落数..常规倾注平皿法方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内..常规倾注平皿法方法验证的结果常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：5天试验人/日期：复核人/日期：常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查..如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查;但不适用于需氧菌总数检查;则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查..7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法7.4.1.供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心3分钟;取上清液得供试液..7.4.2.试验组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.3.供试品对照组取供试液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养5天;点计菌落数..7.4.4.菌液对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;200ml通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu的试验菌;过滤..每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..稀释剂对照组依照7.2项下菌液制备方法;以0.9%无菌氯化钠为稀释液;将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次;每株试验菌株平行制备2张滤膜..取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上;30～35℃倒置培养3天金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌;或培养5天白色念珠菌、黑曲霉;点计菌落数..7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值即试验菌的回收率应在0 .5 2 范围内;同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5 2 范围内..7.4.7.离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号：培养箱型号编号；培养温度：；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌3天;白色念珠菌、黑曲霉5天试验人/日期：复核人/日期：7.4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内;稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数..7.5.控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中;证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性;不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查;则为了确保控制菌检查的可靠性;采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查;按照以下方案进行方法学验证..7.5.1试验菌株人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌;所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证..试验菌株的传代次数不得超过5代;并采用适宜的菌种保藏技术进行保存;以保证试验菌株的生物学特性..7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中;30～35℃培养18～24小时;取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml;采用10倍递增稀释法;稀释至10-5～10-7;制成50～100cfu/ml的菌悬液备用..菌液制备后若在室温下放置;应在2 小时内使用；若保存在2～8℃;可在24小时内使用..验证时;对各试验菌的回收率逐一进行验证..7.5.3大肠埃希菌检查方法验证供试液的制备取供试品10g;加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml;振摇;制成1：10的供试液贮备液..取1:10的供试液贮备液50ml;经500转/分钟离心4分钟;取上清液得供试液..取供试液10ml;加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次;然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的大肠埃希菌;过滤..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中;42～44℃培养24～48小时..取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～72小时..麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长..取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:大肠埃希菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：大肠埃希菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查..菌检查方法验证7.5.4.1供试液的制备取样品10g加0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液..取全部供试液经500转/分钟离心4分钟;取全部上清液为供试液..7.5.4.2.试验组取全部供试液;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次100ml/次..然后在第3次冲洗液100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入～100cfu的乙型副伤寒沙门菌;过滤..取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时.. 7.5.4.3阳性对照组～100cfu/ml;然后以500转/分钟离心3分钟;取上层菌液作下面的试验..取上层菌液1 ml;加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中;混匀;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次100ml/次..取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..取上述增菌培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基;30～35℃培养18～24小时..取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上;30～35℃培养18～48小时..沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好;菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色..用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落;于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种;培养18～24小时..7.5.4.4阴性对照组取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml;全量通过薄膜孔径0.45μm混合纤维素膜后;取膜接种至200ml胰酪大豆胨液体培养基中;混匀;30～35℃培养18～24小时..阴性对照应无菌生长..7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:乙型副伤寒沙门菌对照菌来源批号菌种编号试验人/日期：复核人/日期：7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结按照验证方案的要求进行试验;若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌;阴性对照组无菌生长;则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查..人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查..8.偏差与漏项控制：微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项;都应进行详细的记录;并应按公司GMP文件偏差处理规程进行调查与处理..偏差调查与处理的报告和支持文件;应作为此确认方案的附录部分..检查人/日期：复核人/日期：9.验证报告会审验证报告会审表。
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物限度检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物限度检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法（薄膜过滤法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
微生物限度方法验证报告范文
微生物限度方法验证报告范文下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
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琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
微生物限度检查法验证方案(修订版)
审批及颁发：会审：分发：一、目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
二、范围本公司注射用水及纯化水的微生物限度检查。
三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1概述：按照中国药典2010版（第二部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，验证所采用的方法和条件适合于供试品的微生物限度检查。
2验证项目3 验证时间安排3.1 2013年04月01日至 2013 年04月05日制订、审核及批准验证方案；3.2 2013年04月06日至 2013 年04月 15日实施验证3.3 2013年04月16日至 2013年04月 20日写出验证报告4 验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 验证人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认结论:检查人/日期：复核人/日期：4.3菌液制备4.3.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20～25℃培养24～48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100CFU的菌悬液。
4.3.2接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子溶液。
4.4培养基及稀释液与供试液4.4.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌，即得。
中国药典微生物限度检查方法验证方案
中国药典微生物限度检查方法验证方案一、引言药品的质量与安全性是保障患者用药安全的重要方面。
微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，用于评价药品中微生物的污染情况。
为确保检测结果的准确性和可靠性，本文旨在制定中国药典微生物限度检查方法验证方案。
二、背景微生物限度检查方法验证是指确定某一方法在特定条件下的适用性，方法验证的结果直接影响到药品生产和品质控制。
为了保证方法验证的可靠性，必须按照一定的规范和要求进行操作。
三、验证目的验证中国药典中所规定的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性，以确保药品的微生物限度符合国家及相关法规的要求。
四、验证程序1. 确定验证方法：根据中国药典中规定的微生物限度检查方法，选择合适的验证样品和验证条件。
2. 准备验证样品：从实际生产过程中随机选取药品样品，确保样品的代表性。
3. 执行验证实验：按照中国药典中的方法操作，对验证样品进行微生物限度检查。
4. 数据分析和评估：根据验证实验的结果，进行数据分析和评估，评估方法的准确性和可靠性。
5. 结果判定：根据数据评估结果，对微生物限度检查方法进行判定，判断方法是否适用于实际生产中的微生物限度检查。
6. 验证报告编制：根据验证实验的结果和结论，编制验证报告。
五、验证内容本次验证主要包括如下内容：1. 对选择的验证样品进行微生物限度检查。
2. 对验证样品进行菌落计数。
3. 对验证样品进行培养方法的验证。
4. 对不同微生物种类的检查方法进行验证。
5. 对不同微生物菌株的适应性进行验证。
六、风险评估在验证过程中，存在一定的风险因素，需进行风险评估，确保验证结果的可靠性和准确性。
风险评估主要包括验证样品来源的可靠性、实验操作的准确性、验证条件的合理性等。
七、验证结果与讨论根据验证实验的结果和数据分析，可以得出下列结论：1. 所验证的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性较高。
2. 所验证的微生物限度检查方法适用于不同药品制剂类型的微生物限度检查。
微生物限度检验方法验证报告
微生物限度检查检验方法验证报告
方案编制年月日方案审核年月日方案批准年月日
上海美宝生命科技有限公司
7
7.1试验样品
确认人：日期：
7.2 产品试验组微生物生长情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.3 供试品对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.4 稀释剂对照组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：7.5 菌液组微生物生长检查情况：批号：
检验人：日期：复核人：日期：
7.6稀释剂对照组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：7.7 试验组菌回收率计算
检验人：日期：复核人：日期：
7.8 结果说明
经过验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分别为： %、 %、 %、 %、 %。
稀释剂回收率为： %、 %、 %、 %、 %。
7.9 结论
以上验证结果证明，本品（适合/不适合）采用上述方法进行微生物限度检查。
附录。
微生物限度方法学验证完整版
微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。
二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。
（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。
（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。
（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。
上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。
2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。
用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)
微生物限度检查方法及其验证报告记录(修改)————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息1.1 基本信息（三批）品名多烯酸乙酯软胶囊或蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸规格0.25g/粒，30粒/瓶或0.3g/粒，30粒/瓶批号2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备仪器名称型号编号培养箱HH·BⅡ·360ZL-025 MJX-150ZL-042 SPX-150B ZL-046 JJ-5 ZL-026电子天平JY1001 ZL-013超净工作台JH-DCB ZL-028生物安全柜BSC-1100ⅡA2ZL-0292.2 试验用培养基2.2.1 对照培养基培养基名称批号生产厂家胰酪大豆胨琼脂培养基中国食品药品检定研究院胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.2.2 试验用培养基培养基名称配制批号胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基RV沙门增菌液体培养基2.3 试验用试剂试剂名称配制批号含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液0.9%氯化钠1%红四氮唑2.4 试验用菌种菌种名称菌种编号工作用菌种批号及代数信息大肠埃希菌CMCC（B）44 102 E3-02枯草芽孢杆菌CMCC（B）63 501 E3-02金黄色葡糖球菌CMCC（B）26 003 E3-02乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094 E3-02 白色念珠菌CMCC（F）98 001 E3-02黑曲霉CMCC（F）98 003 E3-023 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
微生物限度检查法及其方法学验证
微生物限度检查法及其方法学验证摘要：本文从四个方面介绍2005版微生物限度检查法增修订内容，重点介绍细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的方法验证，提请申报单位注意在后续品种的研发和申报过程中对所采用的微生物限度检查法进行方法学验证，以增加试验方法的完整性、保证检验结果的可靠性。
关键词：微生物限度检查法方法学验证【中图分类号】r-3【文献标识码】b【文章编号】1008-1879（2012）12-0395-01微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查，与2000版相比，2005版微生物限度检查法在以下几方面进行了增修订。
1标准的制订原则2000版微生物限度法标准细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订，控制菌按给药途径制订。
由于同一剂型有不同的给药途径，且随着新剂型的不断出现，按剂型制订标准具有局限性。
2005版均按给药途径制订，解决了这一局限性，不会因剂型的改变而带来执行标准的混乱。
2标准的分类分为三大类，即制剂通则项下规定；口服给药制剂；局部给药制剂，其中化学药部分（二部）包括：①制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂、局部给药制剂：眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。
中药部分（一部）包括：①制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂；②口服给药制剂：不含药材原粉的制剂；含药材原粉的制剂；含豆豉、神曲等发酵成分的制剂；③局部给药制剂：用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂；用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂；眼部给药制剂；耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂；阴道、尿道给药制剂；直肠给药制剂；其他局部给药制剂。
3微生物限度检查方法的增修订3.1明确了环境检测执行的标准和方法，洁净度要求及洁净度定期检查。
3.2检验量。
中国药典2019年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介
菌名
分类
芽孢
对氧需求
铜绿假单胞菌 革兰氏阴性杆菌
无芽孢 需氧
枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性杆菌
有芽孢 需氧
金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性球菌
无芽孢 需氧
大肠埃希菌
革兰氏阴性短杆菌 无芽孢 需氧
生孢梭菌
梭菌
有芽孢 厌氧
2019年8月
17
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
2019年8月
19
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，23~28℃培养5～7天，加入3～ 5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然 后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉 花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无 菌试管内，用0.9％无菌氧化钠溶液制成每 lml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2019年8月
15
无菌检查验证用菌株：
金黄色葡萄萄球菌 (Staphylococcus aureus) [CMCC(B) 26 003]
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10 104] **拟修订为大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) [CMCC(B) 63 501]
2019年8月
35
举例说明上市抽验样品无菌检查方法学验证检验量（液 体制剂）
≤1ml
每个菌10支,共60支（全取样）
1＜V＜5 共30（取样量为半量）
5≤V＜20 建议30（取样量为2ml，建议全部过滤）
20≤V＜50 建议30（取样量为5ml，建议全部过滤）
新版GMP微生物限度检查法验证报告
*******微生物限度检查法验证报告文件编号：VMP-VV-502REP-00起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的及范围确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该品种药品的微生物限度检查，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
本次验证为试验组和对照组的菌回收率试验；控制菌检验方法的灵敏性、检出率及专属性试验。
3.验证风险评估对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：4.验证前准备4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容5.1测试环境条件要求所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2试验样品*******批号：；规格：）5.3验证用菌种及培养基：5.3.1来源：食品药品检验所5.3.2菌落计数用菌种注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.3.3培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
5.4细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：按照中国药典2010年版微生物限度检查法中的平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。
3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。
5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。
验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。
适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。
6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。
具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
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文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录1 样品相关信息1.1 基本信息2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境3.1 无菌室3.2 洁净工作台3.3 生物安全柜4 试验方案4.1 验证试验目的4.2 微生物限度检查方法草案5 方法验证试验5.1 菌液制备5.2 计数培养基适用性检查5.3 控制菌检查用培养基使用性检查5.4 供试液制备5.5 方法验证5.5.1 菌落计数方法验证试验5.5.2 控制菌检查方法的验证5.6 方法验证结论6 供试品微生物限度检查结果1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批）2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备2.2试验用培养基 2.2.1 对照培养基2.2.2 试验用培养基2.3 试验用试剂2.4 试验用菌种3 试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。
3.1 无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。
3.2 超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录2015.11.153.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录2015.11.154 试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
4.1 验证试验目的确认所采用的方法适合于本品的微生物限度检查。
即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。
保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
4.2 微生物限度检查方案对三批产品进行3次独立的平行试验。
取本品10g，加含1%聚山梨酯80 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：100的供试液。
微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1106）。
5 方法验证试验对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行验证。
5.1 菌液制备（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天。
上述培养物用H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3ml 0.05%聚山梨酯80的H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
5.2 计数培养基适用性检查（实验时间：2015.11.15～11.21）取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml （小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养3～5天，计数；取上述制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养5～7天，计数；同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
试验结果如表1：5.3 控制菌检查用培养基适用性检查（实验时间：2015.11.15～11.21）5.3.1 控制菌（大肠埃希菌）检查用培养基适用性检查麦康凯液体培养基促生长能力和抑制能力检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌于被检培养基和对照培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。
接种不少于100cfu的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培养基中，在42～44℃培养24～48小时，结果见表2。
麦康凯琼脂培养基促生长能力和指示特性检查：接种不大于100cfu的大肠埃希菌与被检培养基和对照培养基中，在30～35℃培养18～72小时，结果见表2。
表2 控制菌检查用培养基适用性检查结果5.4 供试液制备（实验时间：2015.11.15～11.21）取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
取1：10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：100的供试液。
5.5 方法验证（实验时间：2015.11.15～11.21）5.5.1 菌落计数方法验证试验（1）菌液组：分别取菌液1ml，采用平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表3。
（2）供试品对照组：取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底的需氧菌总数，测定结果见表4。
取1：10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定结果见表4.（3）试验组：取1：10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml（小于100cfu试验菌）分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
另取1：10的供试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（不大于100cfu试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
（4）稀释剂对照组：取1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定结果见表7。
上述已注入供试液的平皿（其中试验组在注入供试液和控制菌菌液后应立即倾注培养基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养3～5天逐日观察结果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，待凝固后，置20～25℃培养5～7天逐日观察结果。
经上述实验验证，采用上述方法方案进行本品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数可使用回收率达到要求。
5.5.2 控制菌检查方法的验证（实验时间：2015.11.15~11.21）5.5.2.1 菌液制备接种大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml胰酪大豆胨液体培养基中，33℃培养24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu~100cfu菌悬液。
5.5.5.2大肠埃希菌检查方法的验证（1）供试品组：取1：10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml 中，置33℃培养24小时。
（2）阴性对照组：取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培养基100ml中，置33℃培养24小时。
（3）取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，置43℃培养24小时，观察结果，见表7。
表8 大肠埃希菌检查结果表8结果显示，表明本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。
说明采用该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。
5.6 方法验证结论上述验证试验结果证明，非无菌产品微生物限度检查方法方案可行。
依据验证结果，制定非无菌产品微生物限度检查方法如下：微生物限度取本品10g，加含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，使供试品分散均匀，制成1：10的供试液。
必要时，取1：10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml 中，即为1：100的供试液。
需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1：10的供试液1ml，注皿，微生物计数法，取1：10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1105）；控制菌检查法，取1：10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培养基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部通则1106）。
1g供试品中，需氧菌总数不得过100cfu，霉菌和酵母菌总数不得过10cfu；不得检出大肠埃希菌。
6 供试品微生物限度检查结果按照上述确定的非无菌产品微生物限度检查方法检验三批供试品，结果符合规定，结果见下表。
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