酶与细胞的固定化技术
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
细胞固定化技术在制药中的应用
细胞固定化技术在制药中的应用一、细胞固定化技术概述细胞固定化技术是一种将细胞或酶固定于载体上，形成特定的固定化系统从而实现催化功能或合成生产的技术。
细胞固定化技术已广泛应用于制药、食品、环保等领域。
细胞固定化的优点是可以提高酶或细胞的稳定性、耐受性和催化效率，同时降低运行成本。
二、制药中细胞固定化技术的应用1. 生物合成在生物制药领域，利用细胞固定化技术可使细胞在生长和代谢过程中维持长期稳定性，提高生产效率。
例如，利用固定化细胞生产生长激素和转化因子，可以降低成本，提高产量。
同样的，利用固定化细胞合成青霉素和链霉素等抗生素，也可以提高收率和稳定性。
2. 药物代谢性能研究细胞固定化技术可用于药物代谢性能研究。
利用细胞固定化技术，可以建立高效、可靠的药物代谢酶模型，对药物代谢途径进行分析和评价。
同时，还可应用于对药物的毒理学研究。
3. 肿瘤治疗利用细胞固定化技术生产肿瘤治疗药物，可以提高抗肿瘤药物的疗效和耐受性，降低副作用和毒性。
如，固定化细胞生产的细胞毒素可靶向肿瘤细胞并杀死它们，对治疗肿瘤有较好的效果。
三、各种细胞固定化技术的优缺点1. 滴定法利用滴定法将细胞悬浮液滴入凝胶中，使其逐渐凝固形成固定化细胞。
这种方法操作简单，成本低，适用于规模较小的生产。
但是，凝胶的阻力大，不利于氧气和营养物质的进出。
2. 包埋法将细胞直接包埋于凝胶中，形成固定化细胞。
这样可以保护细胞，但凝胶的成分和物理性质很难保证一致性，因此制备工作量大，也不利于细胞的氧气和营养物质的进出。
3. 真空降温法将细胞或酶悬浮液置于低温真空中冷冻干燥，然后用特殊处理的沸石或陶粒等介质在常温下进行固定化。
真空降温法可以保留细胞活力，可以大量生产，适合规模化生产。
但是，操作比较复杂且需要特殊的设备和介质。
4. 细胞外固定化法利用聚合物和载体具有催化能力（如陶瓷、金属等）对细胞或酶进行固定化。
细胞外固定化可提高稳定性和耐受性，但是具体的固定化效率与固定化材料的选择和制备有关。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术，在制药、化工、食品等领域广泛应用。
酶是一种天然催化剂，在一系列生化反应中起到了至关重要的作用。
然而，酶在传统的反应过程中通常难以重复利用，并且容易受到环境因素的影响导致其活性降低。
为了克服这些困难，研究人员发明了酶固定化技术，即将酶固定在固体基质上，从而提高其稳定性和功效。
使用固定化酶，可以在更广泛的工业应用场景中实现更高效、经济的生物转化过程。
固定化技术不仅可以应用于酶，还可以用于固定化细胞。
细胞固定化是将细胞固定在一种固定化基质上，以便在化工过程中重复使用。
固定化细胞繁殖能力更强，可稳定持续的提供所需生产物。
比如，用固定化酵母发酵葡萄汁制成果酒或啤酒。
固定化技术的实现方式有很多种，例如物理吸附、共价键结合、交联等。
其中最常见的方法是交联法，通过交联剂，如谷氨酸或戊二醛，将酶或细胞固定在载体上。
经过固定处理后，酶或细胞的增稳特性明显增强，同时也具有更广泛的适应性。
在化学反应中，固定化酶可用于一系列生产过程，包括生成和破坏多种化学键以及催化合成。
这种方法还可以改善化学反应的选择性和增加产物的纯度。
总之，酶及细胞固定化技术已成为现代生物工程的重要组成部分，它为生产高品质、低成本的化学品、食品、医药品以及可再生能源等提供了新的可能性。
由于固定化技术的成熟和发展，它在未来的研究和应用中将会得到越来越广泛的应用。
固定化酶和固定化细胞技术
张 海 龙山东教育学院 生物系Shan Dong Institute of Education第九章 第九章 固固定化酶与固定化细胞技术第一节固定化酶•固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。
•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的特点（与游离酶相比）•（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化；•（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化；•（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性；•（4）酶的反应过程能够严格控制；•（5）酶的利用率提高，生产成本降低；•（6）能够进行多酶反应；•（7）可以增加产物收率，提高产物的质量；•（8）增加了生产的成本；•（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。
一、固定化酶的制备方法•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则：–（1）必须维持酶的催化活性以及专一性；–（2）有利于实现连续化和自动化；–（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量；–（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用；–（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应；–（6）成本要低，以便于工业使用；实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。
•（一）包埋法：–1、网格型–2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•（二）吸附法：–1、物理吸附法–2、离子吸附法•（三）、共价偶联法•（四）、交联法•（五）、共价结合法–1、结晶法–2、分散法酶固定化方法示意图二、固定化酶的性质1、稳定性2、最适温度最适pH pH3、最适4、底物特异性go稳定性比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度2040608010030405060708090Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A BA 固定化酶B 游离酶稳定性(续)（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂）对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高..(back back))最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，5-10℃;比游离酶高比游离酶高5-105-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为30 ℃同一种酶;80 ℃，比固定化前提高了，比固定化前提高了30用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60烷基化法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离最适温度最适温度((℃ ） 方法载体载体最适pH 值酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响带负电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH 的影响原因:吸引作用带正电荷的载体，固定化酶最适pH 值比游离酶的低H +H +H +H +H +H +H +偏酸微环境OH -OH -OH -OH -OH -OH -H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体，固定化酶最适pH 值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因::载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等;;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术，广泛应用于工业生产和科学研究领域。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的基本概念、原理、应用和优点。
酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在载体上的技术。
这个过程可以使酶或细胞稳定地固定在载体表面，从而使其在生物反应中更加稳定。
酶及细胞固定化技术的原理主要是基于载体对固定的酶或细胞的物理和化学作用。
载体通常是多孔性或具有大的表面积和高的表面活性的材料。
酶或细胞会均匀地分布在载体表面，构成一种固体反应体系。
这种反应体系可以通过化学交联、物理吸附或共价连接等方式将酶或细胞稳定地固定在载体表面上。
酶及细胞固定化技术在工业生产和科学研究中有广泛的应用。
其应用领域包括：
（1）生物反应器的设计和制造
（2）医药制造过程中的酶催化合成
（3）食品工业中的酶床反应器
（4）环境保护和废水处理等领域
相对于自由酶和细胞，酶及细胞固定化技术具有很多优点，如下：
（1）酶及细胞固定化技术可以提高催化效率和稳定性。
（3）酶及细胞固定化技术可以对废水处理、空气污染、环境清洁等方面产生积极作用。
综合以上几点，可以得出酶及细胞固定化技术在生产与研究中起到的作用无可替代，将会成为未来重要领域。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术方法，广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
通过这种技术，酶或细胞被固定在一种固体材料上，从而增强了它们的稳定性和重复使用性，提高了生产效率和产品质量。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、优势以及在不同领域的应用情况。
酶及细胞固定化技术的原理主要是通过将酶或细胞固定在一种固定载体上，使其能够稳定地存在于一定的环境中并保持其生物活性。
固定载体一般是多孔性的固体材料，如珠状树脂、活性炭、聚合物材料等。
在固定化过程中，酶或细胞通常会与载体表面发生物理或化学结合，从而实现固定化。
固定化后的酶或细胞能够在一定条件下发挥作用，实现对底物的转化或反应。
二、酶及细胞固定化技术的优势相较于游离态的酶或细胞，在固定化状态下具有以下优势：1.稳定性高：固定化后的酶或细胞能够更好地耐受环境变化，如温度、pH值等变化，从而提高其稳定性和长期使用的能力。
2.重复使用性强：固定化后的酶或细胞能够被多次使用，降低了成本，提高了生产效率。
3.易于分离：固定化后的酶或细胞与反应物之间的分离更加便利，便于后续操作和产品纯化。
4.改善环境适应性：固定化后的酶或细胞对不同环境条件的适应能力更强，可在复杂环境中发挥作用，适用范围更广。
5.抑制酶或细胞的不良反应：在固定化状态下，酶或细胞的不良反应如自身降解被抑制，更加稳定可靠。
酶及细胞固定化技术在食品工业中得到了广泛应用。
一些发酵产品的生产过程中，固定化酶或细胞能够提高发酵效率、缩短发酵周期，并且保证产品的稳定性和质量。
在乳制品工业中，利用固定化乳酸菌进行发酵能够保持产品的风味和质量，并且加速乳酸发酵的速度，提高了生产效率。
固定化酶还可以应用于酶解工艺，如利用固定化酶对淀粉、蛋白质等进行水解，得到高质量的发酵原料。
固定化技术还可以用于改善食品加工过程中的废水处理，通过固定化细胞去除废水中的有机物和重金属离子，净化废水，达到环保的目的。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
酶与细胞的固定化技术 (2)
酶的固定化方法
固定化方法
吸附法
结合法
交联法
包埋法
离子键 结合法
共价键 结合法
网格型
微囊型
1、吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含 酶菌体吸附在其表面上，而使酶固
定化的方法。
常用的固体吸附剂有活性炭、 氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔
玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引 起酶变性失活，载体廉价易得，而 且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力 较弱，酶与载体结合不牢固而容易 脱落，所以使用受到一定的限制。
第一个工业化的固定化酶：
DEAE-Sephadex A-50
固定化氨基酰化酶
共价结合法（covalent binding or covalent coupling） 借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
使载体活化的方法很多，主要
的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰
法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻
易脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶
的空间构象而影响酶的催化活性。
3、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。 常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。 戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。 交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。 交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。 但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶 活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小， 给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用， 以取长补短。
酶与细胞的固定化
（二）包埋法
原理
– 将酶包埋于格子(Lattice)内，格子的结构可以防止蛋白质 渗出于周围基质中，但是底物仍能渗入格子内与酶相接 触
优缺点
– 优点：酶分子本身不参加水不溶性格子的形成、方法较 为简便、酶分子未受到化学作用、活力较高
– 缺点：不适用于大分子底物
根据使用包埋剂分类
– 聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法、 大豆蛋白质包埋法、微囊法等
– 利用聚丙烯酰胺凝胶或胶原膜包埋谷氨酸棒杆菌，用分批法或装柱 法连续由葡萄糖合成
L-苹果酸
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌
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（五）生产 a-淀粉酶
方法
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋枯草杆菌
特点
– 凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长
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二、固定化技术需要考虑的重要因素
本征速率和动力学参数
– 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶、骨胶原、海藻酸钙 凝胶，K-角叉菜聚糖等
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常用包埋剂的优缺点
K-角叉菜聚糖
– 制法简单，机械强度好，稳定性高，不影响细胞的代谢 活力
– 国内来源困难
海藻酸钙
– 钙离子容易被培养基中的磷酸根离子夺走而使凝胶解体
聚丙烯酰胺凝胶
– 孔径控制容易，机械强度好，富有弹性，细胞的活性高
抗生素
– 利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽， 比传统发酵法（用淀粉-肉汤培养基）优越
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（三）生产酒精和啤酒
酒精
– 传统酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂， 操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用 – 应用固定化细胞进行连续发酵后，酒精发酵时间 由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力 每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L – 细菌固定化的研究也颇为活跃
生化技术固定化酶及微生物
●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数 酶经固定化以后， Vm 变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异 的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同； 但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只 相当于游离酶的1/10。
固定化酶稳定性提高的原因可能是： ➢带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间 构象起到稳定作用 ➢蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生 ➢固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机 溶剂等对酶的进攻破坏作用
（四）米氏常数
●米氏常数（K m ）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的K m 值，其倒数1/ K m 称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定 化酶的K m 值和最大反应速度（Vm ）常因酶蛋白结构的变化和载体带电 荷的影响而变化。
缺点：这种固定化酶制品只能应用于底物和产物的分子质量都小的反 应中
四、固定化微生物的制备
目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法， 其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性 热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温 度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性 而使酶固定与细胞内的方法
此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六 甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定 化酶
3、包埋法
定义： 就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高 分子半透膜中制成固定化酶的方法
分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型
优点：由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变 化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应 用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单
第三章 酶和细胞的固定化技术及其应用
固定化酶的活性 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降 原因： 原因： 酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 空间位阻影响底物与酶的定位作用。 外扩散和内扩散阻力影响底物与酶的接触。 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定性增 加。
共价结合法由于反应剧烈，最容易改变酶蛋白构象，对酶 活性影响很大。 载体材料可通过影响反应组分的分配效果而改变固定化酶 的反应活性。 提高搅拌速度、加快流体流动可以改善外扩散限制。
常用固定化材料
无机材料 碳酸钙 氧化铝 活性炭
有机材料 聚乙烯醇 聚乙烯 尼龙
生物材料 纤维素 葡聚糖 海藻酸盐
新型固定化载体
纳米材料
磁性微球
等离子体材料
固定化方法
酶的固定化方法主要可分为五类：吸附法、包埋法、 微囊法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合 法又可统称为载体结合法。
吸附法
细胞固定化
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化 技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 一般采用对细胞伤害较小的吸附法和包埋法。 特点： 特点： 密度大、可增殖。 提高生产能力，缩短发酵周期。 稳定性高，可反复利用。 有利于产品分离纯化。
吸附法固定细胞
采用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定 化的方法称为吸附法。 吸附法是细胞固定化中使用最广泛的方法。
载体和固定化方法
Байду номын сангаас
固定化酶性质
目标要求、反应器特点、 目标要求、反应器特点、各部分特性
载体选择的原则
必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催 化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性 中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状 态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构 成活性中心的氨基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在某种材料上，以便进行特定反应的技术。
这种技术可以有效地提高反应速率、稳定性和重复使用性，广泛应用于生物技术、食品工业、环境保护和医药领域。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、应用和未来发展方向。
酶及细胞固定化技术的关键在于将酶或细胞固定在一种载体上，以便进行特定反应。
常用的载体材料包括天然材料如海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇等，以及合成材料如聚丙烯酸酯、氧化硅、氨基硅烷等。
通过交联、吸附、包埋等方法，将酶或细胞与载体结合在一起，形成固定化的酶或细胞系统。
固定化技术的主要优点在于可以提高酶或细胞的稳定性和重复使用性。
通过固定在载体上，酶或细胞可以更好地抵抗外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等。
固定化的酶或细胞可以通过简单的分离和回收，实现反应产物的纯化和酶的再利用。
二、酶及细胞固定化技术的应用酶及细胞固定化技术在生物技术、食品工业、环境保护和医药领域有着广泛的应用。
1. 生物技术领域在生物技术领域，酶及细胞固定化技术被用于生产化学品、药物和生物燃料。
以葡萄糖氧化酶为例，固定化的葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖检测、生物传感器以及生物燃料电池中。
固定化的工程酶也被用于合成生物材料、精细化学品和医药中间体，以实现高效、环保的生产过程。
2. 食品工业领域在食品工业领域，酶及细胞固定化技术被用于食品加工、酿造和酶制剂制备。
在酿造过程中，固定化的酵母细胞可以实现连续发酵，提高酒精产率和控制发酵过程。
而在食品加工中，固定化的酶可以用于降解醣类、蛋白质和脂肪，改善食品的口感和营养价值。
3. 环境保护领域在环境保护领域，酶及细胞固定化技术被用于废水处理、土壤修复和污染物降解。
固定化的微生物可以被用于处理含有重金属、有机物和氮、磷等污染物的废水，减少对环境的影响。
固定化的酶也可以用于土壤修复，去除油污和有机污染，改善土壤的质量。
4. 医药领域在医药领域，酶及细胞固定化技术被用于药物的制备、生物传感器和组织工程。
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聚丙烯酰胺包埋制备固定化酶的过程：将酶 溶液加入到含有丙烯酰胺（单体）和N， N′-亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）的溶液 中，再加入二甲氨基丙腈（加速剂），同 时加入过硫酸钾（引发剂）混合，于25℃ 保温10min，即得含酶凝胶，将凝胶粉碎， 制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干 燥。
（2）微囊型
将酶或微生物菌体包埋在高分子半透膜中 的微囊内称为微囊型包埋法。由于固定化 形成的酶小球直径一般只有几微米至几百 微米，所以也称为微囊化法。
① 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上 溶解度极低而形成膜从而将酶包埋。 ② 界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生 聚合形成半透膜，将酶包埋于半透膜微囊 中。
③ 二级乳化法 酶溶液先在高聚物（乙基纤维素、聚苯乙 烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水 相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物 固定化后，每个固体球内包含多滴酶液。 ④ 脂质体包埋法
采用双层脂质体形成的极细球粒包埋酶。
3、结合法
通过选择适宜的载体，通过共价键或离子 键与酶结合在一起的固定化方法称为结合 法。
① 离子键结合法 ② 共价键结合法
离子键结合法
通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。
常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度 优缺点： 操作简便，条件温和，酶活力回收率高； 易受缓冲液种类和pH影响，易脱离。
第一节 酶的固定化
水溶性酶 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
固定化酶是指借助于物理或化学方法，将 酶固定在载体上，并在一定的空间内进行 催化反应的酶。
固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定 化菌体。
固定化酶的特点
① ② ③ ④ ⑤ 稳定性提高，使用寿命延长 可得到高纯度、高产量的产品 可以连续化生产操作 反应的最优化控制成为可能 再生产利用
共价键结合法
通过共价键将酶蛋白的侧链基团与载体的官能团 结合的固定化方法。 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚 基，二硫键 (非活性中心基团) 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无 机载体 优缺点：操作复杂，酶结构性质变化，回收率低， 不适用于微生物细胞固定；不易脱落。
缺点
① 酶活力有一定损失，初始的投资大。 ② 只能用于可溶性底物，而且较适用于小 分子底物，对大分子底物不适宜。 ③ 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特 别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶 需经分离后，才能固定。
一、酶的固定化方法
1．物理吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附 在其表面上。 载体类别： 天然无机载体 ：活性炭，硅藻土，硅胶 等。 有机载体：淀粉，纤维素，谷胶原等。
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联 试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子 被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
交联法常用试剂 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙 烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广 泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或 蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。 双重固定法
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团 关键 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键
载体活化的方法
重氮法 叠氮法 烷基化反应法 硅烷化法 溴化氰法
① 重氮法
是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐 酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8∽9) 条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
最后，准确称量1g氯丙基化的硅胶，至于 一定浓度的聚乙烯亚胺水溶液中，于一定 的温度下反应一段时间，用大量蒸馏水冲 洗产物，抽滤，真空干燥后制得PEI-SIO2复 合载体。
称取0.5g经干燥的复合载体PEI-SIO2，加 入适量的戊二醛溶液，搅拌并在室温条件 下反应1h，产物用蒸馏水冲洗后抽滤，再 加入30ml经磷酸盐缓冲溶液稀释过的脂肪 酶液，在恒温水浴振荡器中于给出的温度 下震荡一定的时间，即可制的固定化的脂 肪酶。
反应示意式如下
目前在我们国内用的较多的载体是对氨基 苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡 聚糖凝胶和琼脂等
该方法需要载体具有芳香族氨基
② 叠氮法
对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有
酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成 叠氮化合物。最后与酶偶联。
③溴化氰法
主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维
2、包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中， 使酶固定化的方法称为包埋法。分为：
（1）网格型 （2）微囊型
（1）网格型
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网 格中，制成一定形状的固定化酶，称为网 格型包埋法。
载体材料： 合成高分子化合物：聚丙烯酰胺，聚乙烯 醇，光敏树脂 天然高分子多糖类：淀粉，明胶，海藻酸， 角叉菜胶。
素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的 占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂 糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作 亲和层析，有着良好的性能。
④ 烷基化反应法
含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化， 形成含有卤素基团的活化载体。
4、交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法称为 交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的 固定化。
吸附交联法
交联包埋法
5、热处理法
将酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，
使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌 体。 只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，
热处理也可与交联法或其他固定化法联合
使用，进行双重固定化。
各种固定方法的特点比较
复合载体PEI-SIO2的制备 首先对硅胶进行活化处理：取5g硅胶至于 30ml甲烷磺酸水溶液控制温度在102℃，搅 拌活化4h，洗涤，抽滤后真空干燥24h即可； 然后使硅胶发生氯丙基化，将活化后的硅 胶以二甲苯为溶剂，加入少量的水，与γ氯丙基三甲氧基硅烷在80℃反应6h，抽滤 后的产物在索氏抽屉器中用甲苯抽屉24h， 以除去γ-氯丙基三甲氧基硅烷，分离后产 物经真空干燥，所制产物为氯丙基化的硅 胶（CP-SIO2）；