抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明

微量法100T/96S

产品简介：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA

的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。

APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

产品内容：

试剂一：液体×2瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体×1支，4℃保存。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。

二、测定操作表：

1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃中预热30min 以上。

3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL 蒸馏水、140µL 预热的试

剂一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。

4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL上清液、140µL预热的试剂

一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。

APX活力计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1µmol AsA为1U。

APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：每克样品每分钟氧化1µmol AsA为1U。

APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200µL=2×10-4L；106：1mol=1×106µmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20µL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1µmol AsA为1U。

APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

活性单位定义：每克样品每分钟氧化1µmol AsA为1U。

APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5cm；V反总：反应体系总体积（L），200µL=2×10-4L；106：1mol=1×106µmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20µL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。