pull-down 实验技术
pull down 实验方法
.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。
（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。
如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。
）2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。
第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。
电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。
深入解析pull down实验：从技术原理到生物学意义
深入解析pull down实验：从技术原理到生物学意义蛋白质在细胞内发挥着关键的生物学功能，它们之间的相互作用是细胞内信号传递和调控的基础。
为了揭示蛋白质互作网络，科学家们发展了许多实验技术，其中pull down实验是一种被广泛应用的方法。
本文将从技术原理和生物学意义两个方面，深入解析pull down实验。
1.技术原理：Pull down实验基于亲和层析原理，利用蛋白质之间的特异性相互作用，通过诱捕靶蛋白及其相互作用伙伴，进而对其进行分离和鉴定。
该实验通常包括以下步骤：1.1选择适当的亲和剂：亲和剂是一种具有高亲和力的分子，用于捕获目标蛋白及其互作伙伴。
常见的亲和剂包括抗体、蛋白结构域和配体。
1.2亲和剂的固定：将选择的亲和剂固定在固相支持物上，如琼脂糖糖珠或磁珠。
固定亲和剂的选择应考虑其特异性、亲和力和稳定性。
1.3样品处理：将细胞提取物或组织溶液与亲和剂固相进行孵育，以使目标蛋白及其互作伙伴与亲和剂结合。
1.4洗脱和分析：通过洗脱步骤去除非特异性结合的蛋白质，并将目标蛋白及其互作伙伴从亲和剂上洗脱。
洗脱后的样品可以进行质谱分析、免疫印迹等方法进一步鉴定和定量。
2.生物学意义：Pull down实验在生物学研究中具有重要的意义。
通过该实验，我们可以获得以下信息：2.1互作伙伴的识别：通过pull down实验，我们可以鉴定特定蛋白质的互作伙伴，揭示蛋白质相互作用网络，有助于理解细胞信号传递和调控的机制。
2.2功能分析：通过确定互作伙伴，我们可以推断目标蛋白的功能和调控途径。
例如，某个蛋白质的互作伙伴可能是其底物、调控因子或抑制剂。
2.3蛋白质复合物的研究：pull down实验可用于研究蛋白质复合物的组成和结构。
通过确定复合物成员及其相互作用方式，我们可以深入了解复杂的蛋白质互作网络。
Pull down实验是一项强大的实验技术，用于揭示蛋白质之间的相互作用和功能。
通过该实验，我们可以更好地理解生物体内的分子相互作用机制，并为药物研发和疾病治疗提供重要的基础。
pull down
Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
Pull-Down实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。
Pull-Down vs.免疫沉淀Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用诱饵蛋白代替了抗体。
在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。
含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。
如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。
如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。
诱饵蛋白固相化策略依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。
必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如…bait the hook‟）。
如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的标签，以适用于现成的亲和树脂。
即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。
如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na 2HPO 4、2mM KH 2PO 4、140mM NaCl 、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0）、3、4、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。
在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。
两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。
将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
最大速度在4℃离心样品2min。
在新的微量离心管中收集上清。
用1ml冰冷的裂解液洗球珠。
在离心机上以最大速度离心1ml。
弃去上清。
4℃孵育结合30min。
2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。
3、3000rpm在4℃离心5min，除去上清。
4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。
5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。
将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。
重复洗3次以上。
平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。
pulldown实验原理
pulldown实验原理Pulldown实验是一种常用的分子生物学实验技术，用于研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用。
该实验原理基于核酸的亲和性纯化技术。
在Pulldown实验中，我们需要准备两种重要的试剂：目的蛋白和亲和填料。
目的蛋白是我们想要研究的蛋白质，而亲和填料则是用于显示目的蛋白与核酸相互作用的亲和性表位。
通常，亲和填料有两种类型：固定填料和亲和标记填料。
固定填料是通过共价键结合到固定材料上，如琼脂糖珠。
而亲和标记填料则是具有荧光或放射性同位素等标记，以便于后续的蛋白质分析。
Pulldown实验的步骤如下：1.准备目的蛋白：我们首先需要克隆目的蛋白的基因，并将其表达在适当的表达系统中，如大肠杆菌。
通过分析蛋白质序列，我们可以知道目的蛋白背后的结构和功能。
2.准备亲和填料：根据目的蛋白的特性，选择适当的亲和填料。
例如，如果目的蛋白是DNA结合蛋白，我们可以使用DNA纯化填料，如聚腺酸。
如果目的蛋白是RNA结合蛋白，我们可以使用RNA纯化填料。
3.将目的蛋白和亲和填料结合：将目的蛋白与亲和填料一起孵育，以使它们发生特异性的相互作用。
这可以通过混合目的蛋白和亲和填料，在适当的缓冲液中进行几个小时的孵育来完成。
4.固定亲和复合物：使用试剂将亲和复合物固定在固定剂上，如琼脂糖珠。
这可以通过将珠子加入到反应中，然后对混合物进行旋转和洗涤来完成。
5.洗涤亲和复合物：通过多次洗涤琼脂糖珠，去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
这可以通过多次旋转珠子和加入适当的洗涤缓冲液来完成。
6. 蛋白质分析：现在我们已经得到了特异性的目的蛋白-亲和填料复合物。
我们可以通过热变性、SDS-、Western blotting等方法对复合物进行分析和检测。
这些分析方法可以帮助我们确定目的蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
通过Pulldown实验，我们可以研究蛋白质与DNA或RNA之间的相互作用，从而深入了解生物分子的功能和结构。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。
其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。
（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。
在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。
pulldown实验原理及步骤
pulldown实验原理及步骤一、实验原理pulldown实验是一种常用的实验方法，用于研究蛋白质与DNA的相互作用。
该实验利用特定的蛋白质结合域与DNA结合，通过蛋白质与DNA的特异性相互作用，从而实现对蛋白质-DNA复合物的富集和纯化。
pulldown实验的原理基于亲和层析技术，该技术利用靶蛋白与固定在固相介质上的配体之间的特异性结合，将靶蛋白从混合物中富集出来。
在pulldown实验中，DNA序列通常是作为配体固定在固相介质上，而蛋白质则是靶蛋白。
通过将混合物与固相介质接触，靶蛋白与固相上的DNA结合，而其他非特异性结合的蛋白质则被洗脱掉。
最终，只有与DNA特异性结合的蛋白质被富集下来。
二、实验步骤1. 准备工作a. 合成或克隆目标DNA序列，并将其连接到适当的表达载体上。
b. 在表达载体中插入靶蛋白的编码序列。
c. 通过细菌转化等方法将表达载体导入宿主细胞中。
d. 在宿主细胞中诱导靶蛋白的表达。
2. 细胞裂解a. 收集表达靶蛋白的细胞。
b. 使用裂解缓冲液等方法将细胞裂解，释放细胞内的蛋白质。
c. 使用超声波、高压破碎等方法加强细胞裂解效果。
3. 富集DNA-DNA结合复合物a. 准备含有DNA的固相介质，如磁珠、琼脂糖或硅胶。
b. 将裂解液与固相介质接触，使DNA结合到固相上。
c. 使用洗涤缓冲液洗脱非特异性结合的蛋白质。
4. 分离DNA-DNA结合复合物a. 对固相介质进行洗涤，去除残留的非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
b. 使用洗脱缓冲液将特异性结合的蛋白质从固相上洗脱下来。
c. 收集洗脱液中的蛋白质，即为富集得到的DNA-DNA结合复合物。
5. 分析DNA-DNA结合复合物a. 使用SDS-PAGE或Western blot等方法检测富集得到的蛋白质。
b. 使用DNA测序等方法分析富集得到的DNA序列。
通过以上步骤，pulldown实验可以实现对蛋白质-DNA复合物的富集和纯化，从而进一步研究蛋白质与DNA的相互作用。
pull-down方法及蛋白表达纯化
3. Pull-down方法LB培养基成分：Tryptone 10 g/LY east Extract 5 g/LNaCl 10 g/L加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，继续滴加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌后，冷却至室温。
固体培养基灭菌前加入Agar（15 g/L），含抗生素的LB灭菌后加入1 ml卡那霉素（Kanamycin,100mg/ml）或者1 ml氨苄青霉素后（Ampicillin,100mg/ml）混匀，4℃保存备用。
3.1 诱导融合蛋白方法（1）吸100μl菌液于5ml LB液体培养基中，37℃，230rpm过夜培养。
（2）按1:50的比例转接至20ml LB中，37℃，230rpm培养2-3h至OD600达到0.6-0.8之间。
（3）加IPTG（终浓度1mM）进行诱导。
（4）继续培养1-2h。
（5）将菌液转移至50ml离心管中，4000rpm 离心10min。
（6）弃上清，将离心管倒置在吸水纸上吸干。
（7）按1ml 菌液加50μl PBS溶液的比例悬浮细胞，吸打均匀。
（8）按100:1的比例加入裂解酶（25ml 细胞悬浮液加25μl 裂解酶），混匀室温放置5min（如裂解物太粘稠，可用10μg/ml DNase处理）。
（9）把裂解的细胞悬浮液放入液氮中20s，再将其放入37℃温水中融化，反复10次。
（10）12000rpm 离心10min，吸取上清到另一离心管中。
（11）吸取部分样品中加入2×上样Buffer，混匀，SDS-PAGE电泳。
3.2 带His标签蛋白纯化（康为世纪Ni-Agarose resin for 6×His-tagged proteins）表达载体为pET28a，表达菌株为全式金公司Transetta。
大肠杆菌表达系统，可溶性蛋白的纯化：（1）收集菌体后，将菌体重悬于Binding Buffer，裂解菌体。
（2）将凝胶灌柱，依次用3倍体积的去离子水和8倍体积的Binding Buffer平衡。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Ｐulｌ—Ｄｏwn实验实验原理：Pｕlｌ—Down技术就是通过蛋白相互作用来研究细胞通路得有力工具。
就是确定两种或更多蛋白之间相互作用得体外方法。
Pｕll—Dｏwn实验可用来检测已知得蛋白相互作用条件,并且可用来筛选未知得蛋白相互作用。
用作诱饵得蛋白就是重组蛋白，会含有一个用于纯化得亲与标签。
这个融合标签就就是用于Ｐull—Dｏｗn实验得基础.最常见得标签为谷胱甘肽S－转移酶（GＳＴ）与多组氨酸(6×His）。
其分别使用固相化得谷胱甘肽与固相化得金属螯合物亲与配体（如Ｎi2+与Ｃo2＋）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达得含标签得纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：ＢindinｇBuffer/Wａｓhing Buffeｒ：４、2mM Na2ＨPO4、2ｍM KH2PＯ4、140mM ＮaＣl、10mM ＫClSDＳloaｄing Ｂｕfｆｅr：50mＭTｒｉs—Ｃl（ｐH6、８）、２％ＳＤS、0、1％溴酚蓝、1０％甘油、１0mM DTT裂解缓冲液:20mM Tris-Cｌ（pH8、０）、200mM NａCl、1mM EＤTA(pH8、0)、0、５％Noniｄｅt P－４0 使用前加入加入蛋白酶抑制剂.(蛋白酶抑制剂:2ug/uｌ抑肽酶（aprｏｔinin）、1ug／ul白胃素(ｌeupeptin）、0、７ug／ml胃酶抑素(ｐeｐｓｔatｉn）、25ug/ml苯甲磺酰氟(ＰMSF））实验方法:方法一：1、预清除细胞裂解液:将细胞裂解液与50ul得５0%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液与25ug ＧSＴ在4℃混合孵育2h。
离心机１2，00０ｇ在4℃离心２min.将上清转移至新得离心管中.2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及5０ｕl谷胱甘肽琼脂糖球珠得微量离心管.在一管中加约10ug得GST蛋白,另一管中加约1０ug得GSＴ融合探针蛋白.两个反应中加入得探针与对照蛋白质得量应该就是等摩尔得.将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
gstpulldown实验技术
gstpulldown实验涉及一些危险性因素，如化学试剂的使用、高温高压操作等，因此需要进行相应的安全防护措 施。例如，穿戴实验室外套、戴手套、避免直接接触化学试剂等。此外，应定期检查实验室安全设施和应急处理 设备，确保实验过程的安全性。
04
gstpulldown实验数据 分析
数据收集与整理
详细描述
gstpulldown实验技术与基因芯片等技术结 合使用，可以用于检测特定条件下细胞中基 因表达的变化。这种方法有助于揭示基因表 达的调控机制和分子网络，为研究生物发育 、疾病发生发展等方面提供重要信息。
应用案例五：其他领域应用介绍
总结词
gstpulldown技术在其他领域也有广泛的应 用，如病毒致病机制研究、免疫学研究等。
详细描述
gstpulldown实验技术在病毒致病机制研究 中可用于分析病毒与宿主细胞的相互作用； 在免疫学研究中可用于研究免疫细胞的活化 和信号转导。此外，它还可用于研究细胞凋
亡、自噬等生物学过程。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
对得到的实验结果进行验 证，如通过重复实验或使 用不同的蛋白质和DNA探 针进行验证。
实验注意事项
1. 选择合适的蛋白质和DNA探针
01
选择的蛋白质和DNA探针应具有代表性，能够反映所研究的问
题的本质。
2. 注意实验条件的一致性
02
为了保证实验结果的可靠性，需要在相同的条件下进行重复实
验。
3. 注意数据的分析和解读
未来发展趋势与展望
发展自动化和智能化技术
随着技术的发展，自动化和智能化将成为未来实验室技术的重要发展方向。通过开发自动 化和智能化的Gstpull-down实验技术，进一步提高实验效率和结果的稳定性。
pull-down试验方法（自己总结）
pull-down试验方法（自己总结）pull-down试验方法(自己总结)12、GST蛋白的表达和纯化12、1 GST蛋白的表达（1)将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3)将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0、1。
（4)28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5)加入50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6)收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpmx5min离心，弃上清。
（7)加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9)超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl10mg/ml PMSF,80μl 蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s，pause 20s run40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl20%TritonX－100，冰上放置30min。
（10)将裂解液分入1、5ml离心管中，4℃离心12krpm10min，取上清。
（11)吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12、2 准备50%GST Sepharose4Bslurry（1)将原75%Glutathione Sepharose4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3)加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4)加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose4B 备用。
12、3 GST融合蛋白的纯化（1)在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl50%Glutathione Sepharose4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
Pull-down实验和免疫共沉淀
Pull-down实验和免疫共沉淀Pull-down实验及原理Pull down是一种研究蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的体外方法，这里主要讲研究蛋白与蛋白互作的pull-down实验。
在Pull-down实验中，首先要利用基因重组技术构建含有亲和标签与诱饵蛋白基因的载体，然后通过表达纯化得到带亲和标签的诱饵蛋白，该诱饵蛋白可固定在某种基质上以吸附细胞裂解液中的能与诱饵蛋白互作的蛋白，之后再通过洗脱即可得到目的蛋白，对目的蛋白进行检测可实现诱饵蛋白与目的蛋白相互作用的分析。
Pull-down实验的基本原理是将一种含亲和标签的蛋白质作为“诱饵蛋白”固定于某种基质上，当细胞或组织裂解液经过该基质时，可与“诱饵蛋白”相互作用的蛋白就会被吸附，而没有被吸附的其他蛋白质则被洗脱液洗脱，被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而被回收，从而获得能与已知蛋白（即带亲和标签的诱饵蛋白）相互作用的蛋白。
诱饵蛋白上的亲和标签是pull down实验的基础。
常见的诱饵蛋白的亲和标签包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签和多组氨酸（6×His）标签。
Pull-down实验后可以对获得的互作蛋白进行电泳分析或质谱鉴定等，以确定已知蛋白或发现未知蛋白。
Pull down串联质谱Pull down实验也叫做蛋白质体外结合实验，是一种在体外研究蛋白质与蛋白质相互作用的简单而灵敏的技术。
Pull-down实验，通过带亲和标签的诱饵蛋白可以把细胞或组织裂解液中与诱饵蛋白相互作用的蛋白质拉下来。
串联质谱用于被拉下来的蛋白质的分析鉴定，然后就可以确认与诱饵蛋白互作的蛋白是不是研究者预想的蛋白质，以及得到互作蛋白是什么蛋白等信息。
免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-IP）是一种研究天然状态下蛋白质与蛋白质相互作用的技术。
在Co-IP实验中，首先要使用非离子型表面活性剂来裂解细胞或组织样品以更好的保留完整的蛋白质与蛋白质相互作用，然后加入某一蛋白（诱饵蛋白）的专一性抗体，该抗体与诱饵蛋白结合使诱饵蛋白沉淀，同时也可以沉淀与诱饵蛋白相互作用结合在一起的其它蛋白，也就是实现共沉淀，之后通过洗脱即可得蛋白复合物（诱饵蛋白与其互作蛋白的复合物），对产物进行检测可实现互作蛋白的分析。
PullDown实验具体步骤及详细方法
PullDown实验详细步骤及详细方法实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间互相作用。
用于验证两个蛋白的互相作用，或者挑选与蛋白互相作用的未知蛋白。
实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST〔Glutathione S transferase〕交融，交融蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH〔Glutathione〕亲和结合。
因此，当与交融蛋白有互相作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而别离。
试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF 〔Amersco〕，Cocktaier〔Merck 539134〕，Immobilized Glutathione 〔PIERCE 15160〕实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST交融的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl： 8gKCl： 0.2gNa2HPO4： 1.44gKH2PO4： 0.24g参加800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可，高温高压灭菌！4℃保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20℃或者4℃〔以下流程仅供研究原核蛋白A和真核过表达蛋白B互相作用〕1：原核交融蛋白A的获得1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，参加适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间〔诱导条件需要根据不同的蛋白做调整〕，6000g，10分钟，4℃离心搜集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液参加10-20ml细菌裂解液〔PBS+1%Triton-100+PMSF〕，吹打混匀1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。
GSTpulldown实验技术
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：
假定A蛋白和B蛋白可能有相互作用，将纯化的融合GST 标签的A蛋白和纯化的B蛋白以及能特异结合GST的 Sephrose 4B beads 孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋 白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，通过Western blotting 检测，可以看见GST-A和B分别对应的条带,表明A和B因 相互作用而被GST-A pull-down；而GST对照组始终仅有 一个条带。
GSTpulldown实验技术
Western Blot
GST pull-down原理 GST pull-down实验流程
Western Blot
GST pull-down原理：
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的 方法。
原理： 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体 上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合 蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合 物混合时就可被吸附而分离。
10~30min; 4、 12000 rpm/min，4℃离心5min，取上清保存在-80℃或进行
下一步实验。
Western Blot
3. 体外蛋白的结合
1、 将结合有GST-A融合蛋白的Sepharose 4B悬浮在适量体积缓 冲液中，加入20~30微升含有B蛋白的溶液（原核表达或真核表 达产物），同时采用结合有GST蛋白的Sepharose 作为阴性对照；
3. 体外蛋白的结合
5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层 的Sepharose）；
pull down 实验技术
His蛋白纯化方案1.稀释表达的大肠杆菌（1：100），37摄氏度振荡直至OD 600 = 0.7（用500ml烧瓶，内含125ml培养液）2.加IPTG（0.5mM）,振荡4小时3.离心大肠杆菌，3900r,20min,冷冻颗粒4.在冰上使用3ml裂解缓冲液（0.1％Triton）裂解细胞5.在冰上超声处理10秒每次，2次6.离心细胞提取物，13000 r ，4摄氏度离心15分钟（蛋白质在上清液）7.GST-pull down，将200ul细胞提取物加入到5ul GST珠或GST-nsp3珠中8.同时，15ul细胞提取物加入5ul 4x SDS样品缓冲液作为INPUT，剩余在-80摄氏度保存GST-pull down方案1.进行SDS-PAGE凝胶来计算GST蛋白（阴性对照）和GST-nsp3蛋白的体积比（它们应为1：1，GST，25kd）[GST：5ul; nsp3：5ul]2.首先制备80μl对照珠，在冰上（500μl/次）用1×TBS洗涤珠两次3.准备3个管用于GST蛋白（5ul /管）和3个管用于GST完全nsp3蛋白（5ul /管），加入10ul 对照珠，然后加入200ul His标签全长N蛋白，T1和T2蛋白。
4.4摄氏度翻滚1-2小时。
5.4℃800 r离心，去除细胞提取液。
6.在冰上（500μl/次）用GST-裂解缓冲液（0.1％Triton，不含PMSF）冲洗完全抑制剂片剂、溶菌酶和珠子2次。
7.在冰上用500μl冷TBS将珠子洗涤1次，用注射器除去所有上清液，每管加入25μl 1×SDS样品缓冲液，煮沸。
8.SDS-PAGE凝胶，包括INPUT（2ul），GST-TAG pull down（10ul），GST-nsp3 pull down（10ul）。
使用抗His做蛋白质免疫印迹。
裂解缓冲液：1×PBS10％甘油0.1％Triton5mM DTT1mg / ml溶菌酶（50mg / ml储备液，Franzi）1mM PMSF（-20摄氏度，100mM储备液）完全抑制剂片（4摄氏度，1片加500μl PBS，20×储备液）。
lncRNA研究策略之：RNA-Pull-Down实验技术
【实验技巧】lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术lncRNA研究策略之：RNA Pull Down实验技术RNA pull-down是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验手段之一。
RNA pull-down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。
该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分别离。
复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
1) lncRNA筛选：通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。
2) lncRNA确定：通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。
3) 表达分析：细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。
组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。
表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。
4) 功能研究：功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。
然而有些lncRNA很大或全长尚未别离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。
Pull-down蛋白质鉴定技术
Pull-down蛋白质鉴定技术Pull-down 实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。
带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获，形成次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。
纯化产物洗脱后，经Western blot或LC-MS/MS验证，即可诱饵蛋白互作的蛋白进行鉴定。
Pull-down蛋白质鉴定技术步骤（图片来源：百泰派克生物）Pull-down实验的具体步骤：1. 表达纯化GST、polyHis或Biotin标记的诱饵蛋白；2. 使用固定化亲和配体将诱饵蛋白与固相基质稳定结合；3. 再将诱饵蛋白与待测细胞裂解液进行混合孵育，在这一过程中，诱饵蛋白与目标蛋白相互作用并结合在一起，通过清洗除去非特异性结合的杂蛋白，即可获得与诱饵蛋白相互作用的目标蛋白；4. 最后通过质谱分析对目标蛋白进行鉴定。
通过GST融合蛋白pull-down技术，可鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质，或两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。
高准确性，高灵敏度。
适合中度复杂的蛋白质样品，如相互作用的蛋白质条带和洗脱液等。
百泰派克公司利用进口的GST pull-down 试剂盒，能够快速准确的完成蛋白互作实验，结合公司先进的UPLC-MS质谱平台，推出基于pull-down的蛋白分析一站式技术服务，灵敏度高、分辨率准确。
Pull-down蛋白质鉴定技术研究蛋白互作的方法不仅强大，而且高效快速，操作简便，可直接检测是否具有相互作用。
Pull down
百泰派克生物科技
Pull down
Pull down实验，又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术，蛋白Pull down技术
可以提供一种诱饵蛋白来特异性识别配体蛋白质，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
蛋白质Pull down将被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的诱饵蛋白固定在某种固体基质（如琼脂糖）上，当目标蛋白或细胞、组织抽提液流经该基质时，可与该诱饵蛋白相互作用的配体蛋白被捕获，通过改变洗脱液或洗脱条件回收被捕获的蛋白，再利用蛋白质印迹或质谱方法检测这种互作关系。
蛋白Pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。
但是蛋白质Pull down技术是一种体外亲和纯化技术，在一定程度上不能真实的反应细胞内蛋白质之间的相互作用，因为在体外相互作用的蛋白质在正常生理条件下不一定会相互结合。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，利用进口的GST pull-down 试剂盒，提供Pull down靶蛋白质谱鉴定一
站式技术服务。
您只需要将您的需求和样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、pull down、质谱分析、质谱原始数据分析，欢迎免费咨询。
pull down 实验方法
Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。
（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。
如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。
）2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。
第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。
电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。
pull-down实验步骤解析
pull-down实验步骤解析嘿，咱今儿就来好好唠唠这 pull-down 实验步骤哈！你想想，这 pull-down 实验就像是一场精心编排的舞蹈。
首先呢，得准备好“舞台”，也就是把咱要研究的蛋白啥的都准备得妥妥当当。
这就好比跳舞得先有合适的场地和舞者呀！然后呢，把带有“钩子”的东西，也就是能和目标蛋白结合的东西放进去，这就像是抛出一个诱人的“诱饵”，等着目标蛋白上钩呢！接下来可就关键啦！让它们在合适的环境里相互作用，就像舞者们在音乐中翩翩起舞，相互呼应。
等它们结合得差不多了，就该把那些没结合上的杂质啥的给清理掉，这就好比把舞台上多余的东西清理掉，让主角们更加突出。
然后呢，把结合上的复合物给分离出来，哇哦，这感觉就像是把最精彩的舞蹈动作给单独拎出来欣赏一样。
这一步可得小心谨慎，不能有一点马虎，不然就前功尽弃啦！再之后，对这些复合物进行分析鉴定，看看咱到底钓到了啥“大鱼”。
这就像是仔细欣赏舞蹈的每个细节，去评判它的好坏优劣。
你说这 pull-down 实验是不是很有意思？就像一场神秘的探险，每一步都充满了惊喜和挑战。
要是哪一步没做好，可能就找不到我们想要的答案啦！在做这个实验的时候啊，可千万不能粗心大意。
就好比跳舞时一个小失误可能就会影响整个表演的效果。
每一个环节都得精心对待，从准备试剂到操作过程，都得像呵护宝贝一样小心翼翼。
而且哦，这个实验有时候还需要点耐心呢！就像等待一朵花慢慢开放，不能着急，得慢慢等，慢慢观察。
要是太着急了，可能就会错过一些重要的细节。
咱做实验的人啊，就像是这场舞蹈的编导，要把每个步骤都安排得妥妥当当，才能让实验顺利进行，得出可靠的结果呀！这 pull-down 实验步骤，你可搞清楚了吗？别迷糊哦，要认真对待每一个环节，这样才能在科学的海洋里畅游，找到我们想要的宝藏呢！。
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GST pull-down实验介绍
本帖引用网址：/thread-30095-1-1.html
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过
SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题
啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法.
简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的, 西方的. Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很
合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但
是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.
这也是我们生理学家所关心的, 若是没有生理意义, 那还空谈什么关系.
尤其在蛋白实验里, 假阴性, 假阳性泛滥. 以为是真的东西, 实际是假的; 以为是假的东西, 实际上却是真的.
如何披沙捡金, 去伪存真? 就得靠缜密的阴性, 阳性对照组来帮助我们辨别.
要把蛋白和已知不相干的蛋白放在一起, 和已知相干的放在一起, 以此来检验实验手段是
否能够区分这两种情况. 这样才知道他是不是对你"用情专一, 矢志不渝".
要通过移除一个蛋白, 来看另一个蛋白的生理表现. 看他是不是"没有你不行", 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
有关变化
人是会变化的, 正如构成人的蛋白一样.
蛋白在细胞内从被产生, 到被销毁, 并非一成不变, 而是非常动态的.
磷酸化, 去磷酸化; 泛素化, 去泛素化; 脂肪酸化, 脱脂肪酸化; 氧化, 还原; 局部或酸, 或碱; 或冷, 或热; 与其他蛋白或小分子物质如ATP, GTP的结合, 分离; 都会使蛋白的功能发生很大变化.
两个蛋白的关系可能在这种情况下会这样, 在那种情况下那样. 这些都是可以理解的. 有时候这些变化是可逆的, 比如磷酸化, 那么在脱磷酸化以后, 关系还可以维持. 有时变化是不可逆的, 比如氧化, 泛素化, 这时候, 关系便不可维持. 生死变化, 对蛋白都是常态; 对于基于蛋白的活生生的东西, 唯一不变的就是变化. 花如此, 人如此, 感情亦如此, 我们明白这一点就能怀更多的宽容, 理解之心.
细胞金元ATP, GTP这些小分子也可能起到极大的作用, 蛋白结合了他们就会变化, 蛋白的功能也会随之变化. 比如Ras, 在结合了GTP以后就变得非常活泼, 可以引发细胞分化, 形态变化. 不过, Ras 若是持续的结合GTP不放手, 那么细胞就会癌化. 所以, 细胞内的金钱不可缺少, 善持之可以为善, 执迷不误必定作恶.
构成人的基本单元蛋白都遵守这一规律, 万物静观皆自得, 具十全佛性, 我们可以从自己身上学到非常多有益的东西。