第八章 酶的定向进化-2013-12-5
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第八章定向进化
第八章 酶的定向进化
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
2011酶工程 第八章 酶的定向进化
普通筛选方式
常见的96孔板高通量筛选技术
1 平板筛选技术
1）根据细胞生长情况筛选突变基因 热 抗生素 pH 高渗透压 低温 有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
2） 依据颜色变化筛选
颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法，如用对硝 基苯基衍生物检测水解酶的活性。根据水解释放出的 黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺来进行检测。下图显色 底物可检测葡萄糖苷酶。 碱性条件显色pH8 大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了检测一个没 有生色集团的底物的反应，需要将反应产物转变为一 个有色化合物。
Stemmer W P C. , Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 10747- 10751
二 酶稳定性-耐有机溶剂
2001年，Song 和Rhee利用随机突变和重组的方法筛选得到 三株磷脂酶A1 突变体,可以在有机溶剂存在的条件下有效的 发挥作用, 其稳定性和活性都得到较大的提高。 Song J K, Rhee J S. Biochim Biophys Acta , 2001 , (1547) : 370～ 378. Arnold 等用定向进化方法提高P450 BM3对有机溶剂ＤＭＳ Ｏ耐受力提高了６倍，对ＴＨＦ的耐受力提高了１０倍。
基因型
表达型
融合蛋白
PIII
Lead
Hv
Link
Lv
E
PIII
4 酵母细胞表面展示技术
S. cerevisiae 易培养、安全、适用范围广
适用于真核生物蛋白库的构建，有较高的库容量
（ 105 -106 )
展示可溶性蛋白（104 -105 protein copies/cell），
酶的定向进化
Curr. Opin. Biotechnol., 2000, 11: 325–330
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
得的少量突变累积而产
生重要的有益突变。
DNA改组技术(DNA shuffling)
又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列， 创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 分子种
单个基因的DNA改组
从突变体基因库中分离出来 的DNA片段用脱氧核糖核酸 酶I随机切割
酶活力检测
反应产物显色
pH指示剂显色 对硝基苯酚和伞形酮衍生物等显色底物 分光光度计和荧光酶标仪
通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 GC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析时间 同位素标记底物 质谱 热力学红外检测
噬菌体显示筛选模式
噬菌体表面展 示技术是 Smith 等建立 的一种利用大 肠杆菌丝状单 链 DNA 噬菌体 为载体，在重 组噬菌体颗粒 表面展示外源 多肽分子的展 示技术
定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进 化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需 要。
定向进化与自然进化的差别
定向进化的一般过程
对酶实现定向进化的意义
酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的， 但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结 构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。
pH指示剂显色高通量筛选
产物显色筛选
巨大芽 孢杆菌P 450 BM-3，最适 底物为C 12 C 18 的脂肪酸， 对短链烷烃 羟化活力较 低 两轮易 错PCR，最 佳突变酶的 比活提高了 5倍
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
得的少量突变累积而产
生重要的有益突变。
DNA改组技术(DNA shuffling)
又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列， 创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 分子种
单个基因的DNA改组
从突变体基因库中分离出来 的DNA片段用脱氧核糖核酸 酶I随机切割
酶活力检测
反应产物显色
pH指示剂显色 对硝基苯酚和伞形酮衍生物等显色底物 分光光度计和荧光酶标仪
通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测 GC/HPLC，使用较短的柱子以缩短分析时间 同位素标记底物 质谱 热力学红外检测
噬菌体显示筛选模式
噬菌体表面展 示技术是 Smith 等建立 的一种利用大 肠杆菌丝状单 链 DNA 噬菌体 为载体，在重 组噬菌体颗粒 表面展示外源 多肽分子的展 示技术
定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进 化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需 要。
定向进化与自然进化的差别
定向进化的一般过程
对酶实现定向进化的意义
酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的， 但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结 构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。
pH指示剂显色高通量筛选
产物显色筛选
巨大芽 孢杆菌P 450 BM-3，最适 底物为C 12 C 18 的脂肪酸， 对短链烷烃 羟化活力较 低 两轮易 错PCR，最 佳突变酶的 比活提高了 5倍
第八章酶分子的定向进化概要
张今等为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 以天冬氨酸为模型通过控制DNA合成的碱基底物 种类和浓度比例实现碱基对的错配，向目的基因 引入突变同时限制突变减少筛选突变体的工作量， 探索了一种称为酶法体外随机、定向改造酶分子 的途径。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
9
三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
3
三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
21
七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
第八章 酶的定向进化
定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶的定向进化
外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向 进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别
是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研
究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐
显示其生命力
定向进化的原理
定向进化＝随机突变＋选择
随机突变的策略
易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer
在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′ 校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突 变， 构建突变库。
连续易错PCR
连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反 复地进行随机诱变。
PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72
易错 PCR
是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩 增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs 浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变 扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率 向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分 子的随机突变体。
于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了
一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一
种简化的DNA shuffling 技术
易错PCR
易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目 的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随 机突变。
是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研
究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐
显示其生命力
定向进化的原理
定向进化＝随机突变＋选择
随机突变的策略
易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer
在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′ 校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突 变， 构建突变库。
连续易错PCR
连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反 复地进行随机诱变。
PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72
易错 PCR
是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩 增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs 浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变 扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率 向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分 子的随机突变体。
于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了
一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一
种简化的DNA shuffling 技术
易错PCR
易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目 的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随 机突变。
酶工程 第八章 酶的定向进化 (1)
7
酶的定向进化
• 基于序列的理性设计：分子修饰
利用已知酶分子的空间结构、结构和功能之间关系， 以及氨基酸残基功能等信息，对酶分子进行改造； • 利用基因操作模拟自然进化的非理性设计：定向进化 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机突变、基 因重组等方法模拟自然进化机制在体外改造酶基因， 并定向筛选出所需突变酶；
• 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ • 提高Mg2+浓度
15
1、易错PCR
• 优点：操作简便，随机突变的定向进化
• 难点：要控制好突变率
16
1、易错PCR
连续易错PCR： 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。
8
酶的定向进化
酶定向进化的概念： 模拟自然进化（随机突变和自然选择） 的过程，在体外进行酶基因的人工随机突 变，并在人工控制条件的特殊环境下进行 定向选择，得到具有优良催化特性的酶的 突变体。所得到的酶称为进化酶。
9
酶的定向进化
• 主要过程： 1、随机
DNA 改组 (DNA shuffling)
交错延伸PCR 随机引物体外重组 基因家族重排
12
PCR
13
1、易错PCR
• Taq酶不具有3’5’ 方向的 外切酶活性，有一定的错配 几率（5×10-5） • 易错PCR：提高PCR过程 的错配几率
14
1、易错PCR
方法：
• 改变4种底物的浓度比，或降低一种dNTP的量（降 至5％-10％），同时加入dITP来代替被减少的 dNTP；
• 基因重组（of chapter 8
8.1进化的应用
34
酶工程5 第八章_酶定向进化
1992年Gram H．等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错PCR 向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
2/169
第一节 酶定向进化介绍
3/169
获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
4/169
22/169
定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
23/169
2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
酶定向进化
基因家族重排技术改组效果
第三节 酶突变基因的定向选择
• 在人工控制条件的特殊环境下，按照人们
所设定的进化方向对突变基因进行选择，
以获得具有优良催化特性的酶的突变体的
过程
反复进行 基因 随机突变 构建基因 定向筛选 正突变基因一、 突变或包装成重组λ 噬菌体的技术过程。 反复进行 随机突变
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
微量滴定板
比色法
微孔板分光光度计
荧光检测
荧光检测器
3.噬菌体表面展示法
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而 表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面 的生物技术。
用固相化抗原 经“亲和结合 一洗脱一扩增” 数个循环直接、 方便、简捷、 高效地筛选出 表达特异性好、 和力强的抗体 噬菌体库。
2.载体的特点
具有自主复制起点 两种以上易于检测的选择性标记 多种限制性内切核酸酶的单一位点
2. 基因重组
• 在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载 体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程。
• 1）黏性末端连接 • 2）平头末端连接 • 组DNA转入受体细胞或包 装成有感染活性的重组噬将带有外源基因的重组质粒 DNA印染受体细胞的技术过程。）
P212
• 将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜
突变基因
含突变基因的细胞或 重组λ噬菌体基因正突 变基因基因重组
筛选
载体的选择 含有正突变基因的重完整性（二）构建基因的主要过程• 1. 载体的选择
质粒载体
噬菌体DNA载体 黏粒载体 噬菌粒载体
2、高通量筛选方法
第八章 酶分子定向进化(提纲)2013
第八章酶分子定向进化一、酶分子定向进化的目的为什么要研究酶的定向进化?天然酶的局限性在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低存在产物抑制稳定性差，活性低，催化效率低有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质现代生物工程的要求能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。
二、酶分子的改造酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计。
酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计。
问题：定向进化是不是定点突变？澄清一个事实：定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR 技术为基础的。
什么是酶的定向进化?从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。
酶分子定向进化研究的历史萌芽阶段：20 世纪60 年代Sol Spiegelman 利用RNA 噬菌体Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程奠基阶段：20 世纪80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶分子的新思想发展阶段：20 世纪末期易错PCR 和DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟如何使酶分子定向进化?定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选三、酶分子定向进化的基本策略和方法定向进化的基本策略一般而言，定向的分子进化有三种方法：（1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含1-2 有益突变的积累。
第八章酶的定向进化
改进方法
其它改组方法
交错延伸重组( 交错延伸重组 StEP : Stagger extension process) 随机引物体外重组( 随机引物体外重组 RPR: Random2priming in vitro recombination) 临时模板随机嵌合生长( 临时模板随机嵌合生长 RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates)
定向进化的历史
1 萌芽阶段 首先在分子水平上进行改造 单一分子的是 Sol Spiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬 菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然 选择也可在非细胞体进行. 病毒基因组 Q复制酶扩增 DNA突变库 复制快的保留(能被Q酶选择识别的)
2奠基阶段
1981年,Hall B G等报道了他们定向改变了 大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专 一性,开发出对几种糖苷键有水解能力的酶. HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌, 分别在含有某种碳源的培养基上培养.从酶 的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖, 乳果糖,乳糖酸的突变酶,而野生型的酶不 能水解这些底物.
第八章 酶的定向进化
8.1 简介
通常可通过两条途径获得具有新功能和特性 的酶 一是从大量未知的生物种系中寻找; 二是改造现有已知的酶.
人工改造之定点突变
首先分析蛋白质的三维空间结构,搞清结构 与功能的关系,然后采用定点突变技术改变 蛋白质中的个别氨基酸残基,从而得到新的 蛋白质,理性化设计. 定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性,抗 氧化性,底物特异性,热稳定性及拓宽酶反 应的底物范围,改进酶的别构效应等进行了 成功的改造.
实例
Stemmer 等从不同种微生物中选择编码头孢 菌素酶的4 个同源基因, 对它们进行单独进化 和同源重组进化, 来对这两种进化模式进行比 较.在对单基因进化得到的突变酶中, 对头孢 羟羧氧胺的抗性最高的增加了8 倍, 而采用 Family shuffling 的方法使抗性比其中两种微 生物来源的天然酶提高270 倍, 比另两种酶提 高了540 倍.
酶的定向进化
一 平板筛选法
• 平板筛选法是将含有随机突变基因的重组 细胞，涂布在平板培养基上，在一定的条 件下培养，依据重组细胞的表型鉴定出有 效突变基因的筛选方法。 • 平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括 细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情 况。
（1）依据细胞生长情况筛选突变 基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐 受性、pH稳定性和对其他极端 环境条件的耐受能力等方面有 广泛应用。
• （1）如果定向进化的目的是为了提高酶的热稳定 性，可以再较高的的温度条件下培养重组细胞， 并咋一次突变—筛选的循环中逐步提高重组细胞 的培养温度，经过几次循环以后，可以获得热稳 定性较好的酶突变体。 • （2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的 活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受 性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类 抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突 变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。
酵母细胞表面展示法
• 酵母细胞表面展示法是通过可以锚定在酵 母细胞表面的特定蛋白（凝集素蛋白）与 某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物， 使这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表 面的一种分子展示法。 • 酵母细胞表面展示法主要有以下两种： （1）目的蛋白-a凝集素表面展示系统 （2）a凝集素-目的蛋白表面展示系统
（一）定向选择条件的设定
• 在基因突变的定向选择过程中，重组细胞 培养的环境条件是根据定向进化的目的要 求而人工设定的，所设环境条件需要在每 一次突变—筛选的循环中得以调整，逐步 向进化的方向靠近，最终达到目的，获得 人们所需的具有新催化特性的进化酶。 • 根据酶本身的特性和进化目标不同，在突 变基因的定向选择过程中环境条件的设定 方式也有所不同，现举例如下:
三 噬菌体表面展示法
酶的定向进化
酶的定向进化
酶的定向进化
酶的定向进化是发展迅速的重要的生物工程技术之一,是改进酶的热稳定性、耐酸碱性、耐有机溶剂性、底物特异性、立体选择性等性质,使酶更适于工业应用的重要途径.定向进化也是研究抗体酶的主要途径.本文综述了酶的定向进化的意义、策略与主要技术手段以及对成功的酶定向进化的基本要求,并综述了在最近几年内酶的定向进化研究所取得的的主要进展.
作者：蒋本国范圣第刘宝全作者单位：大连民族学院生物工程系,大连,116600 刊名：化学通报ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY 年，卷(期)：2004 67(5) 分类号：O6 关键词：。
第八章酶的定向进化
第三节 酶突变基因的定向选择
• 定向选择的过程：
突变基因
基因载体基因重组 突变基因筛选 目的基因一、突变基重组，转入 适当的细胞体、噬菌体载体、粘粒载体、噬菌粒载
稳定性和催化活性.得到的突变酶最适温度比天然酶 高5 ℃，Vmax提高了3倍，而Km不变。 Chen 等 采用易错PCR 对枯草杆菌蛋白酶进行了体外 进化研究。经筛选得到的突变株在高浓度的二甲基 甲酰胺(DMF) 中酶活力是野生型的256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到的突变体13M酶活 力比PC3 还要高3 倍。
• Williams 等人利用DNA重排改造1，6-二磷酸己酮糖醛缩酶。 得到的醛缩酶以非天然的1，6-二磷酸果糖为底物时，kcat/ Km值提高80 倍，立体定向性提高了100倍。
特点
• 可体外实现同源序列间的改组，创造亲本基因群中突变尽 可能组合在一起的机会，加速累积有益突变最终获得较理 想的性状改良的突变体
定向进化
• 酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的 非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制， 通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机 突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向 选择出所需性质的突变酶。
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能 有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。
• 连续易错PCR（Sequential error-prone PCR）策略。即 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增 的模板，连续反复地行随机诱变，使每一次获得的小突变 累积而产生重要的有益突变。
实例
• Komeda等用易错PCR方法提高了Ochrobactrum anthropi SV3（人苍白杆菌）的D-氨基酸酰胺酶的热
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酶的改性（enzymic improving）：通过各种方法
使酶的催化特性得以改进的技术过程。
酶改性的技术
酶分子的修饰
酶固定化
酶的非水相催化
酶的定向进化 ……
酶分子的定向进化（directed evolution）：模
拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在
体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基
因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术 反应条件：提高Mg2+浓度；添加Mn2+；改变四
过程。 种底物浓度比等。
易错PCR技术 特点：操作简便，随机突变丰富。 缺点：正突变基因少，需多次PCR。 注意：控制好基因突变频率。 适用：较小基因的定向进化。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术过程。
平板筛选技术 荧光筛选法
噬菌体表面展示法
酵母细胞表面展示法
酶定向进化的应用
提高酶的催化效率 增加酶的稳定性 改变酶的底物特异性
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化
酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+定向选择。
酶基因随机突变 构建突变基因组定向筛选4.6.3 酶基因的随机突变 1、易错PCR技术为代表的无性进化 无性突变：向单一酶分子基因内随机引入突变， 制造突变酶库以便筛选。 易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条库，在人工控制条件的特殊环境下，定向
选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
4.6.1 定向进化的特点 适应面广； 目的性强； 效果显著。
4.6.2 定向进化的原理 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
DNA改组原理
DNA改组技术 特点：正突变频率高，进化速度快。 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组 从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌
素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同
源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高变基因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 质量要求：包容性和完整性 过程：
质粒
载体选择 基因重组
噬菌体DNA形成基因黏粒载体 转化 噬菌粒载体 转导
2、突变基因的筛选
（1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
使酶的催化特性得以改进的技术过程。
酶改性的技术
酶分子的修饰
酶固定化
酶的非水相催化
酶的定向进化 ……
酶分子的定向进化（directed evolution）：模
拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在
体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基
因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术 反应条件：提高Mg2+浓度；添加Mn2+；改变四
过程。 种底物浓度比等。
易错PCR技术 特点：操作简便，随机突变丰富。 缺点：正突变基因少，需多次PCR。 注意：控制好基因突变频率。 适用：较小基因的定向进化。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术过程。
平板筛选技术 荧光筛选法
噬菌体表面展示法
酵母细胞表面展示法
酶定向进化的应用
提高酶的催化效率 增加酶的稳定性 改变酶的底物特异性
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化
酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+定向选择。
酶基因随机突变 构建突变基因组定向筛选4.6.3 酶基因的随机突变 1、易错PCR技术为代表的无性进化 无性突变：向单一酶分子基因内随机引入突变， 制造突变酶库以便筛选。 易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条库，在人工控制条件的特殊环境下，定向
选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技 术过程。 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的 空间结构和催化机制。
4.6.1 定向进化的特点 适应面广； 目的性强； 效果显著。
4.6.2 定向进化的原理 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
DNA改组原理
DNA改组技术 特点：正突变频率高，进化速度快。 注意：需多次进行。
3、基因家族之间的同源重组 从自然界中存在的基因家族出发，利用它 们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。 如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌
素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同
源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中， 对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用 家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生 物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高变基因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 质量要求：包容性和完整性 过程：
质粒
载体选择 基因重组
噬菌体DNA形成基因黏粒载体 转化 噬菌粒载体 转导
2、突变基因的筛选
（1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术