琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
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的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml 电泳缓冲液（1×TAE）。 ❖ 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 ❖ 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终 浓度为0.5 g/ml)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上， 检查有无气泡。
❖ 6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝 固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将 凝胶放入电泳槽中。
❖ 8.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中, 在吸附膜的中间部位加25μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效 果更好）,室温放置2分钟,12,000 rpm 离心1 分钟。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液 重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。
❖ 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电 流）回零，关闭电源，停止电泳。
❖ 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
❖ 13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中， 放于4℃保存，以备下实验用。
PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
❖ 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实 验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观 察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围 很广。
➢ 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
➢ DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质 量的对数成反比。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
❖ 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 ❖ 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法
实验原理
❖ 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技 术。根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺电泳。
➢ 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据 DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子 量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
❖ 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动 时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化 乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化 乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA 的含量，这样就可以检测DNA的浓度。
❖ 如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入300μl溶胶液。
❖ 4．56℃水浴放置5分钟（或直至胶完全溶 解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
❖ 5．将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放 入收集管中）, 12,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集 管中的废液。
❖ 如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附 柱AC中。
❖ 6．加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无 水乙醇!）,12,000 rpm 离心1分钟,弃掉废液。
❖ 7．加入500μl漂洗液WB 12,000 rpm 离心1分钟,弃 掉废液。
❖ 8．将吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm离心2 分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制 下游反应。
❖ 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中， 使液面高于胶面约1mm。
❖ 8.在DNA样品中加入2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩 一下，使溶液都处于离心管底。
❖ 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳
孔中。
❖ 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法 几点注意事项：
❖ 1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带 型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的 溶液，以赶走样品空中的气泡。
❖ 2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的 大小、数目及样品孔形状与容量。
❖ 3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以 免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影 响结果分析。
注意事项：
❖ EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染 环境。
❖ 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样 品不能污ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 ❖ 1. 水平式凝胶电泳槽 ❖ 2. 稳压电泳仪 ❖ 3. 电炉 ❖ 4. 紫外检测仪 ❖ 5. 台式离心机
（二） 材料 ❖ 实验一中的PCR产物
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间， 在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般 >5ng。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
实验步骤：琼脂糖凝胶制备
❖ 1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 ❖ 2. 插好挡板、梳子。 ❖ 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
❖ 1．在长波紫外灯下,用干净刀片将所需回收 的DNA条带切下,尽量切除不含DNA的凝胶, 得到凝胶体积越小越好。
❖ 2．将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心 管,称重。
❖ 先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次, 两次重量相减,得到凝胶的重量。
❖ 3. 加三倍体积溶胶/结合液DB。
❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 ❖ 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
➢ DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
❖ 此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：
❖ 1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观 察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。
❖ ２.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与 DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成 靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含 量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法 是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45 分钟。
❖ ３.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2） 比正极气泡（O2）多一倍。
复习思考题
❖ 问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理。
用多功能DNA纯化回收试剂盒 （离心柱型）回收DNA
❖ 在高浓度盐离子存在的情况下,DNA片断选择 性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一 系列快速的漂洗－离心的步骤去蛋白液和漂 洗液将引物,核苷酸,蛋白酶等杂质去除,最后 低盐,高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅 基质膜上洗脱。
（三） 试剂
❖ 1.琼脂糖 ❖ 2. TAE电泳缓冲液(50×) （pH8.0）
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml ❖ 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色 瓶或铝铂纸包装保存。 ❖ 4. 10×DNA样品上样缓冲液
核酸染色剂
❖ 6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝 固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将 凝胶放入电泳槽中。
❖ 8.取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中, 在吸附膜的中间部位加25μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效 果更好）,室温放置2分钟,12,000 rpm 离心1 分钟。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液 重新加入离心吸附柱中,离心1分钟。
❖ 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电 流）回零，关闭电源，停止电泳。
❖ 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
❖ 13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中， 放于4℃保存，以备下实验用。
PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳
使用3 mg的DNA Marker DL 2,000（500 ng/条带）进行1% 的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb， 750bp，500bp，250bp，100bp。
❖ 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实 验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观 察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围 很广。
➢ 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
➢ DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用 下向正极泳动。DNA分子的迁移速度与相对分子质 量的对数成反比。
实验二 琼脂糖凝 胶电泳检测PCR产物
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果及讨论
实验目的
❖ 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 ❖ 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法
实验原理
❖ 凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技 术。根据制备凝胶的材料，分为琼脂糖电泳 和聚丙烯酰胺电泳。
➢ 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系，可依据 DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子 量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。
❖ 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当 DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动 时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化 乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物， 使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化 乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA 的含量，这样就可以检测DNA的浓度。
❖ 如果凝胶重为0.1g,其体积可视为100μl,则加入300μl溶胶液。
❖ 4．56℃水浴放置5分钟（或直至胶完全溶 解）。每2-3分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解。
❖ 5．将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放 入收集管中）, 12,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集 管中的废液。
❖ 如果总体积超过750μl，可分两次将溶液加入同一个吸附 柱AC中。
❖ 6．加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无 水乙醇!）,12,000 rpm 离心1分钟,弃掉废液。
❖ 7．加入500μl漂洗液WB 12,000 rpm 离心1分钟,弃 掉废液。
❖ 8．将吸附柱AC放回空收集管中,12,000 rpm离心2 分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制 下游反应。
❖ 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中， 使液面高于胶面约1mm。
❖ 8.在DNA样品中加入2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩 一下，使溶液都处于离心管底。
❖ 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳
孔中。
❖ 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节 电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳 槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。
关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法 几点注意事项：
❖ 1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带 型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的 溶液，以赶走样品空中的气泡。
❖ 2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的 大小、数目及样品孔形状与容量。
❖ 3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以 免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影 响结果分析。
注意事项：
❖ EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染 环境。
❖ 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样 品不能污ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
实验仪器、材料与试剂
（一） 仪器 ❖ 1. 水平式凝胶电泳槽 ❖ 2. 稳压电泳仪 ❖ 3. 电炉 ❖ 4. 紫外检测仪 ❖ 5. 台式离心机
（二） 材料 ❖ 实验一中的PCR产物
溴化乙锭（EB）
是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间， 在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含 量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般 >5ng。
注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一 般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。
作用： ①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 ②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 ③使样品呈色，使加样操作更方便。
实验步骤：琼脂糖凝胶制备
❖ 1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 ❖ 2. 插好挡板、梳子。 ❖ 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶
❖ 1．在长波紫外灯下,用干净刀片将所需回收 的DNA条带切下,尽量切除不含DNA的凝胶, 得到凝胶体积越小越好。
❖ 2．将切下含有DNA条带凝胶放入1.5ml离心 管,称重。
❖ 先称一个空1.5ml离心管重量,然后放入凝胶块后再称一次, 两次重量相减,得到凝胶的重量。
❖ 3. 加三倍体积溶胶/结合液DB。
❖ 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 ❖ 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分子的分离范围 (Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
➢ DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
❖ 此外在琼脂糖凝胶电泳中其它注意事项还有：
❖ 1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观 察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降。
❖ ２.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与 DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成 靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含 量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法 是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45 分钟。
❖ ３.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2） 比正极气泡（O2）多一倍。
复习思考题
❖ 问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理。
用多功能DNA纯化回收试剂盒 （离心柱型）回收DNA
❖ 在高浓度盐离子存在的情况下,DNA片断选择 性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一 系列快速的漂洗－离心的步骤去蛋白液和漂 洗液将引物,核苷酸,蛋白酶等杂质去除,最后 低盐,高PH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅 基质膜上洗脱。
（三） 试剂
❖ 1.琼脂糖 ❖ 2. TAE电泳缓冲液(50×) （pH8.0）
Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml ❖ 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色 瓶或铝铂纸包装保存。 ❖ 4. 10×DNA样品上样缓冲液
核酸染色剂