12 沉淀法

2.1 盐析的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－
NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互
作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm ～
100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用 力。 蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白 质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也
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基本原理与沉淀类型
沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液 中的溶质由液相转变为固相析出的过程。 它是古老、实用、简单的初步分离的方法，该 法成本低、操作简单，不仅用于实验室中，也用于 某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子 ，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相，而与杂质得到初步的分离。
下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～ 4℃下操作，以避免活力丧失。
温度的影响
p
4）离子强度和种类的影响
无机盐种类的影响
不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠
1.2 几种沉淀方法：
（1）盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
（2）有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生 物小分子的分离纯化。 （3） 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 （4）非离子型聚合物沉淀法:用于生物大分子分离。 （5）选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除 去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 （6）有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使 用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
3.2 有机溶剂的选择和浓度的计算
用于生物物质沉淀的有机溶剂的选择首先是要 能与水互溶，但与蛋白质无相互作用。沉淀蛋白质 和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液 体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积 的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
有机溶剂的选择和浓度的计算
②透析液选择 一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓 冲液。对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加
入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生
物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加 0.02％NaN3。
③掌握透析时间
透析操作在搅拌下进行时，样品液与透析体
积之比以l：10较好，一般3h可达平衡。若透析
非 机 械 法
第12章 沉淀法
本章内容
1. 基本原理与沉淀类型;
2. 盐析法;
3. 有机溶剂沉淀法;
4. 等电点发;
5. 聚乙二醇沉淀法;
6. 选择性沉淀法;
7. 结晶法.
知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀 法等方法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法
。
重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用 范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并 能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。
越大。
盐析的基本原理（续）
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和 水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的 亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，
破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷
，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析 示意图如下页图 所示。
2.2 盐析的Cohn方程式
C．透析法：
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大 体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液 中的盐浓度。
此法的盐浓度是以连续状态变化的，可以避
免盐浓度局部升高产生的不良影响，所以分离效 果好。但是，在实际应用过程由于受透析袋容积
有限、盐析速度缓慢和硫酸铵耗费多等因子的制
约，所以此法仅在要求较精确、样品体积小的试
后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离
心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法。
其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好 pH的饱 和硫酸铵溶液，
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对
于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入
，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达到 50 ％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
log S Ksm
m-盐的摩尔数
2.3 盐分级沉淀
（1）盐的选择
一般进行蛋白质沉淀时，常选用的是硫酸铵。因
为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，具以 下优点： ①溶解度大，对温度不敏感，当水的温度是25℃ 时，硫酸铵的饱和溶解度为769g(其摩尔浓度为4.1
mol／L)，当水的温度降至0℃时，其饱和溶解度高达
破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是： ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶 质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可 用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛 的应用。 其缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引 起变性失活，操作需在低温下进行。
2．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度 会随盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定
数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出
(盐析)。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有
八十多年的历史，其突出的优点是：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
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1.1 基本原理
基本原理与沉淀类型
沉淀法纯化生命大分子物质的基本原理:根据各 种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团与 亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质 (如pH、极性、离子强度、金属离子等)，使抽提液 中的有效成分的溶解度发生变化。 因此，选择适当的溶液就能使欲分离的有效成 分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或 者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最 大溶解度。
如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱 和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱 和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。
名 称 沉 淀 效 果（25℃） 硫酸铵饱和度/% 0—25 25—35 35—45 45—55 55—65 沉淀物的酶活力单位/U 0 112 6850 3020 27
I-离子强度，等于 mi-离子i的摩尔数；
1 2 miZ i 2
Zi-所带电荷。
盐析的Cohn方程式
当温度一定时，S0对于某一溶质是一个常数，即
log S0
因此可以得到log : S KsI
式中β值的大小取决于溶质的性质，不可能直接 测定，是假定溶解度在I=0时，用外推法求出的。 带有经验性质。 为了计算方便一般用浓度代替离子强度：
硫酸铵加入量的确定
①、计算法
X=G（p2-p1）/1-Ap2
X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数； G为经验常数，0℃ A为常数 0 ℃ 515，20 ℃ 0.27 20 ℃ 513 0.29
P2、P1为初始和最终溶液的饱和度
②、查表法
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全
20℃
75.4 18.9 7.8
80℃
95.3 43.3 93.8
100 ℃
103 42.2 101
②分级效果好，有些抽提液经过加适量的硫酸铵一 步分级沉淀处理后，就可除去杂蛋白75％以上； ③有稳定蛋白质结构的作用，将2-3 mol／L硫酸铵 盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化 ④价格低廉，废液可以肥田。
在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到 1：
20以上。脱盐是否彻底，要经常检查：如除去的 是硫酸铵，可用10％氯化钡检查；如除去的是氯 化钠，可用10％硝酸银检查，直到透析液中检测 不出硫酸钡或氯化银沉淀为止，即透析已完成。
3 、有机溶剂沉淀法
3.1 基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多
验使用。
2.4 盐析的影响因素 1) 蛋白质的浓度：
不同蛋白质的溶解度曲线
高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，
若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀
作用。 低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降 低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当 于25 mg/mL～30mg/mL。
盐析的影响因素
2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小， pH值 常选在该蛋白质的等电点附近。
pH对β的影响
盐析的影响因素
3) 温度的影响： 对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子
强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。
在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多
数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温
679g(其摩尔浓度为3.9mol／L) 这是其他盐类所不具 备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而 盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。
由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远 远高于其它盐类：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
（NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4 70.6 4.9 1.6
高浓度的中性盐能够促使蛋白质等发生沉淀或
絮凝现象。蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可用
Cohn方程式来表示：
S log KS . I S0
式中：S-离子强度I时的蛋白质的溶解度（g/L) So-纯溶剂（即I=0）时，蛋白质的溶解度(g/L) KS-盐析常数，与温度和pH无关