12 沉淀法

log S Ksm
m-盐的摩尔数
2.3 盐分级沉淀
（1）盐的选择
一般进行蛋白质沉淀时，常选用的是硫酸铵。因
为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，具以 下优点： ①溶解度大，对温度不敏感，当水的温度是25℃ 时，硫酸铵的饱和溶解度为769g(其摩尔浓度为4.1
mol／L)，当水的温度降至0℃时，其饱和溶解度高达
糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早
使用的沉淀方法之一。
有机溶剂沉淀原理图
①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶
剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削
弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋 白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水 的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，
I-离子强度，等于 mi-离子i的摩尔数；
1 2 miZ i 2
Zi-所带电荷。
盐析的Cohn方程式
当温度一定时，S0对于某一溶质是一个常数，即
log S0
因此可以得到log : S KsI
式中β值的大小取决于溶质的性质，不可能直接 测定，是假定溶解度在I=0时，用外推法求出的。 带有经验性质。 为了计算方便一般用浓度代替离子强度：
在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到 1：
20以上。脱盐是否彻底，要经常检查：如除去的 是硫酸铵，可用10％氯化钡检查；如除去的是氯 化钠，可用10％硝酸银检查，直到透析液中检测 不出硫酸钡或氯化银沉淀为止，即透析已完成。
3 、有机溶剂沉淀法
3.1 基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多
验使用。
2.4 盐析的影响因素 1) 蛋白质的浓度：
不同蛋白质的溶解度曲线
高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，
若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀
作用。 低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降 低。较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当 于25 mg/mL～30mg/mL。
盐析的影响因素
C．透析法：
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大 体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液 中的盐浓度。
此法的盐浓度是以连续状态变化的，可以避
免盐浓度局部升高产生的不良影响，所以分离效 果好。但是，在实际应用过程由于受透析袋容积
有限、盐析速度缓慢和硫酸铵耗费多等因子的制
约，所以此法仅在要求较精确、样品体积小的试
硫酸铵加入量的确定
①、计算法
X=G（p2-p1）/1-Ap2
X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数； G为经验常数，0℃ A为常数 0 ℃ 515，20 ℃ 0.27 20 ℃ 513 0.29
P2、P1为初始和最终溶液的饱和度
②、查表法
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全
高浓度的中性盐能够促使蛋白质等发生沉淀或
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絮凝现象。蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可用
Cohn方程式来表示：
S log KS . I S0
式中：S-离子强度I时的蛋白质的溶解度（g/L) So-纯溶剂（即I=0）时，蛋白质的溶解度(g/L) KS-盐析常数，与温度和pH无关
盐析的Cohn方程式
如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱 和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱 和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。
名 称 沉 淀 效 果（25℃） 硫酸铵饱和度/% 0—25 25—35 35—45 45—55 55—65 沉淀物的酶活力单位/U 0 112 6850 3020 27
679g(其摩尔浓度为3.9mol／L) 这是其他盐类所不具 备的。 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而 盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。
由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远 远高于其它盐类：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
（NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4 70.6 4.9 1.6
1.2 几种沉淀方法：
（1）盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
（2）有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生 物小分子的分离纯化。 （3） 等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 （4）非离子型聚合物沉淀法:用于生物大分子分离。 （5）选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除 去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 （6）有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使 用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
使溶液中溶质沉淀需要达到一定的有机溶 剂浓度，所需有机溶剂浓度和体积的计算按照 如下公式： S2－ S1 V＝ V0 100－ S2 式中： V-所需100%浓度的有机溶剂； V0-需沉淀的原溶液体积； S1-原溶液中有机溶剂的浓度； S2-要求达到的有机溶剂浓度
破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是： ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶 质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可 用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛 的应用。 其缺点：对某些具有生物活性的大分子容易引 起变性失活，操作需在低温下进行。
下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～ 4℃下操作，以避免活力丧失。
温度的影响
p
4）离子强度和种类的影响
无机盐种类的影响
不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl; (◘)MgSO4; (▲)NH4)SO4; (●)Na2SO4; (□)K2SO4; (■)柠檬酸三钠
2.5 脱盐
常用的脱盐方法是透析法和凝胶过滤法。在透
析操作时，必须注意以下几点：
①透析袋处理：市场购买的透析袋(或透析纸)
要用蒸馏水洗净，严格检查，无漏洞时，即可使用
。
样品中所含盐类易被金属或水解酶等破坏之时 ，透析袋需要用下列方法处理：
将10cm长的透析袋置500ml含lmmol／L EDTANa2的2％碳酸氢钠溶液中煮沸10min，用干净镊子 或戴橡皮手套取出，经蒸馏水煮沸、漂洗后，即可 使用。
②透析液选择 一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓 冲液。对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加
入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生
物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加 0.02％NaN3。
③掌握透析时间
透析操作在搅拌下进行时，样品液与透析体
积之比以l：10较好，一般3h可达平衡。若透析
3.2 有机溶剂的选择和浓度的计算
用于生物物质沉淀的有机溶剂的选择首先是要 能与水互溶，但与蛋白质无相互作用。沉淀蛋白质 和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液 体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积 的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
有机溶剂的选择和浓度的计算
20℃
75.4 18.9 7.8
80℃
95.3 43.3 93.8
100 ℃
103 42.2 101
②分级效果好，有些抽提液经过加适量的硫酸铵一 步分级沉淀处理后，就可除去杂蛋白75％以上； ③有稳定蛋白质结构的作用，将2-3 mol／L硫酸铵 盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化 ④价格低廉，废液可以肥田。
2.1 盐析的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－
NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互
作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1nm ～
100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用 力。 蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白 质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也
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基本原理与沉淀类型
沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液 中的溶质由液相转变为固相析出的过程。 它是古老、实用、简单的初步分离的方法，该 法成本低、操作简单，不仅用于实验室中，也用于 某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子 ，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或 留在液相，而与杂质得到初步的分离。
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1.1 基本原理
基本原理与沉淀类型
沉淀法纯化生命大分子物质的基本原理:根据各 种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团与 亲水基团之间比例的差异）来改变溶液的某些性质 (如pH、极性、离子强度、金属离子等)，使抽提液 中的有效成分的溶解度发生变化。 因此，选择适当的溶液就能使欲分离的有效成 分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或 者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最 大溶解度。
2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小， pH值 常选在该蛋白质的等电点附近。
pH对β的影响
盐析的影响因素
3) 温度的影响： 对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子
强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。
在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多
数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温
但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一 个共同的缺点，即得到的样品欲继续纯化时，需花 一定时间脱盐。
（ 2）
硫酸铵盐析
A．固体法：最常用的是固体硫酸铵加入法。 将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加 入粗制品溶液中，接近计划饱和度时，加盐的速 度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而 造成不应有的蛋白质沉淀。 在此过程中，溶液中的硫酸铵的浓度会不断提 高，水分子会不断与硫酸铵结合，当加入的硫酸 铵使溶液浓度达到“盐析点”时，蛋白质就沉淀 出来。
后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离
心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法。
其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好 pH的饱 和硫酸铵溶液，
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对
于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入
，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达到 50 ％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
2．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度 会随盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定
数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出
(盐析)。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有
八十多年的历史，其突出的优点是：
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
常用破碎方法
分 机 械 法 适 应 性 可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困 难 高压匀浆 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不 法 适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧 法 烈，不适合大规模操作 X-press法 固体剪切作用 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合 酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易 分离，溶酶价格高，通用性差 化学渗透 改变细胞膜的渗透 具一定选择性，浆液易分离，但释放 法 性 率较低，通用性差 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用 冻结融化 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的 法 产物 干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失 活 类 珠磨法 作 用 机 理 固体剪切作用
非 机 械 法
第12章 沉淀法
本章内容
1. 基本原理与沉淀类型;
2. 盐析法;
3. 有机溶剂沉淀法;
4. 等电点发;
5. 聚乙二醇沉淀法;
6. 选择性沉淀法;
7. 结晶法.
知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂 沉淀 法等方法，选择性变性沉淀法，金属离子沉淀法
。
重点：上述几种沉淀方法的概念、原理及其适用 范围；盐析法的影响因素对沉淀效果的影响，并 能根据实际情况予以灵活应用和选择。 难点：常用沉淀方法的灵活运用。
越大。
盐析的基本原理（续）
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和 水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的 亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，
破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷
，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析 示意图如下页图 所示。
2.2 盐析的Cohn方程式