第二次实验rtpcr技术ppt课件
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基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技术 ppt课件
OD260/OD280在1.8~2.0之间 ，比值越低，混有蛋白质污染。 OD260/OD230在2.0~2.5之间 ，若比值小于2，说明有残余的盐存在； OD230/OD260在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在 。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
• 乙醇：主要目的是：沉淀+除盐；洗涤异丙醇，也可以溶解一部分
蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA浓度和纯度的测定
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，因为酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰在 280nm附近，而大多数蛋白含有酪氨酸和色氨酸残基，且含量相对恒定。 盐和小分子则集中在230nm处， 320nm或340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0。
“Measure”
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA提取常见问题及分析
得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 28S的亮度是18S的2倍左右 • rRNA占总RNA80%以上。
5lRNA+1ul loading buffer，100V电泳10分钟
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
• 乙醇：主要目的是：沉淀+除盐；洗涤异丙醇，也可以溶解一部分
蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA浓度和纯度的测定
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，因为酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰在 280nm附近，而大多数蛋白含有酪氨酸和色氨酸残基，且含量相对恒定。 盐和小分子则集中在230nm处， 320nm或340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0。
“Measure”
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA提取常见问题及分析
得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 28S的亮度是18S的2倍左右 • rRNA占总RNA80%以上。
5lRNA+1ul loading buffer，100V电泳10分钟
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RTPCR(共47张PPT)
大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
上机操作
点击
运行程序
保存
结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
25
实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值
Ct值的定义：
PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经 过的扩增循环次数
C(t) value
纵轴：荧光信号量
实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
EXON 1 EXON 1
INTRON 2 EXON 2
EXON 2
DNA RNA
PRIMER PREMIER 5.0
上机操作
点击
运行程序
保存
结果分析
难以查找原因。
• Buffer and dNTPs Ex：扩增效率
实时荧光定量PCR定义
• Template
cDNA
Real-time PCR
Real-time PCR
引物设计
• 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 • 尽量小些 （70 - 300bp) • 目标区段位置：考虑目标剪接体 • 推荐做跨intron设计
实时荧光定量PCR法
染料法举例
SYBR Green法研究CDK6 在
肺癌组织标本中的表达差异
实验步骤
流程示意图
TaqMan法举例
材料准备
从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA
-Trizol 最常用 -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮
-RNA保存液
小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材
TaqMan法
优缺点
25
实时荧光定量PCR原理 相对定量
以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆，
RTPCR实验报告课件
逆转录pcrrt-pcr）和及时为反转录rcr （ reverse transcription pcrpcr （ real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr ，或许称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反响 (pcr) 中，一条 rna 链被逆转录成为互补 dna ，再以此为模板经过的一种宽泛应用的变形。
在pcr 进行dna 扩增。
rt-pcr由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录” ，由依靠rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来达成。
随后，dna 的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠rna 的dna 聚合酶达成，随每个循环倍增，即往常的pcr 。
原来的rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术，于遗传病的诊疗，并且能够用于定量监测某种rna 模板被rna 酶 h 降解，留下互补dna 。
能够检测很低拷贝数的rna 。
rt-pcr宽泛应用rna的含量。
（检测基因表达的方法，拜见northern blot 法。
）rt-pcr 作“ 定量有时也会指代及时pcr ” (quantitative pcr)pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录或许rtq-pcr(real-time quantitative pcr)pcr 相差别，往常被写。
及时pcr及时为基础进行pcr(real-time pcr)dna 的定量剖析。
，属于定量pcrreal time pcr（ q-pcr）的一种，以一准时间内dna 的增幅量的定量使用萤光色素，当前有二种方法。
一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相联合的一种萤光探针（probe ）。
real time pcr 与reverse transcription pcr 相联合，能用微量的rna 来找出特准时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
RTPCR
TaqMan法优缺点 优点
对目标序列的高特异性 --阴性结果确定 引物设计相对简单 重复性比较好
缺点
只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高
提 纲：
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
两种定量目标
两种定量的不同方法
绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，
SYBR Green 熔解曲线分析
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光，定量 准确
非特异性产 物
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
PCR反应体系的建立及优化
SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光 信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同
由酶和引物决定其他与常规pcr相同sybrgreen法优缺点对dna模板没有选择性适用于任何dna使用方便不必设计复杂探针非常灵敏便宜容易与非特异性双链dna结合产生假阳性但可以通过融解曲线的分析优化反应条件对引物特异性要求较高与目标序列互补方法2taqman法taqman水解型杂交探针5端标记有报告基团reporter如famvic等3端标记有荧光淬灭基团quencher探针完整r所发射的荧光能量被q基团吸收无荧光r与q分开发荧光taq酶有53外切核酸酶活性可水解探针taqman法工作原理每扩增一条dna分子释放一个荧光信号taqman法pcr反应的建1引物探针的设计
SYBR Green法优缺点
优点
对DNA模板没有选择性 --适用于任何DNA 使用方便 --不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件 对引物特异性要求较高
PCR技术及其应用ppt课件
2）循环参数
(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链
94℃， 30-60秒 (2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
引物设计：
Tm =（G+C）x 4 + （A+T）x 2
（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源
序列。
（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。
（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
（4）dNTP（10mM or 2.5mM ）
含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理 后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
精品ppt
B.阴性对照
19
C.原位检测mRNA表达
荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达 水平
通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对 PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合 相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初 始模板量。
25
二、实验材料、仪器和试剂
1、材料：含0.3Kb插入片段的克PCR管
琼脂糖凝胶电泳设备
3、试剂：10XPCR 反应缓冲液
25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP
10μmol/L 引物1和引物2
精品ppt
26
基因表达检测RTPCR-PPT课件
Total RNA
3l (2-5g)
RNase-free DNase
１l (１u / l)
10× DNase buffer
1 l
add DEPC-treated ddH2O
5 l
4. Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min.
操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction
鼠白血病毒反转录酶 M-MLV：
单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性 （或RNase H－），最适反应条件：37 °C, pH8.3,
禽成髓细胞反转录酶 AMV
2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNase H活 性，最适反应条件41-45 °C，pH8.3比pH7.6活 性高
RNase H： 催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同 链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核苷酸。
3. 检测 0.5×TBE
电泳
In 1× MOPS 80 —150V 40 min —1h30min
有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA 在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由 tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较 快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是 18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。
水冲洗）；
防止外源RNase污染的主要措施(二）：
5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻 璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品 使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话， 用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在 15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
rtpcr详细图文解析讲课讲稿
RT-PCR详细图文解析一、实时荧光定量PCR原理（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析3、如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3、MgCl2的浓度:可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物4、反应Buffer 体系的优化5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；2、基因型的分析；3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
《RTPCR技术原理》课件
RTPCR技术原理
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
RTPCR是一种常用的遗传学分析技术，通过在实验室中模拟自然界的PCR过 程，扩增DNA片段，从而实现对基因的分析和研究。
RTPCR技术原理
什么是RTPCR技术
RTPCR技术是一种基于PCR扩增原理开发而来的遗传学分析方法，可以高效地复制和研究 DNA序列。
RTPCR技术的优点
RTPCR技术具有高灵敏度、高特异性、高通量和快速等优点，成为现代分子生物学研究中 不可或缺的工具。
RTPCR技术利用PCR反应中的循环式 扩增机制，快速复制目标DNA序列， 从而使其在检测中能够得到可靠的结 果。
RTPCR技术原理
RTPCR技术的应用领 域
RTPCR技术在医学领域被 广泛应用于疾病诊断、遗 传性疾病筛查、药物研发 等方面。
RTPCR在食品安全领 域的应用
RTPCR技术可以用于检测 食品中的致病菌、转基因 成分、有害物质等，保障 食品安全。
RTPCR技术原理
1
RTPCR反应体系组成
2
RTPCR反应体系包括RNA、逆转录酶、
引物、酶、核酸酶和缓冲液等多种组
分，以保证反应的高效、特异性和稳
3
Байду номын сангаас
定性。
RTPCR流程介绍
RTPCR技术包括反转录和PCR两个基 本步骤，通过这两个步骤可以将RNA 转录为cDNA并扩增目标DNA序列。
RTPCR放大机制
2 RTPCR技术的发展趋势
RTPCR技术将更加智能化、快速化、低成本化，实现更高效的基因分析和诊断。
3 RTPCR技术的未来应用简述
RTPCR技术有望在个性化医疗、精准农业和环境污染治理等领域得到更广泛的应用。
RTPCR技术原理
《RTPCR技术原理》课件
缺点
对操作人员要求较高
RTPCR技术的操作较为复杂，需要经过专 业培训的操作人员才能保证结果的准确性
。
成本较高
RTPCR技术需要昂贵的仪器和试剂 ，导致检测成本较高，可能限制其
在资源有限地区的普及。
A
B
C
D
可能出现交叉污染
在操作过程中，如果样品或试剂受到污染 ，可能会导致交叉污染，影响检测结果的 准确性。
《rtpcr技术原理》ppt课 件
目录 CONTENT
• RTPCR技术概述 • RTPCR技术原理 • RTPCR实验操作流程 • RTPCR技术的优缺点 • RTPCR技术的应用实例
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术定义
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号 检测DNA片段的扩增情况，并实时监测其变化的技术。
2000年
ABI公司推出高分辨率熔解曲线分析 技术，提高了SNP分型和突变检测的 准确性。
2004年
基于焦磷酸测序原理的实时荧光定量 PCR技术问世，提高了检测通量和灵 敏度。
RTPCR技术的应用领域
基因表达分析
突变检测
通过比较不同组织或不同处理条件下基因 的表达水平，研究基因的表达调控机制。
用于检测DNA序列中的点突变、插入和缺 失等变异，用于遗传病、肿瘤等疾病的诊 断和监测。
基因突变检测
总结词
RTPCR技术能够高效地检测基因突变，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。
详细描述
基因突变是许多遗传性疾病的诱因，RTPCR技术通过对特定基因的扩增和荧光 检测，能够快速、准确地检测出基因突变位点及类型。这有助于遗传性疾病的 早期诊断和针对性治疗，为患者提供更好的医疗方案。
PCR技术简介-PPT课件
2 ul
4 ul 2 ul 0.4ul 0.4ul 0.4ul 3.8ul 1 ul 1 ul 5 ul
RT-PCR反应体系
两步法RT-PCR
Components
Volume(µ l)
Components
RNA 5xR.T.buffer dNTPs(10mmol/L)
Primer Rnasin(50U/µ l) AMV-RT((10U/µ l)
目的基因的克隆 基因的体外突变 生成大量DNA以进行序列测定 特异基因表达量分析
PCR反应体系
20ul；25ul；50ul
10× PCR Buffer Mg2+ dNTPs 引物1 引物2 模板 Taq酶 ddH2O
浓度
1.5mmol/L 200umol/L
10pmol 10pmol 0.1～2ug
PCR实验准备--仪器、耗材
PCR仪 移液器 吸头 200ul PCR管 反应程序
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通 常4 l/50 l ） Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、 PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特 异性
PCR实验准备—试剂
PCR技术与方法 PPT课件
5`tgaattctcaga gctgaaggta3` 3`末端为a，应避免 gaattc 为EcoRI酶切位点
引物设计原则
3.GC的合理含量： •G+C含量一般为40%-60%
•Tm = 4（G+C）+2（A+T）
•引物Tm值与退火温度有关，Tm 最好在55~80º C之间，以接近72º C为
好。
（二）重组PCR（recombitant PCR, RPCR)
为了研究基因功能，有时需要将两个不 同的基因融合在一起产生重组体。 PCR 技术用于构建重组体的方法称重组PCR。
35
重组PCR
引物x的5`部分与引物y的5`部分互补
了研究基因功能，有时生重组体。 PCR技 y 术用于构建重组体的方法称重组PCR。
引物浓度
• 两条引物一般各在0.1~0.5μmol/L, 浓度太 高会引起错配及非特异性产物扩增，增 加形成引物二聚体的几率；太低则可能 达不到扩增效果或产量太低。
引物合成的质量
• 引物一般经PAGE或HPLC纯化，以减少 非特异扩增和信号强度. • 冻干引物可以常温下运输，-20º C可以保 存12~24个月，甚至更长，液体状态于 -20º C可以保存6个月或更长
gagattttgg aagtggcttt gaagaaagca gcaagtcaca caaggaggat
acatctctac tacctgggct ccctcagcca cctcctgtca cttccccacc cctggctgga ggcagcacca cagaagatcc tagaacagaa 3` 3`ccgtcgtggt gtcttctagg5` GC%=60
x
5` 3` 3` 5`
引物设计原则
3.GC的合理含量： •G+C含量一般为40%-60%
•Tm = 4（G+C）+2（A+T）
•引物Tm值与退火温度有关，Tm 最好在55~80º C之间，以接近72º C为
好。
（二）重组PCR（recombitant PCR, RPCR)
为了研究基因功能，有时需要将两个不 同的基因融合在一起产生重组体。 PCR 技术用于构建重组体的方法称重组PCR。
35
重组PCR
引物x的5`部分与引物y的5`部分互补
了研究基因功能，有时生重组体。 PCR技 y 术用于构建重组体的方法称重组PCR。
引物浓度
• 两条引物一般各在0.1~0.5μmol/L, 浓度太 高会引起错配及非特异性产物扩增，增 加形成引物二聚体的几率；太低则可能 达不到扩增效果或产量太低。
引物合成的质量
• 引物一般经PAGE或HPLC纯化，以减少 非特异扩增和信号强度. • 冻干引物可以常温下运输，-20º C可以保 存12~24个月，甚至更长，液体状态于 -20º C可以保存6个月或更长
gagattttgg aagtggcttt gaagaaagca gcaagtcaca caaggaggat
acatctctac tacctgggct ccctcagcca cctcctgtca cttccccacc cctggctgga ggcagcacca cagaagatcc tagaacagaa 3` 3`ccgtcgtggt gtcttctagg5` GC%=60
x
5` 3` 3` 5`
RTPCR常见问题分析ppt课件
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问题五：信号高于预期，在低 于预期的循环中即可检出产物?
1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试
剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备 反应，使用抗气溶胶的吸头。
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问题六：电泳后出现意外的条带 RNA?
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1.引物和模版 的非特异性 退火
对策
1.避免引物3’端含有2 个到3个dG或dC’
2.在第一链合成中使用 基因特异性引物，而 不是随即引物或 oligo(dT)。
3.在开始几个循环使用 较高的退火温度，然 后使用较低的退火温 度。
4.使用热启动Taq DNA 酶进行PCR，提高反 应的特异性。
火的GSP;对于>1kb的RT-
PCR产物，保持反应温 度≤65℃。不要在高于 37℃时使用M-MLV;如 果不需要全长cDNA， 在第一链反应中使用
随机引物;
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7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感
8.靶序列在分 析的组织中不 表达
9.PCR没有起 作用
在PCR前用RNaseH处理。
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问题九： 扩增产物滞留在加样 孔中
有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了 高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少 稀释100倍再进行二次扩增。
另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物 的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行 热启动以提高特异性
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Thank You!
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High specificity
HAV
HBV
HCV
HDV
HBV HPCBRV HBV
HBV
HBV HBV
HBV HBV
HBV
HBV HBV HBV
HBV
HBV
HBV
HBV
引物设计的原则
引物长度：15-30bp 引物中碱基分布：尽可能随机分布，G+C占
45%～55% 引物自身不能互补 引物之间不能互补 引物与非扩增区同源性<70%，3‘末端连续8
3 Principles of PCR
Denaturation 95℃
高温变性 低温退火 适温延伸 循环25-30次
Elongation 72 ℃
Annealing 60℃
Template DNA
5 5
The 1st cycle
5
5
5
5
5
Primer 1
5 Primer 2
Denaturation 95℃
美国黄石国家公园
6. Standard PCR reaction:
• design the reaction system
Target gene : β-actin Primer 1: 5’ATGGGTCAGAAGGACTCCTATC 3’ Primer 2: 5’ATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAG 3’ The length of DNA fragment: 530bp
Elongation 72 ℃
Annealing 60℃
Template DNA
5 5
The 1st cycle
5
5
5
5
5
The 2nd cycle
5
5
5
5
Primer 1
5 Primer 2
5 5 5
5
5
5
The 3th cycle
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
After 20 ~ 30 cycles, the original DNA can be amplified millions-fold.
Target Sequence
DNA
Primer 2
Primer 1
DNA聚合酶（DNA polymerase）
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow片段； 耐热DNA聚合酶 ?
耐热DNA聚合酶(Taq DNA pol)，来自 Thermus aquaticus， 在95℃的半衰期 为 1.6 小时。
指数扩增期
平台期
到达平台期所需PCR 循环次数取决于模板 拷贝数、PCR扩增效 率及DNA聚合酶的种 类及活性.
4 The Characteristics of PCR
High specificity High sensitivity Simple and rapid operation Wide applicability
(二)逆转录反应（总体积20 ul ）
RNA (1～4ug)
2 ul
Oligo dT
1 ul
DEPC处理的ddH2O
5 ul
70℃反应5分钟，迅速置于冰上5分钟
5×buffer 10mM dNTP
4 ul 4 ul
42℃预热5分钟
逆转录酶AMV RNasin
42℃水浴1小时
2 ul 2 ul
72℃水浴10分钟
总体积
(四)PCR产物电泳分析
15.5 ul 3 ul
2.5 ul 3 ul 1 ul 1 ul 3 ul 1 ul
30 ul
PCR
(Polymerase Chain Reaction)
1. What is PCR?
PCR is an in vitro method of DNA synthesis by which a particular fragment of DNA can be specifically amplified.
冰上放置备用
(三)PCR扩增（总体积30 ul ）
ddH2O 10×Buffer Mgcl2 (1.5mmol/L) dNTPs (各200umol/L) Primer 1 (10～100pmol） Primer 2 (10～100pmol) DNA 模板 (0.1～2ug) Taq DNA聚合酶（5U/ul）
特异DNA片段的体外快速大量扩增技术.
——PCR技术的发明者——
2 Background knowledge of PCR:
DNA replication DNA denaturation, renaturation &
hybridization
DNA Replication:
• DNA Replication:
个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补 引物3‘端碱基一定要与模板互补，最好选择G
和C 引物5‘端可游离十几个碱基，可进行修饰
High sensitivity
Target DNA DNA
PCR
Simple and rapid operation Wide applicability
PCR仪器设备：
Template
Hale Waihona Puke 3’5’5’
3D’NA-pol
3’
Primer dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dATP dGTP
dCTP dTTP
• DNA Denaturation & Renaturation:
Denaturation
heating
Renaturation
annealing
• Hybridization
RT-PCR
(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction)
操作
(一)细胞总RNA的提取
1、取小鼠肝脏约0.1g（约绿豆大小），置匀浆器中，加入1ml TRIzol， 充分匀浆。 2、将匀浆后样品转入Ep管，离心数秒，取250ul上清至一新Ep管中。 3、每管样品中加入50ul氯仿（萃取酚），充分振荡混匀，静置10min。 4、12000rpm×10min。 5、取上清转入新Epg管，加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。 6、12000rpm×10min。 7、弃上清，加入50ul 70%乙醇洗涤一次，自然晾干。 8、加入50ul DEPC水溶解沉淀。
自动移液器和枪头 微量离心管 PCR仪 电泳设备
5 The Composition of PCR System:
template (ng) primers （0.1-0.5umol/L） Taq DNA pol （2.5-5U） dNTP (20-200umol/L) Mg2+ （1.5-2.5 mmol/L）