巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述27页PPT

毕赤酵母开发利用历史
1969年，koichi Ogata首次报道了某些酵母菌能够利用甲醇作为 唯一碳源和能源，七十年代美国 Philips Petroleum Company成 功开发了廉价的培养基和高细胞密度方法培养甲醇营养型巴斯 德毕赤酵母（Pichia pastoris）生产单细胞蛋白作为饲料。
高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。甲 醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用。
（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe) 表达系统
只能以分裂和产孢子的方式繁殖的一类酵母， 因此定名为裂殖酵母。与前面几种酵母相比， 它具有更多的与高等真核生物相似的特性： 线 粒体结构、 启动子结构、 转录机制和对蛋白2端 酰基化功能均更接近于哺乳类细胞， 因而正逐 渐成为研究真核细胞分子生物学的模式生物， 它作为外源基因表达系统也开始受到人们的关注。 目前， 已经有多种蛋白利用此系统进行了表达， 如人蛋白凝血因子)G、 细胞色素 V6:8、 人白细 胞介素 YL’D等。此系统表达的外源蛋白更接近 于它们的天然形式 。
巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利 用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
酵母菌的形态
毕赤酵母发酵培养形态
毕赤酵母-概述
它是在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制 时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合 成双倍体。
巴斯德毕赤酵母的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需的醇 氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作 碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以 甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积80%， AOX增至细胞总蛋白的35%-40%。因此，当在AOX基因前利 用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。同 时，根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可 利用该系统表达一些毒性蛋白和易被降解的酶类，也可用以 研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等动 物类似的研究提供启示
八十年代，Philips Petroleum Company与Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc.(SIBIA, La Jolla, CA)开 始联合开发毕赤酵母系统。1985年SIBIA公司的研究人员Ellis 等首次成功分离了甲醇氧化酶基因及其启动子。同年，Cregg 等报道了巴斯德毕赤酵母作为宿主成功表达外源蛋白。
酿酒酵母优缺点
优点
不产生毒素，遗传背景清楚，安全性好， 易进行 操作
酿酒酵母是真核生物， 可以对蛋白进行翻译后加 工。
表达产物可分泌表达， 易于纯化。
来自百度文库酒酵母生长迅速， 工艺简单， 成本低。
缺点
对真核基因产物的翻译后加工与高等真核生物有 所不同， 重组蛋白常发生超糖基化。
酿酒酵母不易进行高密度发酵， 表达产物产量低。 分泌效率低， >30kD的蛋白质几乎不分泌。
该表达系统质粒易丢失， 传代不稳定。
（2）甲醇营养型酵母表达系统 甲醇营养型酵母包括汉逊酵母属(Hansenula)，毕 赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能
在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲
醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧 化酶I(AOX1)， 二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸 脱氢酶(FMD)等。 AOX1的甲醇诱导表达量可占 胞内总蛋白质的20％-30％，表明AOX1 的合成 受转录水平的调控。AOX1 启动子(PAox )具有较
4、酵母表达系统
酵母是低等真核生物，具有细胞生长快， 易于培养，遗传操作简单等原核生物的 特点，又具有真核生物对表达的蛋白质 进行正确加工，修饰，合理的空间折叠 等功能，非常有利于真核基因的表达， 能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译 后加工、修饰等不足.
几种常用酵母表达系统
（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 作为真核生物的模式菌， 酿酒酵母是目前了解最完全
毕赤酵母的优点
利用受甲醇诱导的醇氧化酶(AOX1)启动子，可严格 控制外源基因的表达
营养要求简单，生长快速，适合高密度大规模培养， 很少产生有毒物质，毒性比细菌小，用甲醇不易染菌， 可以减少污染。
的真核生物， 其全序列的测定已于 2019年完成 。 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分
子量大于30 kD 的外源蛋白质，也不能使所表达的外源 蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C 端往往被截短。 因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。 酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型 和整合型两种。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋 白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40 个以上的 甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链仅含有末端1, 3 甘 露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用 来制备亚单位疫苗(如默克乙肝疫苗、口蹄疫疫苗等)。
1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给 Research Corporation Technologies公司，并委托Invitrogea公司 进行有关产品销售。
目前毕赤酵母已成功应用于400多种外源蛋白的表达。
酵母作为外源基因表达系统与其 他系统的比较
1、大肠杆菌系统 具有产量高、成本低、生产周期短的特 点，但胞内高水平表达的外源蛋白大多 以不溶解、无活性的包涵体形式存在， 而目前由包涵体中提取高水平、高比活 的目标蛋白的最大问题是回收率极低， 大部分目标蛋白在复性过程中析出丢失。
2、杆状病毒系统
采用先瞬时感染，然后裂解感染昆虫细 胞的方式产生重组蛋白，此系统表达的 蛋白折叠正确且被糖基化修饰，但有时 糖基化序列与天然的不同，且蛋白产量 不稳定。
3、哺乳动物细胞表达系统
生产的蛋白具有天然构象，稳定性好， 糖基化模式没有发生改变，但哺乳动物 细胞培养成本高，条件要求严格，蛋白 表达水平较低。