细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题重点
细菌内毒素检查中值得注意的问题
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细菌 内毒素检查 中值得注意 的问题
济 南 市药 品检 验 所 车萍 赵 勇
６６
６２ ．
９３ ．
５０
无色盛清 无色羞精 无色羞靖 无色器清 无邑羞靖
２． ３以 ９ ０ ｕ 、９ ４ ３、 ９ ４ ４三批 为样 奉 ， ９ ３ ９０ Ｌ ９ ｛ １ ） 比 较可 能受 本工 艺 操 作 影 响 的 几 项 质 量 指 标 在 再 制 前
醇， 此工 艺就 不 能有 效 去 除 热 原 ， 大 概 与 免疫 球 蛋 这
白生 产 中热 原 质大 多 产生 于 脱 落性 生产 材 质有 关 。
应用 本工 艺处 理 不 合 格 的免疫 球 蛋 白 ， 能使 热 原
质 试验 中家兔 升 温值 降 低 。 受 到一 定 程 度污 染 的制 使
品得 到有 效处 理 。但 若生 产操 作不 规 范 。 为 污染 严 人 重 的制 品 ， 用 这 种方 法 也将 受 到 限 制 ， 以 加 强 生 使 所 产 操 作 的 ＧＭＰ管理 是 工 艺 发 挥 作 用 、 证 产 品 质 量 保 的基 础 。 由于此 方 法 操 作 简 单 ， 白损 失量 小 ， 制 蛋 对 品质 量 没有 影 响 ， 非常 适 舍 于热 原不 合 格免疫 球 蛋 白 的返艺再 制 翦后 质■ 结暴 比较
继《 中国药 典） ９ ５年 版 正 式 收 载 细 菌 内毒 素 检 ￣９ 查 法后 ，０ ０年 版 《 国 药 典 》 收 载 细菌 内 毒 素 检 ２０ 中 除
查 法外 ， 收载 了细菌 内毒 紊检 查 法应 用 指导原 则 及 还 附件 细菌 内毒 素 定 量 测 定 法 ， 且 检 查 品 种 也 增 至 井 ６ ９种 。说 明 细菌 内毒 素 检查 法 这 一 简单 、 确 、 敏 准 灵
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题
血站细菌内毒素检测应注意的几个问题一．内毒素单位内毒素单位不能采用pg/ml在80年代以前，所有研究内毒素的报道，均使用重量单位表示内毒素的量。
随着人们对细菌内毒素生物活性的不断研究，认识到不同来源的内毒素，相同重量的内毒素，其生物活性相差很大。
•1980年，美国学者Hochstein完成了将重量单位转化为内毒素单位的工作。
•当时美国内毒素参考品为EC2，该参考品的家兔发热剂量ED50为1.04ng/kg，EC2与美国第四批鲎试剂参考品（美国FDA批准）的反应终点浓度为0.194ng/ml(四个试验室56批数据的几何平均值)， FDA规定该值为EC2的1个内毒素单位， EC2的量值为5EU/ng。
•1987年WHO建立第一批国际内毒素标准品(84/650,14000IU)。
•1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580,10000IU)，规定1IU=1EU。
•981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。
2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出，细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
二．标准品的来源2005年版中国药典《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
2005年版中国药品检验标准操作规范《细菌内毒素检查法》中明确指出：细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
三．样品的稀释细菌内毒素实验中样品每步稀释的倍数不应大于10倍，否则会影响实验的准确性。
四．样品的预处理过程不同厂家生产的血液保存液PH会略有不同，举例：血液保存液ⅠPH范围是4.5～5.5，血液保存液ⅡpH值 4.5～5.5，红细胞保存液pH值范围是5.0～6.0。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
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❖主要特性（实验器材处理方法）
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4 小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
L：供试品细菌内毒素限值
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❖ 灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。
试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；
待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。
1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开， 加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：
❖ 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
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鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原
鲎凝血系统－酶联反应
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凝胶
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名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
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细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
➢内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相 应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。
——2010年版药品GMP实施指南
7 样品
➢β-葡聚糖样物质的影响 ➢PH值的影响 ➢金属离子和弱酸阴离子的影响 ➢药物浓度的影响
1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂 细菌内毒素工作标准品 细菌内毒素检查用水 环境 实验器皿 实验人员 样品 试验
1 鲎试剂
➢质量标准：WS1-363（B-123）-91 性状、鉴别、检查、灵敏度测定、 用途、规格、贮藏
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
2） 湿度 ➢ 吸潮 ➢ 灵敏度增高 ➢ 挥发
5 实验器皿
➢器皿的计量管理（校正） ➢器皿的选择标准 ➢器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的玻璃刻度移液管 或精密移液器。注射器刻度不精确，内壁磨沙 面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引 入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注 射器。
细菌内毒素检查相关问题
细菌内毒素检查相关问题 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020细菌内毒素检查相关问题细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题审评四部王彦厚摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。
经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。
但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求样品的内毒素含量具体是多少这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
细菌内毒素检验注意事项
德州市药品检验所
简 介 实验介绍：凝胶法 光度测定法 实验涉及内容及相关要
简介
细菌内毒素具有： 耐热性： 不易灭活（180℃、2小时；250℃、 30分钟） 分子极性： 易聚集、吸附，需充分混合 高致热性： 作用于人体，会引起发热、寒战、 休克、甚至死亡
细菌内毒素检查方法的分类
凝胶限度试验
凝胶限度试验
凝胶法
干扰作用
凝胶法
凝胶法
鲎试剂灵敏度复核：当使用新批号的鲎试剂或 实验条件发生了任何可能影响检验结果的改变 时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 干扰试验：当进行新药的内毒素检查试验前， 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查时， 须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能 影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
试验有效
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
鲎试剂灵敏度复核试验
凝胶限度实验—日常检查
1、限值的确定
1、计算最大有效稀释倍数
2、供试品溶液的制备
3、检查法—凝胶限度试验
度试验
凝胶限度试验
凝胶限度试验
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题重点
细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、
封口膜、记号笔
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❖ 试剂
1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75％乙醇
❖ 常用英文缩写
BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水
MVD：供试品最大有效稀释倍数
NC：阴性对照
MVC：供试品最低有效浓度
（2 λ）
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0.25 EU/ml
（ λ）
0.125 0.0625 EU/ml EU/ml
（0.5 λ） （0.25 λ）
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2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入 0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支， 按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管 （10mm×75mm），将试管按如下形状排列。
细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。
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❖主要特性（实验器材处理方法）
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4 小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
❖ 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
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二、细菌内毒素检测方法
❖ 《中国药典》批准使用方法：
凝胶法
测定
浊度法
方法
光度测定法
显色基质法
❖ 供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面
细菌内毒素检查法研究中应注意的几个方面摘要：本文通过审评中发现的一些问题，结合药品检验的工作实际，对细菌内毒素进行方法学验证的重要性、必要性以及在技术审评中应关注的几个方面进行了全面阐述。
关键词：细菌内毒素、药品申报、技术审评热原检查法和细菌内毒素检查药典附录并没有统一的给药剂量和标准限度，均在各品种项下具体规定，故是否能有效地保证临床用药的安全性，其标准限值是我们在制订质量标准时首先要关注的。
对于内毒素限值的确定，药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的K值都有具体的规定。
M为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。
这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。
原则上一般根据药品使用说明书来确定最大剂量。
通常以一次剂量为准，如注明输2小时，则除以2，否则均以1小时为准；不足1小时的，也以1小时计；如未给出一次剂量，而是一日剂量，如一日2～4g，分2～4次用，这种情况以计算后的最大剂量，即2 g/次计算。
用法用量中有成人剂量、儿童剂量、重症剂量时，要体现出最大剂量。
通常儿童剂量以Kg计算时大于成人剂量，所以，此时应用儿童剂量，因为儿童与重症病人更易出现问题，故应更严格。
用于感染、肿瘤、心血管、中枢疾患易感的药物建议加上安全系数。
复方、输液、工艺易污染者从严，大输液一般计为0.5EU/ml。
有时候，细菌内毒素限值也以国外药典为参考，甚至就直接采用国外药典的限值。
这一点在实际应用的时候，必须从中国的临床用药的实际出发，不能不加区分地把同品种中国外药典规定的限值移至中国药典，总的原则是，对这一类国外药典已建立细菌内毒素检查法的品种，原则上要求将国外药典规定的限值与按公式计算出的数值进行比较，一般应以严格者为该品种的限值。
细菌内毒素检测方法建立
细菌内毒素检测是确保药品、生物制品和医疗器械等产品安全的重要环节。
在建立细菌内毒素检测方法时，需遵循国家相关药品检测标准，如《中国药典》等规定，确保检测方法的准确性和可靠性。
以下是建立细菌内毒素检测方法的一些关键步骤：
1. 方法选择：根据检测样品的特性和预期用途，选择合适的检测方法。
目前常用的方法包括凝胶法、动态浊度法和显色基质法等。
2. 鲎试剂选择：选择合适的鲎试剂是检测过程中的关键。
鲎试剂的质量直接影响到检测结果的准确性。
3. 检测限度的确定：通过方法学验证，如准确度、精密度、专属性、定量限、线性、范围和耐用性等试验，来确定检测方法的检测限度。
4. 干扰因素分析：分析样品在检测过程中可能存在的干扰因素，如样品中的蛋白质、脂多糖等成分可能对检测结果产生影响。
5. 方法学验证：对所建立的方法进行验证，确保其准确度、精密度、专属性等满足检测要求。
6. 样品适应性验证：对不同样品进行适应性验证，确保方法的可重复性和稳定性。
7. 结果判定：根据检测结果，结合相关标准和规定，对样品中的细菌内毒素进行判定。
8. 质量控制：在整个检测过程中，需严格控制实验条件，如温度、时间等，确保检测结果的准确性。
9. 数据记录与分析：详细记录实验数据，进行统计分析，确保数据的完整性和可追溯性。
建立细菌内毒素检测方法是一个复杂且严谨的过程，需要专业知识和技能。
同时，检测人员需具备一定的实验操作能力和理论知识，以确保检测工作的顺利进行。
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
2014年10月24日
博康
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
2014年10月24日
博康
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在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
2014年10月24日
博康
2
由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
2014年10月24日 博康 19
2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
2014年10月24日
博康
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5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
2014年10月24日
博康
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1） 器皿的选择标准
2014年10月24日
博康
4
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素检查应注意的问题
细菌内毒素检查应注意的问题
王军芳;朱敏;任国忠
【期刊名称】《沈阳部队医药》
【年(卷),期】2000(000)004
【摘要】细菌内毒素检查法自收入1995版《中华人民共和国药典》(以下称95版药典)后,在我国得以迅速发展,给药检、质检和临检工作带来极大方便。
但实际应用中常出现一些问题,使检验结果不一致。
根据我们几年来的应用实践,认为要避免假性结果,应注意以下5个问题。
【总页数】1页(P)
【作者】王军芳;朱敏;任国忠
【作者单位】沈阳军区联勤部供血站;111000
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2
【相关文献】
1.鲎试验检查细菌内毒素应注意的问题 [J], 周爱华
2.细菌内毒素检查法中应注意的问题 [J], 盈坤;房霞;雷光
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4.凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题 [J], 于娟;徐雪;毕丽华
5.凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题 [J], 于娟;徐雪;毕丽华
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细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析课件下载
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
二、影响试验结果的因素分析
3） 金属离子和弱酸阴离子
国外内毒素标准品：国标、工作品
细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素工作标准品（200758-201174）
用 75% 酒 精 棉 球 擦 拭 后 启 开 ，
实验室湿度：45%～75%
防止玻璃屑落入瓶内。 在41～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》
➢影响酶原的激活；
➢影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活 性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使 其变性失活。
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
1 鲎试剂
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂 的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方 法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂 进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查 前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
——2010版《中国药品检验标准操作规程》
1 鲎试剂
➢外 观：本品为白色或类白色冻干块或粉末， 在水和生理盐水中易溶。
➢蒸馏水
➢有效期
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器 皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有 的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃 器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复 核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是 由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。
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细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。
一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。
式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。
一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。
M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) =0.2EU/mg。
在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。
假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。
内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许稀释的最大倍数。
MVD的计算公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时， MVD=内毒素限值L（EU/ml ）/鲎试剂灵敏度（λ）；当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时， MVD=内毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。
在凝胶法中，λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度（EU/ml）。
最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到一定浓度，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许的最小浓度。
计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值（L）。
对所选定的鲎试剂灵敏度来讲，MVC是一个绝对值；而MVD 对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。
3、方法学验证试验的预试验确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解性，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。
尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般需要进行预试验。
预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interfering concentration, NIC），为后续的验证试验选择适当的样品稀释度（或浓度）。
不管采用凝胶法还是光度法，预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验，在每一个稀释浓度，都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。
可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释，一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜；也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。
添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ；终点显色法为4λ（这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限）。
动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法，可以选择标准曲线的中点浓度，也可以与终点比色法一样，选择4λ。
此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为1.0-5.0EU/ml之间。
对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质；添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。
光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。
通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。
要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，但不可超过MVD。
若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD，因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品。
因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。
例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为100（倍）。
预试验结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。
4、方法学验证试验（增强/抑制试验）验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。
验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。
在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。
凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成，试验中要求样品平行4管，设立样品阴性对照管，也同样平行4管。
尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致，可以2管，也可以4管，但鉴于目前国内的具体情况，在2005年版药典附录的细菌内毒素检查法中规定是平行4管。
细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值（内毒素含量）必须在鲎试剂标示灵敏度的2倍范围以内，在样品溶液和细菌内毒素检查用水中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在2倍范围之内（2λ~0.5λ）。
光度法的验证试验中，要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度，阳性对照的内毒素回收率，在扣除样品可能含有的内源性内毒素后，必须在已知添加内毒素量的50%～200%之间，添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行2管。
二、细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题1、在方法建立的过程中，对方法的验证非常重要一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意：首先要了解产品的溶解度，按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值，并确证产品对方法是否存在干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。
其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异。
此外，还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响，如：器皿的控制、鲎试剂标示灵敏度（或光度法检测用鲎试剂的检测限）等。
最后，要确保仪器的运行状态和对实验过程的准确记录。
总之，只有验证了整个实验的每一个环节，才能保证方法学的可靠和成功。
方法学验证终究是为药品生产质量服务的，验证本身也是一个动态的过程，是随着生产工艺、环境和检验条件改变而变化的。
方法学验证实验记录，要抓住要点，将试验关键步骤记录详细，避免验证资料照抄药典附录，罗列一大堆规定，最终没有明确的方法及可操作性。