基因工程中工具酶 限制酶的应用 PPT课件
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平末端的DNA片段与粘性末端相比，则不 易于重新连结，耗能多。
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24
(2) 同裂酶 (isoschizomers)
来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样 的切割，形成同样的末端，这类酶称为同裂酶 (isoschizomers)。
若同裂酶的切点相同，会形成同样 的末端。例如，HpaⅡ和MspI（C/CGG） ；
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的 中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA 片段。
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21
三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ） 平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）
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22
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3’-OH的单链粘性末端
工具酶是从哪里获得的呢？
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2
基因工程工具酶
自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操 作方法后，人类即获得了最好的基因工程“工 具”。
31
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率， 一般采用如下三种方法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底 物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本）
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因 素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
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32
在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的， 会含有少量的DNase的污染。由于DNase 的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮 存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA， 因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。
27
由同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形
成的位点，称之为“杂种位点”(hybrid site)。 但必须指出，这类杂种位点的结构，一般不能
再被原来的任何一种同尾酶所识别切割的。例 如：Sal I （5`-G TCGAC-3`）和 XhoI (5`-C TCGAG-3`)的消化片段相连，但所 形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被 上述2种酶的任一种酶识别和切割。（也可能 有少数例外）。
以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
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3
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4
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶 的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。
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17
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别
各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识
别230种不同的DNA序列。
2、发现
早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰
(Modification)系统（R-M系统）。
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20
B. 切割类型：
检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限 制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是 属于下述两种排列方式之一：
（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称 地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形
成具有粘性末端的DNA片段（ 3’- 和 5’- ）；
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26
例如：
5’GGATCC-3’
3C’CBT- AamGGH-Ⅰ5’
5’-AGATCT3’
35’ ’-BTCglTⅡAGA-
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5’-TGATCA3’
35’ ’-BAcClTⅠAGT-
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种
酶 可 产 生 相 同 的 5 ’ G ATC 粘性末端，由这种同尾酶产 生的DNA片段可因粘性末 端的互补而彼此再连接起来。
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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3种不同的 亚基
单链多肽
2种不同的 亚基
10
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机地切割
寄主特异性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠
杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜
血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
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14
限制性核酸内切酶的命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
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7
l
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8
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性
I型
（7项）
II型
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
1 、 DNA的纯度
核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效 率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本 身的纯度。若污染了在DNA制剂中的某些物 质后，（例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙 二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以 及高浓度的盐离子等）都有可能抑制核酸内 切限制酶的活性。
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G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平齐末端
5’-PHO-
5'-GAT ATC-3’ 3'-CTA TAG-5’
5'-GAT 3`-CTA
+ ATC-3’ TAG-5`
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23
产生的末端特征：
我们所说的粘性末端是指DNA分子在限 制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸 末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基 间的配对而重新连结起来。
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18
A.识别序列
识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序 列。
回文序列的概念：具有特异性识别的反向重 复序列称为回文序列。
识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
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5'-CTGCA G-3,
5’-CTGCA-OH-3’
P-G-
，
3'-G ACGTC-5
3'-G -P
+
‘3-
，
HO-ACGTC-5
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端
5'-G |AATTC-3’
5'-G -OH +
A3'-ACTTTTCA-A3’| G-5’
3'-CTTAA-P-5’
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5
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现
1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核
苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶
。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》
的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从
序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向
Fra Baidu bibliotek
“读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序
列）。
3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平
齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成
重组分子。
4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一 的、识别序列在DNA分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸 组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果 某限制性核酸内切
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12
酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就 可能有一个切割点。 当识别序列为n 个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶和DNA片段化 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶及其它酶
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1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。
基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。
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（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
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25
(3) 同尾酶 (isocaudamer)
来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都 能产生相同的粘性末端,称为同尾酶。
常用的BamH I, Bcl I, BglⅡ, Xho I就是一 组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由
-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然， 由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其 粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的， 因此在基因克隆中很有用处。
的第一和第三个字母。
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15
（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII 、HindIII等等。
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13
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要
有一个统一的命名法。H．O．Smith和D
．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广
大学者所接受。他们建议的命名原则包括
如下几点：
（1） 用属名的第1个字母（大写）和种
名的头2个字母（小写），组成3个字母的
6
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
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28
表：几种常见的限制性核酸内切酶
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29
五．影响核酸内切限制酶活性的因素
（5点+1）
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 核酸内切限制酶的缓冲液
* 关于限制性内切酶的星活性
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30
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
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十分有用
用处不大
11
2、切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子 中预期的切割概率。有了它，又知道DNA序 列的长度，就可以估算该限制性核酸内切酶 在某种DNA分子中的切点数N。
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
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不同核酸内切酶的特异识别位点
PstⅠ：
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
EcoR Ⅰ：
5‘…… G A A T T C ……3’
3’ ……C T T A A G ……5’
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(2) 同裂酶 (isoschizomers)
来源不同的限制酶识别序列相同，产生同样 的切割，形成同样的末端，这类酶称为同裂酶 (isoschizomers)。
若同裂酶的切点相同，会形成同样 的末端。例如，HpaⅡ和MspI（C/CGG） ；
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的 中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA 片段。
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三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ） 平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）
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（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3’-OH的单链粘性末端
工具酶是从哪里获得的呢？
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基因工程工具酶
自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操 作方法后，人类即获得了最好的基因工程“工 具”。
31
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率， 一般采用如下三种方法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底 物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本）
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因 素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
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32
在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的， 会含有少量的DNase的污染。由于DNase 的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮 存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA， 因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。
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由同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形
成的位点，称之为“杂种位点”(hybrid site)。 但必须指出，这类杂种位点的结构，一般不能
再被原来的任何一种同尾酶所识别切割的。例 如：Sal I （5`-G TCGAC-3`）和 XhoI (5`-C TCGAG-3`)的消化片段相连，但所 形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被 上述2种酶的任一种酶识别和切割。（也可能 有少数例外）。
以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
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第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶 的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。
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四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别
各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识
别230种不同的DNA序列。
2、发现
早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰
(Modification)系统（R-M系统）。
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20
B. 切割类型：
检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限 制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是 属于下述两种排列方式之一：
（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称 地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形
成具有粘性末端的DNA片段（ 3’- 和 5’- ）；
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例如：
5’GGATCC-3’
3C’CBT- AamGGH-Ⅰ5’
5’-AGATCT3’
35’ ’-BTCglTⅡAGA-
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5’-TGATCA3’
35’ ’-BAcClTⅠAGT-
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种
酶 可 产 生 相 同 的 5 ’ G ATC 粘性末端，由这种同尾酶产 生的DNA片段可因粘性末 端的互补而彼此再连接起来。
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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3种不同的 亚基
单链多肽
2种不同的 亚基
10
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机地切割
寄主特异性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠
杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜
血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
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限制性核酸内切酶的命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型
特性
I型
（7项）
II型
III型
限制和修 饰活性
单一多功 能的酶
1 、 DNA的纯度
核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效 率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本 身的纯度。若污染了在DNA制剂中的某些物 质后，（例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙 二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以 及高浓度的盐离子等）都有可能抑制核酸内 切限制酶的活性。
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G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平齐末端
5’-PHO-
5'-GAT ATC-3’ 3'-CTA TAG-5’
5'-GAT 3`-CTA
+ ATC-3’ TAG-5`
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产生的末端特征：
我们所说的粘性末端是指DNA分子在限 制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸 末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基 间的配对而重新连结起来。
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A.识别序列
识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序 列。
回文序列的概念：具有特异性识别的反向重 复序列称为回文序列。
识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
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5'-CTGCA G-3,
5’-CTGCA-OH-3’
P-G-
，
3'-G ACGTC-5
3'-G -P
+
‘3-
，
HO-ACGTC-5
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端
5'-G |AATTC-3’
5'-G -OH +
A3'-ACTTTTCA-A3’| G-5’
3'-CTTAA-P-5’
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一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现
1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核
苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶
。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》
的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从
序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向
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“读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序
列）。
3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平
齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成
重组分子。
4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一 的、识别序列在DNA分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸 组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果 某限制性核酸内切
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酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就 可能有一个切割点。 当识别序列为n 个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶和DNA片段化 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶及其它酶
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基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。
基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。
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（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
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(3) 同尾酶 (isocaudamer)
来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都 能产生相同的粘性末端,称为同尾酶。
常用的BamH I, Bcl I, BglⅡ, Xho I就是一 组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由
-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然， 由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其 粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的， 因此在基因克隆中很有用处。
的第一和第三个字母。
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（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII 、HindIII等等。
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三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要
有一个统一的命名法。H．O．Smith和D
．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广
大学者所接受。他们建议的命名原则包括
如下几点：
（1） 用属名的第1个字母（大写）和种
名的头2个字母（小写），组成3个字母的
6
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
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表：几种常见的限制性核酸内切酶
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五．影响核酸内切限制酶活性的因素
（5点+1）
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 核酸内切限制酶的缓冲液
* 关于限制性内切酶的星活性
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寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
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十分有用
用处不大
11
2、切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子 中预期的切割概率。有了它，又知道DNA序 列的长度，就可以估算该限制性核酸内切酶 在某种DNA分子中的切点数N。
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
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不同核酸内切酶的特异识别位点
PstⅠ：
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
EcoR Ⅰ：
5‘…… G A A T T C ……3’
3’ ……C T T A A G ……5’