基因工程中工具酶 限制酶的应用 PPT课件
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基因工程ppt课件
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
一定大小的DNA片段
将DNA片段与: cDNA合成法
+ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
+ 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解， 使之变成单链的的基因主要是指___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获人工化学合成
限制酶
取出 DNA 用限制酶剪 去与模板互补的DNA双链） 重复循环
16
实际具体过程
17
PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩增循环的次数）
18
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别 受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细
27
1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
基因工程的工具酶
稳定性
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
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应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
基因工程常用的工具酶
四、影响限制酶活性的因素
DNA的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、EDTA、SDS
增加限制酶用量 扩大酶催化反应体系 延长酶催化时间
DNA的甲基化程度：
反应温度：
DNA的分子结构：
酶缓冲液组成： 甘油浓度：
MgCl2： NaCl/KCl： Tris-HCl： β-巯基乙醇/二硫苏糖醇（DTT）： 牛血清白蛋白（BSA）：
连接方式
缺口DNA:
5’ 3’
OH P
3’
5’
平齐末端DNA：
5’ 3’
OH P P OH
3’ 5’
粘性末端DNA：
5’ 3’
3’ 5’
基因工程中常用的连接酶
T4噬菌体DNA连接酶（T4连接酶） 大肠杆菌DNA连接酶 热稳定性DNA连接酶
第三节 DNA聚合酶
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
HaeⅢ 的切割位点
5‘ … G A G G C C G A G … 3’ 3‘ … C T C C G G C T C … 5’
HaeⅢ的识别序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 部分限制酶能识别多种核苷酸序列
HindⅡ的识别序列 5‘ … G C G T Py Pu A C G A G … 3’ 3‘ … C G C A Pu Py T G C T C … 5’
与识别位点一致 Mg2+
低
高
EcoK、EcoB
Hind Ⅱ
同时存在 两个亚基 Ι 、Ⅱ之间 与识别位点不一 Mg2+、 SAM
低 EcoPΙ
二、限制酶的命名
命名原则
限制酶寄主微生物属名头字母（大写）和种名前两字母（小 写）表示寄主物种
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
第二节基因工程及其应用ppt课件
2）用同一种限制酶切断目的基因，使 其产生相同的黏性末端。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的 切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了 一个重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实 际上是不同来源的基因重组的过程。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤三：目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤四：目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
（三）基因操作的基本步骤
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
参考资源：
展示你的搜索成
思维拓展
有人认为，转基因新产品也是一把双刃 剑，犹如水能载舟，亦能覆舟，甚至带来 灾难性的后果，你是否同意这一观点？举 例说明。
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
转鱼抗寒基 因的番茄
不会引起过敏的转基因大豆
转基因龙胆花色奇异
转基因蓝猪耳改变花色
转基因牵牛花改变了花色
A：紫外光照射下的转 绿色荧光蛋白的 Eustoma (Lisianthus) 花。
B：转没有绿色荧光 蛋白的空质粒的花，
会发光的转基因鱼
最常用的质粒是大肠杆 菌的质粒，其中常含有抗药 基因，如四环素的标记基因。
质粒的存在与否对宿主细 胞生存没有决定性作用，但 复制只能在宿主细胞内成。
3）将切下的目的基因片段插入质粒的 切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了 一个重组DNA分子（重组质粒）
目的基因与运载体的结合过程，实 际上是不同来源的基因重组的过程。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤三：目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
（三）基因操作的基本步骤 • 步骤四：目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
（三）基因操作的基本步骤
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
参考资源：
展示你的搜索成
思维拓展
有人认为，转基因新产品也是一把双刃 剑，犹如水能载舟，亦能覆舟，甚至带来 灾难性的后果，你是否同意这一观点？举 例说明。
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
转鱼抗寒基 因的番茄
不会引起过敏的转基因大豆
转基因龙胆花色奇异
转基因蓝猪耳改变花色
转基因牵牛花改变了花色
A：紫外光照射下的转 绿色荧光蛋白的 Eustoma (Lisianthus) 花。
B：转没有绿色荧光 蛋白的空质粒的花，
会发光的转基因鱼
最常用的质粒是大肠杆 菌的质粒，其中常含有抗药 基因，如四环素的标记基因。
质粒的存在与否对宿主细 胞生存没有决定性作用，但 复制只能在宿主细胞内成。
基因工程的工具酶(一)
• 蛋白质结合在DNA片段上，能保护结合部位不被 DNase破坏，DNA分子经酶切作用后遗留下该片 段(亦称“足迹”)，进而可以确定它的序列。
RNase
RNase H 作用于DNA-R链的合成。
RNase A 作用于RNA的专一性内切酶，特异 性的作用于嘧啶核苷酸，主要用于除去DNA制 备物中的RNA。
The mechanism of DNA ligase is to form two covalent phosphodiester bonds between 3' hydroxyl ends of one nucleotide with the 5' phosphate end of another. ATP is required for the ligase reaction.
子的末端一个一个地切除核苷酸。
（2）内切核酸酶(Endonuclease)，从DNA 分子内部打断磷酸二酯键。内切酶可以在多核苷 酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。
内切核酸酶
S1内切核酸酶，来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），只切断单链DNA或RNA,产生带5'磷酸的
单链核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和 DNA-RNA杂交体相对不敏感；
子。 （2）连接酶（ligases），将核酸分子连接起来。 （3）聚合酶（polymerases），复制核酸分子的
酶。 （4）修饰酶（modifying enzyme），去除或添
加 化学基团的酶。 （5）拓扑异构酶（topoisomerases），向共价
闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋。
4.1.1 核酸酶（Nuclease）
从牛胰腺中制得的脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）既能 够切断单链也能够切断双链。DNaseI是一种非特异的 内切酶，能够打断DNA内部的任意磷酸二酯键。另一 方面，称作限制性内切酶的一组特殊的酶能够在特定 的位点切开双链DNA分子。
RNase
RNase H 作用于DNA-R链的合成。
RNase A 作用于RNA的专一性内切酶，特异 性的作用于嘧啶核苷酸，主要用于除去DNA制 备物中的RNA。
The mechanism of DNA ligase is to form two covalent phosphodiester bonds between 3' hydroxyl ends of one nucleotide with the 5' phosphate end of another. ATP is required for the ligase reaction.
子的末端一个一个地切除核苷酸。
（2）内切核酸酶(Endonuclease)，从DNA 分子内部打断磷酸二酯键。内切酶可以在多核苷 酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。
内切核酸酶
S1内切核酸酶，来源于米曲霉（Aspergillus oryzae），只切断单链DNA或RNA,产生带5'磷酸的
单链核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和 DNA-RNA杂交体相对不敏感；
子。 （2）连接酶（ligases），将核酸分子连接起来。 （3）聚合酶（polymerases），复制核酸分子的
酶。 （4）修饰酶（modifying enzyme），去除或添
加 化学基团的酶。 （5）拓扑异构酶（topoisomerases），向共价
闭合环状DNA分子中引入或消除超螺旋。
4.1.1 核酸酶（Nuclease）
从牛胰腺中制得的脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）既能 够切断单链也能够切断双链。DNaseI是一种非特异的 内切酶，能够打断DNA内部的任意磷酸二酯键。另一 方面，称作限制性内切酶的一组特殊的酶能够在特定 的位点切开双链DNA分子。
基因操作工具酶PPT课件
α- 32P-dATP
EcoR I 酶切末端
同位素标记的EcoR I 酶切末端
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3.3 Taq DNA聚合酶
显著特点：热稳定性。70℃反应2h残留活性90 %； 93℃ 反应 2 h残留活性60% ；94℃ 反应 2 h残 留活性40%。
应用：（1）对DNA的特定片段进行体外扩增； （2） DNA序列测定。
Back
2 DNA连接酶
2.1 定义及功能 2.2 种类及作用机理 2.3 使用时的注意事项
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2.1 定义及功能
DNA连接酶（DNA ligase）： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端
形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段 连在一起封闭双链上形成的切口的酶。
OH P
5`
• 若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个 字母（大写）
• 若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先 后顺序用罗马字母表示。
例如：EcoRⅠ 从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为 EcoRⅠ， 其中E 代表属名（Escherichia)，co 代表种名（coli)， R 代表株系（RY13），Ⅰ 代表该菌株中首次分离到。
应用：缺口平移法制备DNA分子杂交探针
缺口
DNase I DNA聚合酶 I
DNA聚合酶 I dNTP*
缺口
缺口平移法制备DNA分子探针 Back
3.2 Klenow聚合酶
活性： 5`→3`聚合活性，3`→5` 外切酶活性，无5`→3`
外切酶活性。 用途： （1）填补或标记DNA的3`隐蔽末端； （2）催化合成cDNA第二链； （3）DNA序列测定
5-7 bp非对称序 列
基因工程常用工具酶及应用
DNA 连接酶
36
DNA连接酶
连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手）， 不是氢键（梯子的踏板）。
37
三.RNA酶
主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布广泛，如唾液、 皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA 的实验中谨防RNA酶污染。
38
四.核酸酶SI
• 降解单链 DNA 或 RNA，形成5’-P的单核苷 酸或寡核苷酸片段
5'粘末端
PstI
3' sticky end
3'粘末端
HpaI
blunt end
平末端
14
四.识别位点与切割方式
• 限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如
EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。 也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、 或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核 苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。 如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。
某些碱基被甲基化所保护。这种细菌
内部的限制与修饰作用分别由核酸内
切酶和甲基化酶完成，构成了类似免
疫的防御系统。
6
解释 何谓内切酶
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o红色为外切酶的作用位点， 蓝色为内切酶的作用位点
7
限制性核酸内切酶的分类
目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可 分为三大类。 Ⅱ类限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；
15
• 一般说来，在DNA分子中，识别序列短的 出现概率大，识别序列长的出现概率小。 有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4n。 如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256 （4×4×4×4）个核苷酸就有一次机会出 现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则 需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识 别位点。
第一节工具酶限制性内切酶
NEB公司的缓冲液成分（1X）
• NEBuffer 1（黄色）： 10 mM Bis Tris 丙烷-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT（pH 7.0 @ 25℃）。
• • NEBuffer 2（蓝色）：
10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 • • NEBuffer 3（红色）： 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 • • NEBuffer 4（绿色）： 20 mM Tris-Ac, 10 mM Mg(Ac)2, 50 mM KAc, 1 mM DTT（pH 7.9 @ 25℃）。 •
• 这类酶很少能达到完全切割。
某些识别和切割独特的酶
BsmBⅠ
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。
• 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义，但其不
• 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 而不具备实用性。
双酶切体系的建立
• 选择最大程度上保证两种酶活性的缓冲液用于双酶切。为 避免星号活性，建议选用 NEB 高保真内切酶。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
第一节工具酶限制性内切酶
内切酶,现已成为重组DNA技术的重要工具。
限制和修饰现象
• 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。
酶的星号活性
• 在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限 制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。
• 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列 中碱基的缺失。例如，EcoR Ⅰ（EcoR Ⅰ星号活 性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而 EcoR Ⅰ切割序列为 GAATTC。
Ⅱ型限制内切酶的发现
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。
4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
1. 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化 酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
限制和修饰现象
• 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。
酶的星号活性
• 在极端的条件下（如高 pH 和低离子强度下），限 制性内切酶可以切割类似但不同于其特定识别序列 的序列，这种改变的特异性称为星号活性。
• 最常见的一类活性改变是允许碱基替代和识别序列 中碱基的缺失。例如，EcoR Ⅰ（EcoR Ⅰ星号活 性）切割序列 N /AATTN，此处 N 为任意碱基，而 EcoR Ⅰ切割序列为 GAATTC。
Ⅱ型限制内切酶的发现
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。
4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
1. 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化 酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
ch2-1-工具酶-限制性内切酶
Restriction/Modification Systems
Restriction endonucleases are categorized into one of four general groups (Types I, II, III, and homing endonucleases based on their subunit structure, cofactor requirements, specificity of cleavage, and associated methylase activity.
4. 限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease) 是一类能够识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使 每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 (endo-deoxyribonuclease)。
Structure of the homodimeric restriction enzyme EcoRI (cyan and green cartoon diagram) bound to double stranded DNA (brown tubes).Two catalytic manganese ions (one from each monomer) are shown as magenta spheres and are adjacent to the cleaved sites in the DNA made by the enzyme (depicted as gaps in the DNA backbone).
基化状态发挥相应的酶活性，或修饰或切割。切割位点
与识别位点相隔1-5kb。 4） I类限制性内切酶的种类较少，研究的较多的有大肠杆 菌的EcoK和EcoB。
基因工程中常用的工具酶
五、影响限制性内切酶活性的因素 1.DNA的纯度 2. DNA的甲基化 （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 （3）改变限制酶的识别特性 3.温度 4.分子结构 5.限制酶的缓冲液 星号活性 EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
第一节限制性核酸内切酶与dna分子的体外切割第二节dna连接酶和dna分子的体外连接第三节其他工具酶第一节第一节限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与dnadna分子的体切割分子的体切割限制性核酸内切酶是一类能够识别双链dna分子中的某种特定核苷酸序列并由此切割dna双链结构的核酸内切酶
二、基因工程的基本程序 a b 剪切 b
载体质粒
A 外源DNA片段 A b 引入宿 主细胞 选出含有重 组DNA的细 胞扩增表达
外源DNA插入
第二章
基因工程中常用的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA 分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的 体外连接 第三节 其他工具酶
第一节
限制性核酸内切酶与DNA 分子的体切割
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
1.三种活性 （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段 （Klenow酶）
1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） 2. 3’外切酶活性（无dNTP时） 3. 在基因工程中的应用
（1）标记粘性末端. -32P—dNTP 标记平末端 -32P—dNTP （2）将5’端伸出的末端填平 （3）可用来反转录合成双链cDNA。 （4）补平粘性末端。
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
28
也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
h
1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
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B. 切割类型：
检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限 制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是 属于下述两种排列方式之一：
（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称 地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形
成具有粘性末端的DNA片段（ 3’- 和 5’- ）；
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A.识别序列
识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序 列。
回文序列的概念：具有特异性识别的反向重 复序列称为回文序列。
识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如 GANTC)两种，它们都呈回文结构。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
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的第一和第三个字母。
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（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII 、HindIII等等。
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（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
19
不同核酸内切酶的特异识别位点
PstⅠ：
5’…… C T G C A G……3’ 3’ ……G A C G T C ...…5’
EcoR Ⅰ：
5‘…… G A A T T C ……3’
3’ ……C T T A A G ……5’
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三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要
有一个统一的命名法。H．O．Smith和D
．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广
大学者所接受。他们建议的命名原则包括
如下几点：
（1） 用属名的第1个字母（大写）和种
名的头2个字母（小写），组成3个字母的
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5
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现
1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核
苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶
。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》
的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从
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(3) 同尾酶 (isocaudamer)
来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都 能产生相同的粘性末端,称为同尾酶。
常用的BamH I, Bcl I, BglⅡ, Xho I就是一 组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由
-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端，很显然， 由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其 粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的， 因此在基因克隆中很有用处。
分开的核 酸内切酶 和甲基化 酶
具有一种 共同亚基 的双功能 的酶
核酸内切 限制酶的 蛋白质结 构
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3种不同的 亚基
单链多肽
2种不同的 亚基
10
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机地切割
寄主特异性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的 中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA 片段。
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三种酶切末端
3’粘性末端（如Pst Ⅰ） 5’粘性末端（如EcoR Ⅰ） 平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ）
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（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3’-OH的单链粘性末端
序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向
“读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序
列）。
3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子 （有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平
齐末端之分。其中两个粘性末端可以互补配对连结成
重组分子。
4. 其他：同裂酶、同尾酶、远距离裂解酶、双切割酶 等。分述如下：
31
为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率， 一般采用如下三种方法：
①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底 物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本）
②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因 素被相应地稀释。
③延长酶催化反应的保温时间。
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在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的， 会含有少量的DNase的污染。由于DNase 的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮 存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA， 因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶和DNA片段化 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶及其它酶
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1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。
基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。
G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平齐末端
5’-PHO-
5'-GAT ATC-3’ 3'-CTA TAG-5’
5'-GAT 3`-CTA
+ ATC-3’ TAG-5`
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产生的末端特征：
我们所说的粘性末端是指DNA分子在限 制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸 末端结构（若是-3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，它们能够通过互补碱基 间的配对而重新连结起来。
6
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
27
由同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形
成的位点，称之为“杂种位点”(hybrid site)。 但必须指出，这类杂种位点的结构，一般不能
再被原来的任何一种同尾酶所识别切割的。例 如：Sal I （5`-G TCGAC-3`）和 XhoI (5`-C TCGAG-3`)的消化片段相连，但所 形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被 上述2种酶的任一种酶识别和切割。（也可能 有少数例外）。
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例如：
5’GGATCC-3’
3C’CBT- AamGGH-Ⅰ5’
5’-AGATCT3’
35’ ’-BTCglTⅡAGA-
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5’-TGATCA3’
35’ ’-BAcClTⅠAGT-
BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种
酶 可 产 生 相 同 的 5 ’ G ATC 粘性末端，由这种同尾酶产 生的DNA片段可因粘性末 端的互补而彼此再连接起来。
各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识
别230种不同的DNA序列。
2、发现
早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰
(Modification)系统（R-M系统）。
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工具酶是从哪里获得的呢？
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2
基因工程工具酶
自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操 作方法后，人类即获得了最好的基因工程“工 具”。
1 、 DNA的纯度
核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效 率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本 身的纯度。若污染了在DNA制剂中的某些物 质后，（例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙 二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以 及高浓度的盐离子等）都有可能抑制核酸内 切限制酶的活性。
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①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶 的地方，限制性核酸内切酶的名称R便被省去。
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四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点