基因工程主要内容及流程
《基因工程》实验教学教案
《基因工程》实验教学教案一、实验教学目标1. 让学生了解基因工程的基本概念、原理和操作步骤。
2. 培养学生运用基因工程技术解决实际问题的能力。
3. 帮助学生掌握基因克隆、基因编辑等实验技能。
二、实验教学内容1. 基因克隆实验：让学生通过PCR扩增目的基因，并进行琼脂糖凝胶电泳分析。
2. 基因编辑实验：让学生利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行编辑，并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证编辑效果。
3. 基因表达实验：让学生将目的基因插入到表达载体中，转化大肠杆菌，并通过IPTG诱导表达。
4. 抗原-抗体反应实验：让学生利用基因工程方法制备重组抗原，并进行抗原-抗体特异性反应检测。
5. 基因工程应用实例：让学生了解基因工程在生物制药、农业、环保等领域的应用。
三、实验教学方法1. 讲授法：讲解基因工程的基本原理、操作步骤和实验技巧。
2. 演示法：演示基因克隆、基因编辑等实验操作，让学生直观地了解实验过程。
3. 实践操作：让学生动手进行实验，培养实验操作能力和团队协作精神。
4. 讨论法：引导学生针对实验结果进行分析和讨论，提高解决问题的能力。
四、实验教学准备1. 教材和参考资料：准备《基因工程》等相关教材和参考资料，为学生提供理论支持。
2. 实验器材：准备PCR仪器、琼脂糖凝胶电泳设备、表达载体、大肠杆菌等实验所需的器材和试剂。
3. 实验指导：制定详细的实验步骤和操作指南，方便学生查阅。
五、实验教学评价1. 过程评价：评价学生在实验操作过程中的规范性和团队协作精神。
3. 应用评价：评价学生运用基因工程知识解决实际问题的能力。
4. 学生互评：鼓励学生互相评价，提高自我认知和沟通能力。
六、实验教学流程1. 实验前准备：讲解实验原理、目的和操作步骤，检查实验器材和试剂。
2. 实验操作：按照实验指导进行基因克隆、基因编辑等实验操作。
3. 实验结果分析：对实验结果进行分析和讨论，解释实验现象。
5. 实验总结：总结实验收获和不足，提出改进措施。
《基因工程的基本操作程序》 学历案
《基因工程的基本操作程序》学历案基因工程，这个听起来颇具科幻色彩的词汇，其实已经在我们的生活中发挥着越来越重要的作用。
从医疗领域的基因治疗到农业中的转基因作物，基因工程正以惊人的速度改变着我们的世界。
那么，基因工程究竟是如何实现的呢？这就涉及到一系列复杂而又精确的基本操作程序。
首先，获取目的基因是基因工程的第一步。
目的基因就是我们希望引入到受体细胞中的特定基因片段。
它可以是从生物体细胞中直接分离出来的，比如通过从细胞中提取 DNA ，然后用特定的限制性内切酶将其切割，从而获得含有目的基因的片段。
也可以通过化学方法人工合成目的基因，比如已知目的基因的核苷酸序列，就可以按照这个序列来合成。
还有一种常见的方法是利用 PCR 技术（聚合酶链式反应）来扩增目的基因。
PCR 就像是一个神奇的“复制机器”，能在短时间内大量复制出特定的 DNA 片段。
获取到目的基因后，接下来就要构建基因表达载体了。
这一步就像是给目的基因打造一个“专属座驾”，让它能够顺利地进入受体细胞并且发挥作用。
基因表达载体通常由目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分组成。
启动子就像是“发动机”，能够启动目的基因的转录；终止子则像是“刹车”，让转录过程在合适的位置停止；标记基因则是“标签”，方便我们筛选出成功导入了基因表达载体的细胞。
构建基因表达载体需要用到多种工具酶，比如限制性内切酶和DNA 连接酶。
限制性内切酶能在特定的位点切割 DNA ，产生粘性末端或平末端；而 DNA 连接酶则能够将切割后的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的基因表达载体。
有了基因表达载体，下一步就是将其导入受体细胞。
受体细胞可以是细菌、真菌、动植物细胞等。
导入的方法也多种多样。
对于细菌这样的原核细胞，常用的方法是转化法。
比如用氯化钙处理细菌，增加其细胞壁的通透性，从而让基因表达载体更容易进入细胞。
对于动植物细胞，常用的方法有显微注射法、农杆菌转化法等。
显微注射法就像是用一个极细的注射器，将基因表达载体直接注射到细胞内；农杆菌转化法则是利用农杆菌这种天然的“基因搬运工”，将基因表达载体转移到植物细胞中。
高中生物第3章基因工程第节基因工程的基本操作程序教案选择性3
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1。
科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1）概念:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2）实例:培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因.2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
（2)实例:在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物—-Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
（3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术.(2）条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
（3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链.②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链.④重复循环多次。
（4）结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图］3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
基因工程的基本步骤
解读基因工程的基本步骤（以培育抗虫棉为例）：1.培育转基因抗虫棉的技术流程：⑴提取目的基因（抗虫基因）：⑵目的基因与运载体结合：⑶目的基因导入受体细胞：⑷目的基因的检测与表达：2.重点理解基因工程基本内容的五个要点：⑴基因工程的基本内容大致是：① 提取目的基因：获取目的基因是基因工程研究和应用的关键内容之一。
获取原核细胞的目的基因通常用鸟枪法，也可以用人工合成法。
获取真核细胞的目的基因一般用人工合成法。
单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。
为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。
但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法苏云金芽孢杆菌（供体细胞的DNA ） 许多DNA 片段 （含有抗虫基因） 质粒 （运载体） 限制酶含抗虫基因的细胞 载入 扩增 培养选择含重组质粒的土壤农杆菌 离体棉花叶片组织（受体细胞）侵 染 离体棉花叶片组织（受体细胞） 愈伤组织 再生植株转基因抗虫棉植株（表现出特定性状）分化 诱导选择 检测对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增。
然后再根据不同的方法将所需的克隆基因筛选出来，最后分离得到目的基因。
故获取的目的基因需要进行扩增和分离（方法多种且复杂）。
②将目的基因与运载体结合：用同一种限制酶切割运载体与目的基因，再将目的基因与能够自我复制并具有选择标记的运载体在体外利用连接酶连接，形成重组DNA分子。
限制性内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶。
一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
DNA连接酶用于连接各种DNA片段，使不同基因重组。
③将目的基因导入受体细胞：用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制。
目的基因与运载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组DNA 分子必须导入适宜的受体细胞中方能使外源目的基因得以大量扩增或表达。
基因工程的原理流程及应用
基因工程的原理流程及应用基因工程是指通过对生物体的基因进行人工改造，以达到特定目的的科学技术。
它的原理流程包括基因的分离、克隆、改造和重组。
基因工程的流程可以分为以下几个步骤：1. 基因的分离：首先需要从目标生物体中分离出包含所需基因的DNA。
这可以通过PCR（聚合酶链式反应）或其他分离技术来实现。
通常使用的方法是通过PCR扩增目标基因的DNA序列。
2. 基因的克隆：将所需基因的DNA连接到载体DNA上，形成重组DNA。
载体可以是细菌或病毒的基因载体，也可以是质粒或合成DNA。
将重组DNA导入细胞中，形成重组细胞。
3. 基因的改造：通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，改变目标基因的序列。
这种改造可以包括插入、删除或替换DNA片段，从而改变基因的功能或表达水平。
4. 基因的重组：将改造后的基因重新组合到目标生物体的染色体中。
这可以通过多种方法实现，包括基因转导、基因枪和胚胎干细胞技术等。
基因工程的应用广泛，涉及农业、医学和工业等领域。
在农业领域，基因工程可以用于改良作物，提高其抗病性和耐逆性，从而增加产量和改善品质。
例如，转基因作物可以具有抗虫、抗草甘膦（除草剂）或抗病毒的特性，从而减少农药使用，提高农作物的产量和品质。
在医学领域，基因工程可以用于生产重组蛋白和制造人类药物。
人类胰岛素、生长激素和血小板生成抑制因子等重组蛋白都是通过基因工程技术大量生产的。
此外，基因工程还可以用于基因治疗，即通过引入正常基因来纠正异常基因的功能。
在工业领域，基因工程被广泛应用于生物技术和生物制造。
例如，利用基因工程技术，可以将细菌改造为生产特定酶或代谢产物的工厂，如酶、抗生素和生物柴油等。
此外，基因工程还可以应用于环境保护和生态修复。
通过改造微生物基因组，可以使其具有降解污染物的能力，从而减轻环境的污染。
虽然基因工程在许多领域都取得了突破性进展，但也面临一些伦理和安全问题。
如何确保基因工程的安全性和可持续性，是未来发展的关键问题。
基因工程的基本操作过程
1
DNA提取
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
从细胞中提取目标DNA。
2
DNA克隆
将目标DNA插入载体质粒中进行复制。
3
转化
将质粒DNA导入到细胞内。
4
转录
产生RNA分子。
5
翻译
通过翻译机制形成蛋白质。
常见的基因工程技术
质粒构建
将目标DNA插入载体质粒中进行克隆。
基因敲除
在生物体的基因组中“删掉”特定的基因， 观察其对生命活动的影响。
结论
基因工程技术是一项革命性的技术，它不仅带来了许多前所未有的机遇，也 需要我们面对许多伦理问题和考虑。希望我们能够在伦理的框架内，发挥人 类创新智慧，实现科技与人类社会的共同进步。
基因工程的基本操作过程
基因工程是一项将DNA分离、克隆、转化、转录、翻译和表达的技术。这项 技术有着广泛的应用，涉及到农业、医学、工业和环保等领域。
基因工程的定义
基因工程是指通过改变生物的遗传信息，来实现某种特定目的的技术。它的目的是将有用的遗传 信息从一个生物体传递到另一个生物体。
基因工程的基本步骤
通过基因工程技术，可以在大肠杆菌、酵母 等生物中实现目的蛋白的大规模制备，具有 重要的经济价值。
环境领域
基因工程技术在污染治理和资源利用方面具 有巨大的潜力，如利用微生物降解污染物， 通过植物修复土壤等。
伦理问题与考虑
基因工程技术不仅给人类带来了前所未有的发展机遇，同时也带来了一系列 伦理问题和考虑，例如修饰人类基因、人类克隆等等。
基因突变
通过人工干预改变基因序列，使其产生不 同作用。
基因编辑
通过CRISPR等技术精准地修改基因序列， 使自然界中不存在的基因发生。
基因工程的五个基本流程
基因工程的五个基本流程一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，从而达到改变其性状和功能的技术。
基因工程技术的应用范围广泛，包括农业、医药、工业等领域。
二、基因工程的五个基本流程1.选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象。
在选择目标基因时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2.克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的关键步骤之一。
克隆目标基因需要进行以下几个步骤：（1）提取DNA：从生物体中提取DNA。
（2）切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度。
（3）连接载体：将目标DNA片段与载体连接起来。
（4）转化宿主细胞：将连接好的载体转化到宿主细胞中。
3.构建重组表达载体构建重组表达载体是进行基因工程的另一个重要步骤。
重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
构建重组表达载体需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的载体：选择合适的载体，如质粒、病毒等。
（2）插入目标基因：将克隆好的目标基因插入到载体中。
（3）调节表达：调节重组表达载体的启动子和终止子，以控制目标基因在宿主细胞中的表达。
4.转染宿主细胞转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
转染宿主细胞需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的宿主细胞：选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
（2）转染重组表达载体：将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中。
（3）筛选阳性克隆：通过筛选阳性克隆来确定成功转移和表达目标基因的细胞。
5.分离和纯化目标蛋白分离和纯化目标蛋白是将表达出的目标基因转化为蛋白质，并对其进行分离和纯化的过程。
分离和纯化目标蛋白需要进行以下几个步骤：（1）破碎宿主细胞：将表达目标基因的宿主细胞破碎，释放出目标蛋白。
（2）分离目标蛋白：使用不同的技术对混合物进行分离，如层析、电泳等。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
基因工程涉及的主要技术
200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
基因工程涉及的主要技术
多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏
血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它
•95oC
•TGCATGCAT •3’ •ACGTACGTA •5’
•5’•ATCTTGAAC
•模板
•TGCATGCAT •3’
•3’•TAGAACTTG
•ACGTACGTA •5’
•模板（template） 基因工程涉及的主要技术
（2）DNA模板与引物复性
•40-65oC
•引物（primer）:
• 一般程序 1、供体的核酸分离
供体细胞培养
收集(菌体)细胞
细胞破碎
分离总DNA 分离细胞器
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA染色体DNA(组建基因组)cDNA（组建cDNA）
基因工程涉及的主要技术
DNA提取的几种方法
（1）基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它
• 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成 双链的结构。
➢ 同源或部分同源探针
➢ 总cDNA探针
➢ 特异性cDNA探针
➢ 人工合成的寡核甘酸探针 • DNA-DNA
•杂交双链分子
基因工程涉及的主要技术
探针标记
u放射性标记 • 32P，3H，35S，14C，125I 等 u 非放射性标记 • 地高辛，生物素，荧光素等 • 用于标记dUTP
基因工程实验流程
基因工程实验流程基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质（DNA）来改变其性状的技术。
基因工程实验通常包括以下步骤：1.确定研究目标：在进行任何基因工程实验之前，首先确定研究目标。
这可能涉及到改变特定基因的表达水平、插入新的基因、修改现有基因等。
2.选择宿主生物体：选择适合进行基因工程实验的宿主生物体。
常用的宿主包括细菌、酵母、植物和动物细胞。
3.分离目标基因：从源生物中分离出含有目标基因的DNA。
这可以通过多种方法实现，如PCR（聚合酶链式反应）或基因文库筛选。
4.构建基因载体：将目标基因插入到一个适当的载体中，如质粒或病毒。
载体在宿主生物体中用于传递目标基因。
5.转化宿主生物体：将经过构建的基因载体导入宿主生物体中。
这可以通过多种方法实现，如细胞转化、植物转化或动物胚胎注射。
6.筛选和鉴定转化体：经过一定时间培养后，使用合适的筛选方法选择和鉴定转化体。
筛选方法可能包括在选择培养基中添加抗生素来筛选携带特定基因的细胞。
7. 验证目标基因的表达：使用分子生物学技术，如PCR、南方杂交、Northern杂交、Western印迹等方法来验证目标基因的表达。
8.分析和评估改变：对转化体进行进一步的分析和评估，以确定目标基因的功能和影响。
这可以通过表型分析、蛋白质组学、代谢组学等方法实现。
9.优化和改进：根据实验结果，进一步优化和改进基因工程实验的步骤和条件。
10.伦理和安全考虑：在进行基因工程实验之前，必须遵守伦理和安全准则，确保实验过程和产生的转化体对人类和环境没有负面影响。
基因工程主要操作流程及图解
基因功能研究
通过动物模型研究基因在生物体内的功能及 其调控机制，揭示生命活动的本质。
动物模型构建方法和注意事项
构建方法：包括自然 突变筛选、化学诱变、 物理诱变和基因编辑 技术等。其中，基因 编辑技术如CRISPRCas9等已成为主流方 法。
注意事项
选择合适的动物种类 和品系，确保实验结 果的准确性和可重复 性。
基因工程主要操作流程及图解
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目 录
• 基因工程概述 • 基因工程基本操作流程 • 基因表达调控技术 • 蛋白质纯化与功能分析技术 • 细胞培养、转染和稳定株构建技
术 • 动物模型在基因工程中应用 • 总结与展望
01
基因工程概述
定义与发展历程
定义
基因工程是通过改变生物体的遗传物 质，来实现对生物性状和功能的定向 改造的一门技术。
通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）或基因重组技术将目的基因整合到细胞基因组中，实现稳定表达。
筛选方法
利用抗生素抗性基因或荧光标记基因进行初步筛选，再通过qPCR、Western blot等方法对稳定株进 行鉴定和验证。
06
动物模型在基因工程中应用
常见动物模型类型及其特点
小鼠模型
繁殖周期短，基因型确定，适合大规模遗传研 究。
转化细胞筛选与鉴定
01
02
03
抗性筛选
报告基因检测
PCR或测序鉴定
利用选择性培养基筛选转化细胞， 如抗生素或营养缺陷型培养基。
通过检测报告基因的表达情况， 间接判断目标基因是否整合到受 体细胞基因组中。
利用PCR或测序技术直接检测目 标基因在转化细胞中的存在和表 达情况。
03
基因表达调控技术
基因工程的主要步骤
基因工程的主要步骤基因工程的主要步骤包括：1. 目标基因的选择：首先确定要操作的目标基因，可以根据研究的目的或应用的需求来选择。
2. 基因克隆：将目标基因从其来源细胞或组织中分离出来，并通过聚合酶链式反应（PCR）等方法扩增出一定数量的目标基因。
3. 载体构建：选择一个适当的载体，如质粒（plasmid）或病毒，将目标基因插入载体中。
4. 转化：将构建好的质粒或病毒载体导入到宿主细胞中，可以采用化学方法或生物方法（如电穿孔或基因枪等）来实现。
5. 选择与鉴定：利用选择标记或荧光标记等方法，筛选出成功获得目标基因的宿主细胞，并通过PCR、Southern blot等技术验证插入的基因是否正确。
6. 表达与分析：利用适当的启动子和调控元件使目标基因在宿主细胞中得到表达，并进行产物的分离纯化和活性分析。
7. 应用与验证：将获得的基因工程产物应用于相关领域的研究或应用中，并通过实验验证其功能和效果。
需要指出的是，这只是基因工程的一般步骤，并不适用于所有具体的基因工程项目，不同的项目可能会有不同的步骤和操作方法。
8. 后续处理：对于表达的目标基因产物，可能需要进行后续处理，如纯化、结晶或修饰等，以提高其纯度和稳定性。
9. 功能验证：对基因工程产物进行功能验证，通过实验或测试来验证其目的是否得到实现，如酶活性测定、蛋白质互作分析等。
10. 优化和改进：根据功能验证的结果，对基因工程的产物进行优化和改进，以提高其效率、产量、特异性等性能。
11. 安全评估：对基因工程产物的安全性进行评估，包括生物安全性和环境风险评估，确保其在应用中不引起不良后果。
12. 生产与应用：基因工程产物经过上述步骤后，可以进行批量生产，并应用于相关领域，如医药、农业、工业等。
这些步骤是基因工程项目的一般流程，具体步骤和方法可能会因为不同的目标基因和应用领域而有所差异。
在每个步骤中，科学家需要仔细设计实验，选择合适的实验方法和技术，并进行数据分析和结果解读。
基因工程的流程
基因工程的流程
基因工程是一种人工改造生物体基因的技术，其流程可以分为以下几个步骤：
1.选取目标基因：根据需求选取要进行改造的目标基因，可以是来源于同一物种的不同个体的基因，也可以是来自不同物种的基因。
2.克隆目标基因：将目标基因从生物组织中分离并扩增，一般采用PCR技术或者基因文库筛选的方法。
3.构建载体：将目标基因引入载体，一般选择质粒或病毒作为载体，通过连接酶将目标基因与载体DNA进行连接。
4.转化宿主细胞：将构建好的载体引入宿主细胞中，一般采用电穿孔或者化学转化方法。
5.筛选转化细胞：将转化后的细胞进行筛选，通过选择筛选标记基因或者特定培养条件来选择带有目标基因的转化细胞。
6.验证目标基因：通过PCR、Southern印迹、Western印迹或者其他生物学实验手段来确认转化细胞中的目标基因是否已经被成功修改。
7.表达目标基因：将转化后的细胞进行培养、分离、纯化，使目标基因表达出来，一般采用原核或真核表达系统。
总之，基因工程的流程需要经过多个环节的操作和实验验证，旨在使目标基因得到成功改造并表达出来，为生物科技应用提供理论和实践支持。
原创12：1.2 基因工程的基本操作程序
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
（2）化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA
根据已知蛋白质的氨 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法，以 单核苷酸为原料合成目的 基因。
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
（1）导入植物细胞 农杆菌转化法
农杆菌：感染双子叶植物和裸子植物
此外，还有基因枪法、花粉管通道法。
（2）导入动物细胞 显微注射法
（3）将目的基因导入微生物细胞
• 目的基因的提取方法从基因中获取目的基因人工合成目的基因
反转录法 化学合成法
利用聚合酶链式反应（PCR） 特异性地扩将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌 的群体中储存,各个受体菌分别含:
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
5、15 基因工程--上下游技术
Taq DNA poly-merase
Taq DNA聚合酶(Taq DNA poly-merase)是从嗜热水
生菌(Thermus aquaticus)中分离获得的,该酶基因全
长2496个碱基对,编码832个氨基酸,酶蛋白相对分子 量为9.4×104,在70~75℃活性最高,即或在95℃高温 仍具有活性,因此无需在每一循环反应中再加酶。在正 常反应条件下,经过25~30个扩增循环(即扩增倍数达到 106)后,Taq DNA聚合酶量便成为了反应进行的制约因 素,如需继续扩增,要将产物DNA样品稀释 1000~10000倍,作为模板再进行新的PCR扩增反应。 和其他聚合酶一样,TaqDNA聚合酶也是Mg2+依赖酶, 对Mg2+浓度十分敏感。
导人的方法主要有转化、转染等方法 , 此外也可采用电融 合、显微注射和基因枪等技术。
4 鉴定带有目的基因的克隆
从大量的细胞繁殖群体中,筛选出克隆有重组DNA分子 的寄主细胞。为了挑选出重组子,针对不同基因的表达 产物,采用各自特有的测活方法确定其生物活性;也可以 采用酶联免疫方法确定其抗原性;以目的基因为探针,通 过DNA杂交方法可以直接确定重组子。
Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶是从嗜热菌Pyrococcus furiosis中分
离得到的,称高保真耐高温DNA聚合酶,能够纠正PCR扩 增中发生的核昔酸错误。该酶比Taq DNA聚合酶及其 变体错误率低10倍,Pfu DNA聚合酶的超常纠错功能是 由该酶性质决定的,其他耐热DNA聚合酶与Pfu DNA聚 合酶合用可以部分降低错误率,但达不到单独使用该酶 的效果。然而Pfu DNA聚合酶扩增率低于Taq DNA聚 合酶,这是由于该酶具有3'→5'外切酶活性。
基因工程的基本步骤3篇
基因工程的基本步骤第一篇：基因工程的基本概念和研究领域介绍基因工程是利用基因技术对生物体进行基因重组、修饰、表达、筛选等操作的一门学科，是现代生物技术的关键之一。
基因工程的研究领域涉及到基础生物学、医学、农业、环境科学等众多领域，是多学科交叉的学科。
本文将介绍基因工程的基本概念和研究领域。
一、基因工程的基本概念基因工程是一项重要的生物技术，在生物学、医学等领域有广泛应用。
其基本概念包括以下三个方面：1、基因重组：基因重组是利用基因重组技术将不同物种的基因片段或同一物种不同个体的基因片段进行组合，形成新的基因组合，以达到某种特定的目的或功能。
2、基因修饰：基因修饰是通过对基因序列的修改，包括删除、插入、替换等方式，改变基因的功能和表达，以实现某种特定的目的或效果。
3、基因表达：基因表达是指将目标基因的DNA序列在宿主细胞内的转录和翻译，使其形成蛋白质的过程，实现基因信息的表达和传递。
二、基因工程的研究领域1、基础生物学研究基础生物学研究是基因工程的最基本研究领域。
通过基因工程技术，可以进行基因的互换、插入、删除、突变等操作，研究其在生物体内的作用和功能，从而进一步了解生物体的遗传和发育机制。
2、医学领域医学领域是应用基因工程技术最为广泛的领域之一。
基因工程可以制造生产各种重要的生物制品，如疫苗、细胞因子、酶、抗体、荷尔蒙等药物。
此外，基因工程还可以用于基因诊断、基因治疗等方面的研究，如肿瘤、遗传性疾病等。
3、农业领域农业领域也是基因工程技术广泛应用的领域之一。
利用基因工程技术，可以对农作物进行基因的修饰、转移，以获得更高的产量、更高的品质、更好的抗病性和适应性等。
同时，基因工程还可以生产转基因植物和动物，带来更多的经济和社会效益。
4、环境科学领域环境科学领域是近年来新兴的基因工程技术应用领域。
基因工程可以用于处理水、土壤和空气中的有毒有害物质和污染物，改善环境质量。
此外，基因工程还可以开发和利用微生物菌株，提高废水处理效果和生物除臭能力等。
基因工程发展过程及流程
基因工程发展过程及流程基因工程（Genetic Engineering），也称为基因改造、遗传改良、基因技术等，是一门研究生物基因结构、功能及其应用的综合学科。
基因工程的发展过程是一个持续演化的历史过程，涉及到许多科学家的贡献以及技术的不断改进。
下面将以1200字以上的篇幅来介绍基因工程的发展过程及流程。
基因工程的发展过程基因工程的发展可以追溯到1953年克里克和沃森提出的DNA双螺旋结构模型，这一发现为基因工程的发展打下了坚实的基础。
随后，逐渐发展起来的基因克隆技术为基因工程的应用奠定了基础。
1965年，Hostmarker和Smith首次将基因从一个细菌转移到了另一个细菌上，实现了外源DNA的克隆。
此后，引入了供体DNA与受体DNA进行杂交的杂交技术，也为基因工程的发展带来了新的方法。
到了1970年代，随着基因克隆技术的成熟，科学家们开始研究基因在生物体内的表达与调控。
1973年斯坦利·科恩、赛德纳·博伊尔和赫伯特·泰布尔提出了基因工程的一个重要技术工具，即重组DNA技术。
该技术通过将不同物种的基因拼接在一起，使得新组装的基因能够在宿主细胞中正常表达。
1980年代是基因工程发展的黄金时期。
1980年，美国政府批准了第一次基因工程相关专利，标志着基因工程进入实际应用阶段。
此后，一系列重要的技术突破相继出现。
例如，1985年褐藻酸醚酶（Alginate Lyase）基因首次从褐藻中分离出来，并进行了克隆；1989年乳酸菌中偶联羧酸还原酶（CDD）基因被成功克隆。
1990年代以来，随着DNA测序、基因组学以及分子生物学等方面的快速发展，基因工程进一步加快了发展速度。
人类基因组计划的启动以及与之相伴的测序技术革命，使得人类对基因的认识进一步加深。
2003年，人类基因组计划圆满完成，人类基因组序列全面揭示，为后续基因工程技术的发展奠定了坚实基础。
基因工程的流程1.基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的DNA片段从一个生物体中复制并将其引入到另一个生物体中的过程。
基因工程的内容和流程
基因工程的内容和流程基因工程呀，可有意思啦。
基因工程是一门超级酷的技术呢。
它主要就是对基因进行操作。
那基因是啥呢？基因就像是生物体内的小密码，决定了生物的各种特征，像我们的眼睛是大是小，头发是直是卷，都和基因有关系哦。
在基因工程里呢，有几个关键的内容。
一是基因的提取。
这就好比从一个大宝藏库里找出特定的宝石一样。
科学家们要从含有目的基因的生物中把这个基因给弄出来。
比如说，要是想研究抗虫棉花，就得从能抗虫的生物里把相关的抗虫基因找出来。
这个过程可不容易呢，要经过好多复杂的步骤，像是要把细胞打破啦，然后用各种特殊的方法把基因分离出来。
再就是基因的改造。
有时候取出来的基因可能不完全符合我们的要求，就像一件衣服有点不合身，我们得改改。
科学家们可以通过一些技术手段对基因进行修改，让它能更好地发挥作用。
这就像是给基因做了个小手术，让它变得更完美。
还有基因的导入。
这就像是给一个新的机器安装零件一样。
把改造好的基因导入到目标生物的细胞里。
这个导入的方法也有不少呢，像农杆菌转化法，就像是让一个小助手把基因带到目标细胞里。
还有基因枪法，就像用一把小枪把基因发射到细胞里，是不是很有趣呀。
基因工程的流程也很神奇。
先得确定目标。
就是要清楚自己想要做什么。
是想让植物抗虫呢，还是想让细菌生产出我们需要的药物。
这就像我们出门前得先想好去哪儿一样。
接着就是找基因。
按照确定好的目标，在各种各样的生物里寻找合适的基因。
这个过程可能要找好多地方，就像找宝藏一样，翻遍各个角落。
然后就是前面说过的基因改造啦。
把找到的基因按照需求进行调整。
之后就是把基因导入到目标生物的细胞里。
这一步就像是把种子种到土里一样，充满了希望。
导入之后呢，还得进行检测和筛选。
看看基因有没有成功导入，导入之后有没有正常工作。
就像检查一个新安装的零件有没有装好，能不能正常运转。
如果不行的话，可能还得重新来呢。
基因工程虽然很厉害，但是也有一些争议。
有些人担心基因工程会对环境造成影响。
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基因工程制药姓名：惠霞学号：2011506024班级：2011级生技1班基因工程制药一．基因工程制药常用的工具酶：基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。
例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。
(一) 限制酶(Restriction enzymes)限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。
与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。
限制酶的种类Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。
Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。
能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。
这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。
(二) DNA聚合酶(DNA polymerase)DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。
1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断3. T4噬菌体DNA聚合酶4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶6. 反转录酶（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。
1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。
2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。
（四）基因工程中常用的其他酶1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶）2. T4噬菌体多核苷酸酶3. 核酸酶（Nuclease）4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。
分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。
二．基因工程制药中常用的克隆载体载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。
基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。
（一）质粒1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。
2 常用的几种质粒载体（1）pBR322及其衍生载体pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。
BamH I等10个切点位于Tetr基因，Pst I 等6个切点位于Ampr基因组，EcoR I位点位于这两个基因之间，有利于检出重组转化子。
PAT153载体：用限制酶Hae Ⅱ进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带动的较小质粒载体（3.66kb），拷贝数比pBR322增加1.5～3倍。
pBR327载体：用EcoR Ⅱ部分酶切pBR322，去除非必需区段（位点1442~2502）后构建而成。
长仅3.27kb；没有泳动功能；质粒拷贝数增加2～4倍。
(2) pUC系列载体ⅠpUC18、pUC19质粒载体含有pBR322的Ampr基因、复制原Ori和M13噬菌体M13mp系列载体所用的LacZ基因，在Lac区有独特的限制酶识别位点组成的多聚接头顺序（即多克隆位点），这两个载体不同之处在于多克隆位点以互为相反的方向排列。
pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的mop基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高的多。
pUC18/19载体能表达LacZ基因产物（β－半乳糖苷酶）的氨基端片段，在相应的宿主（Lac-）中可出现α互补。
ⅡpUC118、pUC119质粒载体ⅢpUC的衍生质粒载体：pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z 等。
（二）λ噬菌体1 常用的λ噬菌体载体（1）Charon系列载体为克隆DNA大片段而设计的替换型载体。
代表性载体有：Charon4A、pCharon21A(早期)、Charon32～35和Charon40等。
（2）EMBL系列载体克隆大片段基因组DNA的替换型载体。
最常用的是EMBL3、EMBL4和EMBL3A，这些载体多克隆位点上的BamH I位点两侧分别有EcoR I和Sal I位点，EMBL3和EMBL3A含有对称的两个多酶位点聚合接头序列（Sal I-BamH I-EcoR I），以便于Sal I、Xho I（都是↓TGGA）、BamH I、MboＩ、Bgl Ⅱ、Xho I (都是↓GATC)和EcoR I等7种限制酶切点外源DNA片段的克隆。
EMBL4的多聚接头区的限制性切酶位点顺序刚好与EMBL3颠倒。
（3）λgt系列载体插入型系列载体，包括λgt10、pλgt11和λgt18～23等系列载体。
λgt载体是专门为在其免疫区（imm434）单一的EcoR I位点上克隆小的cDNA片段（约6kb）而设计的。
λgt10为43.3kb，在它的阻遏基因CI中有唯一的EcoR I位点，外源cDNA 片段（<7.6kb）插入此处时，使CI基因失活，形成了重组的CI－噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的CI－噬菌斑所产生的阴暗噬菌斑相区别。
λgt11载体是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。
具有可表达性，为43.7kb，在它的LacZ基因末端（位于终止密码上游53bp处），有唯一的EcoR I 位点，可用于插入外源DNA片段。
λgt18、λgt19是λgt的衍生载体，其LacZ的EcoR I位点插入了一个含Sal I、Sac I、Xba I和EcoR I位点的多克隆位点，但只有EcoR I和Sal I是单一酶切点，cDNA片段可插入LacZ单一的EcoR I或Sal I位点。
（三）M13噬菌体1 M13噬菌体的基本特性M13噬菌体的基因组为环状单链DNA分子，由6407个核苷酸组成，有8个基因。
M13是雄性专一性的，即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌（F＋）的性纤毛上而引起感染的。
受M13感染的细胞不被裂解破坏，在平板上不形成空斑而是形成缓慢生长的慢性感染细胞圈。
2 常用的M13噬菌体载体M13mp18和M13mp19，这两个载体在LacZ区的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点（只是在多克隆位点的方向上有所不同），可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。
（四）粘粒（Cosmid）1 粘粒：是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNAcos区与质粒DNA重组构建而成。
它是为克隆和增殖基因组DNA的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。
粘粒大小一般为4~7kb。
最简单的粘粒是一些经过改造的质粒，它们带有一个拷贝的cosDNA序列（将DNA包装的λ噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一个复制起点（通常是ColE1复制起点）和一个抗药性标记（通常是Ampr）（五）哺乳动物细胞载体系统（用于转染哺乳动物细胞的载体，有两类）不带真核复制子的质粒型载体：在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。
这类载体在转染哺乳动物培养细胞之前要在细菌中进行扩增，而在转染后则整合到细胞基因组中并在基因组调控下低水平地表达相应的蛋白质。
如pTK2、、pHyg和pRSVneo等。
带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。
如：SV40载体、牛乳头瘤病毒（BPV）载体和人类疱疹病毒（EBV）载体。
三．连接方法1、粘性末端DNA片段的连接:DNA分子的体外连接（重组）是指外源DNA片段和载体DNA分子在体外通过DNA连接酶共价连接。
具有粘性末端DNA片段的连接比较容易，也比较常用。
选用一种对载体DNA 只具唯一限制点的限制酶，进行位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子。
再将外源DNA大片段也用同种限制酶切割，产生同样的粘性末端。
最后用T4噬菌体DNA 连接酶能很容易地将载体与外源目的基因连接起来。
2、平头末端DNA片段的连接:平头末端DNA片段的连接除了直接用T4连接酶连接外，还可以先用末端核苷酸转移酶给平头末端DNA分子加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶进行连接。
现在常用的平头末端DNA片段连接法有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。
同聚物加尾法：同聚物加尾是指在相互连接的两类DNA分子中，其中一类的3'末端加上一段聚脱氧腺苷（polyA），另一类的3'末端加上一段聚脱氧胸苷（polyT），然后二者混合，在T4DNA连接酶作用下连接成环状分子。
衔接物连接法：衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平头末端的双链寡聚核苷酸片段。
将衔接物的5'末段和待克隆的DNA 片段的5'末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4 DNA连接酶使两者连接起来。
接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。
随后按常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。
3.人工接头连接法：人工接头是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷酸片段。
将具有平头末端的外源DNA 片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来。
再用限制酶切割产生具有粘性末端的DNA片段，然后与具有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体。
四．目的基因的获取目的基因的获取方法有三种：1、从基因文库中获取需要构建基因文库，构建的方法：（1）构建基因组文库：直接分离法（2）构建部分基因文库如cDNA文库：逆转录法2、PCR扩增是针对目的基因序列未知的情况，可采用PCR扩增。
3、人工合成其实有两种：（1）逆转录法；（2）化学方法人工合成；针对目的基因序列已知且较小的情况。
五．转化方法⑴、微生物：感受态细胞法①、感受态细胞：指细菌细胞经过Ca2 处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
②、过程：Ca2 处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
⑵、植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法①、农杆菌：土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物；对大多数单子叶植物没有感染力。