Western印迹杂交

蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
因为固相载体能以非共价键 的形式吸附蛋白质，且能保 持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性，所以可以把经 过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离的蛋白质样品，转移到 固相载体上。
显色发光
蛋白质样品制
备
膜选择的根据主要有：
SDS-聚丙烯酰胺凝 a. 膜与目的蛋白分子的结合能力，
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
加入特异抗性体（一抗）， 膜上的目的蛋白（抗原）
抗原与抗体发生特异性结 合，进行一抗杂交，然后 二抗再与一抗结合，进行 二抗杂交。
酶标显色
蛋白质样品制 备
二
抗
与 SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离蛋白 质
底 物
转膜
反
应
显
封闭
色
杂交
显色发光
对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有
杂交
机溶剂提取，包括乙醇、
丙酮和丁醇等。
显色发光
蛋白质样Baidu Nhomakorabea制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质 转膜
封闭
杂交
显色发光
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳能 有效的分离蛋白质,主要依据 其分子量的差异 ，分子量小
的蛋白质比分子量大的走得 快，从而在凝胶上形成一系 列分子量大小不同的条带， 达到分离蛋白质的目的。
应用
可以非常有效的鉴定某一蛋白质（或表位） 的性质；结合免疫沉淀法，可以用来定量 分析小分子抗原 。
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基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝 胶转移至一种固相支持体，然后用这种 多肽的特异性抗体来检测。
蛋白质样品制 备
基本步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
1.水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。
稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白
质最常用的溶剂 。 2.有机溶剂提取法
半干式转膜 将凝胶和固相基质象三明治一样加 在用缓冲液湿润滤纸之间，电转 10－30min。
封闭
杂交
显色发光
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜
封闭
杂交
将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶 液中温育，将膜上的非特异性 位点封闭，防止其与下一步反 应中的一抗结合，干扰实验结 果。
显色发光
胶电泳分离蛋白 （决定单位面积的膜能结合蛋白的
质
载量)，以及膜的孔径,（决定拦截
转膜
蛋白的大小）；
b. 不影响后续的显色检测，也就是
适和用于所选的显色方法
封闭
Western Blot印迹常用的转移膜主
杂交
要是硝酸纤维素膜和PVDF膜
酶标显色
蛋白质样品制 备
SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离蛋白
质
转膜