教学大肠菌群检测
大肠菌群检测(MPN法)
大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。
本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。
一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。
在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。
1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。
缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。
2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。
该方法已被最可能数(MPN)法所替代。
3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。
在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。
三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。
一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。
2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。
例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。
3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。
大肠菌群检测操作规范培训
大肠菌群检测操作规范培训一、引言大肠菌群是指肠道内的一类细菌，包括大肠埃希菌、变形杆菌、埃斯特菌、摩根氏菌等，是人体健康的重要指标之一。
大肠菌群检测是一种常见的临床检验项目，可以用于判断肠道菌群的平衡状况，对于排查肠道疾病、调节肠道菌群平衡等具有重要的临床意义。
本文旨在对大肠菌群检测相关的操作规范进行培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二、前期准备1. 实验室环境准备：（1）实验室应当保持清洁整洁，操作台面应当有足够的空间进行操作。
（2）实验室空气应当流通良好，保持适宜的温度和湿度。
（3）实验室内应当配备必要的实验仪器和设备，如PCR仪、离心机、冰箱、显微镜等。
（4）实验室内应当配备必要的耗材和试剂，如离心管、移液器、试剂盒等。
2. 人员准备：（1）参与大肠菌群检测的工作人员应当接受相关的培训，了解操作规范和实验流程。
（2）工作人员应当穿着符合卫生要求的工作服和手套，避免交叉感染。
三、操作规范培训1. 样本采集：（1）样本采集应当在临床医生指导下进行，严格按照采集标本的要求进行操作。
（2）采集的样本应当尽快送交实验室进行检测，避免样本长时间保存导致细菌数量的改变。
2. 样本处理：（1）收到样本后，应当立即进行处理，避免样本受到外界污染。
（2）样本应当在无菌条件下进行离心、抽提DNA等处理工作，避免外来细菌的干扰。
3. PCR扩增：（1）PCR扩增是大肠菌群检测的关键步骤，应当严格按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。
（2）PCR扩增反应体系应当准确配制，避免试剂用量不足或过量导致扩增失败或者非特异性扩增。
4. 扩增产物检测：（1）扩增产物检测应当使用准确的方法，如琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR。
（2）扩增产物的检测结果应当与正对照和负对照比较，确保结果的准确性。
5. 数据分析：（1）检测结果应当由专门的人员进行数据分析，避免结果的误解和错误解读。
（2）对于阳性结果的样本，应当进行多次重复检测以确认结果的可靠性。
大肠菌群检测操作规范培训
详细描述
采样时，应选取有代表性的样品，如选取多个部位、多种类 型的食物进行采样。同时，采样工具应清洁无菌，避免交叉 污染。
试剂污染或失效
总结词
试剂是进行大肠菌群检测的必要物质，其质量和有效性对检测结果有很大影响。
详细描述
试剂应存放在阴凉、干燥、避光的地方，并在规定的有效期内使用。使用前应检 查试剂是否过期或变质。
确保检测设备齐全、功能 正常，校准合格证在有效 期内。
设备清洗
使用无菌棉球或纱布蘸取 75%乙醇或无水乙醇，擦 拭设备表面和内部，干燥 后进行下一步操作。
设备校准
根据设备说明书进行校准 ，确保检测结果的准确性 。
试剂配制与储存
试剂清单
列出所需试剂的名称、规格和数量，并核对试剂 的有效期。
配制方法
按照试剂说明书进行配制，注意配制环境和卫生 条件。
需根据菌落形态、革兰氏染色和生化反应等指标综合判断，以确定是否存在大肠菌 群。
在进行菌落计数时，需遵循无菌操作原则，并对各个稀释度的平板进行计数，以计 算出每克或每毫升样品中的大肠菌群数。
结果报告内容与格式
报告中需包含样品名称、来源、 检测日期、检测方法等信息。
应提供每个稀释度平板上的菌落 数及计算得出的大肠菌群数。
根据检测结果，给出样品是否符 合国家或行业标准的判定结论。
结果审核与确认
对检测结果进行审核，确保数 据的准确性和可靠性。
如发现异常数据或疑问，需要 进行复检或重新实验以确认结 果。
审核无误后，由检测人员签署 报告，并报送相关部门或客户 。
06
CATALOGUE
常见问题与解决方案
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
大肠菌群及大肠杆菌检测方法简介大肠菌群是指人和动物肠道中存在的一群细菌的总称，其中大肠杆菌是大肠菌群中的一种重要成员。
大肠杆菌是一种革兰阴性杆菌，属于肠道的常见菌群，对人体有益，并且在环境和食品中也常见。
然而，大肠杆菌也有一些致病的菌株，如致泻性大肠杆菌，会导致食物中毒和胃肠道感染。
大肠菌群检测方法大肠菌群的检测方法主要分为培养法和分子生物学方法两大类。
培养法：传统的大肠菌群检测方法是基于培养菌株的数量来进行评估。
这种方法通过将样品培养在选择性培养基上，利用大肠杆菌产生的特殊代谢产物来进行鉴定。
这一方法简单易行，成本较低，但存在一些局限性，如培养时间长，只能检测活菌，对于非培养性细菌较为困难。
分子生物学方法：分子生物学方法包括PCR和实时荧光定量PCR等技术，不依赖细菌的生长特性，能够快速准确地检测大肠菌群。
PCR是通过扩增大肠菌群的16SrRNA基因，然后通过电泳等方法进行检测和定量。
实时荧光定量PCR是一种更快速、灵敏和准确的检测方法，利用荧光探针技术可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠菌群的数量。
这种方法具有高度特异性和灵敏性，可以检测非活菌和少量菌。
大肠杆菌的检测方法主要分为传统培养法和分子生物学方法两种。
传统培养法：大肠杆菌的传统培养方法是将样品在选择性培养基上进行培养，利用大肠杆菌产生的代谢产物进行鉴定，并通过菌落数进行定量。
这种方法操作简单，成本较低，但存在一些问题，如需要较长时间培养（通常需要24-48小时），偶尔出现培养落阳性假阳性结果。
此外，该方法只能检测到特定培养条件下的大肠杆菌，并不能检测到非培养性或者少量存在的大肠杆菌。
分子生物学方法：分子生物学方法是通过扩增大肠杆菌特异基因或基因片段来进行检测。
常见的方法有PCR和实时荧光定量PCR。
PCR方法通过扩增大肠杆菌特异基因（如uidA基因）来进行检测，并通过电泳等方法进行鉴定。
实时荧光定量PCR是一种更快速灵敏准确的方法，可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠杆菌的数量。
大肠菌群数的测定方法
大肠菌群数的测定方法宝子，今天咱们来唠唠大肠菌群数咋测定的哈。
最常用的一种方法就是多管发酵法。
这就像是一场微生物的小比赛呢。
咱先得把样品采集好，比如说水啊或者食品之类的。
然后把样品放到乳糖胆盐发酵管里头。
这就像是给大肠菌群准备了一个特别的小屋子，要是有大肠菌群在，它们就会在这个小屋子里开始“搞事情”，发酵乳糖产酸产气。
你就可以看到小管子里有气泡啦，这时候就像是它们在跟你说“嗨，我们在这儿呢”。
要是在乳糖胆盐发酵管里有反应了，咱就得把这些有反应的培养液再接种到伊红美蓝琼脂平板上。
这个平板可神奇啦，大肠菌群在上面会长出有自己特色的菌落呢。
就像它们在这个新的舞台上展示自己独特的模样。
这些菌落可能是紫黑色的，还有金属光泽，就像一群穿着闪亮衣服的小演员。
通过数这些有特色的菌落，就能大概知道大肠菌群的数量啦。
还有一种方法叫滤膜法。
这个就像是用一个小筛子来筛出大肠菌群。
先把样品通过滤膜过滤，大肠菌群就被留在滤膜上啦。
然后把滤膜放到特定的培养基上培养。
那些大肠菌群就会在滤膜上慢慢长大，形成小点点一样的菌落。
咱们再数这些小点点，就能知道大肠菌群的数量咯。
不过呢，在做这些测定的时候呀，一定要注意卫生和操作规范哦。
就像咱们做饭得按照菜谱来一样，测定大肠菌群数也得按照严格的步骤。
不然的话，就可能得出错误的结果呢。
比如说，要是不小心把别的细菌也带进去了，那就像是一场混乱的聚会，根本分不清谁是谁啦。
总之呢，测定大肠菌群数虽然有点小复杂，但是只要按照方法来，就能够准确地知道样品里大肠菌群的情况啦。
这对保障咱们的健康可重要了呢，不管是喝的水还是吃的食物，知道大肠菌群的数量就能知道它们是不是安全的，就像给咱们的健康上了一道保险。
大肠杆菌检测步骤
餐饮具用大肠菌群测试片
采样:
（1）随机抽取消毒后准备使用的各类食具（碗、盘、杯等），取样量可根据大、中、小不同饮食行业每次采样6件～10件，每件贴纸片两张，每张纸片面积25cm²
（5cmX5cm）。
（2）用无菌生理盐水湿润大肠菌群检测用纸片后，立即贴于食具内侧表面，30s后取下，置于无菌塑料袋内.
（3）筷子以5只为一件样品，用灭菌1mL吸管吸取无菌生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹试纸片，每件样品抹拭两张，放入无菌塑料袋内。
培养：
将已采样的纸片置于37℃恒温培养箱中培养16h～18h，取出观察结果。
结果判断：
若纸片保持紫蓝色不变，或有红色斑点但斑点周围无黄晕者为大肠菌群阴性；在红色斑点周围有黄晕，或纸片变黄并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。
国家标准规定：在50cm的纸片上（即两片纸片上），大肠菌群不得检出。
大肠菌群的检测原理和方法
大肠菌群的检测原理和方法宝子们，今天咱们来唠唠大肠菌群的检测呀。
先说说检测原理哈。
大肠菌群呢，它是一群在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
这就像是给它们定了个小特征标签。
咱们利用这个特性来检测它们呢。
比如说在含有乳糖的培养基里，如果有大肠菌群，它们就会分解乳糖，让培养基的酸碱度发生变化，还可能产生气体。
就好像大肠菌群是一群小馋猫，看到乳糖这个美食就忍不住动手脚啦，然后我们就可以通过观察这些变化来判断有没有大肠菌群存在。
那检测方法呢？有好几种哦。
一种是多管发酵法。
咱先把样品接种到乳糖胆盐发酵管里，这就像是给大肠菌群安排了个小房间，看看它们会不会在这个房间里搞出动静来。
如果发酵管里有气体产生，而且培养液变浑浊了，那可能就有大肠菌群在里面嗨呢。
然后再把这些有反应的发酵管里的菌液接种到伊红美蓝琼脂平板上。
在这个平板上，大肠菌群会长出有特征的菌落哦，比如是紫黑色、有金属光泽的菌落。
这就像大肠菌群在平板上给自己盖了个独特的小房子，咱们一眼就能把它们认出来啦。
还有一种是滤膜法。
这个方法就像是给样品里的菌来个大筛选。
把样品通过滤膜过滤，大肠菌群就被截留在滤膜上啦。
然后把滤膜放到含有特定培养基的平皿里培养。
如果有大肠菌群，它们就在滤膜上慢慢长大，形成菌落。
这种方法就像是从一群小伙伴里把大肠菌群这个小群体给挑出来一样。
另外呢，还有平板计数法。
就是把样品直接接种到平板培养基上，然后数长出来的符合大肠菌群特征的菌落个数。
就像数星星一样，一个一个把大肠菌群的菌落数清楚。
检测大肠菌群可重要啦，因为它能反映出环境或者食品的卫生状况呢。
要是大肠菌群超标，那可就说明这个东西不太干净啦，可能会影响咱们的健康。
所以这些检测方法就像是一个个小卫士，帮我们把好健康的关哦。
大肠菌群的测定方法
大肠菌群的测定
灭菌：将试管、小导管、吸管、药品（配制好的月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤）用纸包好，放入灭菌锅中灭菌121℃ 15分钟。
测定：以无菌吸管吸取10ml样品放入盛有90ml生理盐水的容量瓶中，充分混匀，制成稀释度为1:10的样品匀液。
用1ml灭菌吸管吸取1:10的稀释液1ml注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀制成1:100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上述吸取1:100的稀释液1ml，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管内，混匀制成1:1000的稀释液。
每递增稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管。
一般选择三个稀释度，每个稀释度接种三个管，同时做空白对照试验，置36±1℃的恒温培养箱内，培养24±2h，如果倒管内都不产气则可报告大肠菌群阴性。
检验员：。
大肠菌群检测的实验报告
大肠菌群检测的实验报告大肠菌群检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过检测样品中的大肠菌群数量，评估其卫生质量，为食品安全和人类健康提供重要依据。
二、实验原理大肠菌群是指一群革兰氏阴性、无芽孢、兼性厌氧的细菌，主要包括埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠球菌属等。
这些细菌可在25-37℃的环境下生长，且在伊红美蓝培养基上形成典型的大肠菌群菌落。
本实验采用MPN（最大可能数）方法进行大肠菌群的检测。
通过在不同浓度的样品中接种不同体积的培养基，并按照MPN表进行统计分析，以获得样品中大肠菌群的数量。
三、实验步骤1.样品处理：将样品按照10倍递增的方式进行稀释，以适应不同浓度的大肠菌群检测。
2.接种培养：分别取0.1mL、0.01mL、0.001mL的样品稀释液，接种于伊红美蓝培养基中，每个稀释度接种三管。
轻轻摇匀，倒置培养。
3.培养观察：将培养基放入37℃的培养箱中，培养24小时。
观察每个稀释度的培养管中是否有典型的大肠菌群菌落形成。
4.结果统计：根据MPN表，统计每个稀释度下形成菌落的管数，并计算大肠菌群的数量。
5.结果报告：根据实验数据，得出样品中大肠菌群的数量，并评估其卫生质量。
四、实验结果与分析经过24小时的培养观察，我们发现样品稀释度为10倍和100倍的培养管中形成了典型的大肠菌群菌落。
根据MPN表进行统计分析，得出样品中大肠菌群的数量为9.0×10²CFU/mL。
根据国家相关标准，该样品的大肠菌群数量超过了安全阈值（<10³CFU/mL），因此该样品的卫生质量不达标。
五、结论与建议通过本实验的检测和分析，我们得出样品中大肠菌群的数量超出了安全阈值，说明该样品的卫生质量不符合要求。
这可能是由于生产过程中的污染、储存条件不当或运输环节不卫生等原因导致的。
为了确保食品安全和人类健康，建议相关部门加强对食品生产和流通环节的监管力度，提高食品产业的卫生质量标准，并采取有效的措施确保食品的安全性。
大肠菌群测定实验报告
1. 了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。
2. 学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法。
3. 通过实验，判断食品的卫生质量。
二、实验原理大肠菌群是指一群能在37℃经24小时发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
食品中大肠菌群数系以每100g检样内大肠菌群最近似数表示。
本实验采用多管发酵法进行大肠菌群的测定。
三、实验材料1. 样品：乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。
2. 菌种：大肠埃希氏菌产气肠杆菌。
3. 培养基及试剂：单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)。
4. 其他设备和材料：恒温培养箱、无菌操作台、移液器、酒精灯、培养皿、试管、玻璃棒等。
四、实验方法1. 样品预处理：取适量样品，用无菌生理盐水进行10倍稀释，制成1:10、1:100、1:1000的稀释液。
2. 初步发酵试验：将不同稀释度的稀释液分别接种于乳糖胆盐发酵管中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
3. 观察结果：若发酵管中有气体产生，培养基颜色由紫色变为黄色，则表明该稀释度中有大肠菌群生长。
4. 平板分离：将初步发酵试验中呈阳性的稀释液进行10倍稀释，分别取0.1ml接种于伊红美蓝琼脂平板上，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。
5. 计数：观察平板上的菌落，根据菌落特征进行计数，计算每100g检样内大肠菌群数。
以1:100稀释液为例，接种于伊红美蓝琼脂平板上，培养24小时后，观察到平板上有5个菌落，均为典型的革兰氏阴性杆菌。
根据菌落计数公式，计算每100g检样内大肠菌群数为：N = C / V × M其中，N为每100g检样内大肠菌群数；C为菌落数；V为接种量；M为稀释倍数。
N = 5 / 0.1 × 100 = 500六、实验结论根据实验结果，该食品中每100g检样内大肠菌群数为500，符合食品安全标准。
mpn计数法大肠菌群检测流程
mpn计数法大肠菌群检测流程大肠菌群检测中的MPN计数法，超有趣的哦！咱先来说说啥是大肠菌群。
大肠菌群呀，就像是一群小调皮，它们住在我们周围的环境里，像土壤呀、水呀，还有好多食物里面也可能有它们的身影呢。
那为啥要检测它们呢？因为它们要是太多了，就可能会让我们身体不舒服，比如肚子疼之类的，所以检测它们可重要啦。
那现在就进入正题，MPN计数法是咋检测大肠菌群的呢？一、样品采集。
这就像是一场寻找大肠菌群的小冒险。
如果是检测水，就得用专门干净的瓶子，在合适的地方取水样。
要是检测食物，那也得按照正确的方法取到有代表性的样品哦。
比如说要检测一块蛋糕，不能只取表面好看的那一点，得从不同的地方取一些，这样才能准确找到可能存在的大肠菌群。
二、样品稀释。
取到样品之后呢，就要开始稀释啦。
就像把一群密密麻麻的小虫子分散开一样。
把样品放到合适的溶液里，然后按照一定的比例不断地稀释。
这个过程得特别小心，要是比例弄错了，后面的检测可就不准啦。
三、接种培养。
这一步就像是给大肠菌群安排一个小房子，让它们在里面生长。
把稀释好的样品接种到专门的培养基里，这些培养基就像是给大肠菌群特制的小餐点，只有它们喜欢吃，然后放到合适的温度和环境里培养。
这个温度可不能随便乱调哦，就像我们人在合适的温度下才舒服，大肠菌群也一样，一般是37℃左右，它们就会快快长大啦。
四、观察结果。
经过一段时间的培养，就可以去看看成果啦。
看看培养基里有没有发生一些特殊的变化，比如说有没有产气呀，有没有菌落长得很特别呀。
如果有产气的现象，那就很可能有大肠菌群在里面开派对呢。
然后根据这些现象，通过一些特殊的表格或者计算方法，就能大概算出样品里大肠菌群的数量啦。
不过在整个过程中呀，一定要特别特别细心。
每一个步骤都像是搭积木，要是有一块搭歪了，整个城堡可就不牢固啦。
而且要保持实验环境的干净整洁，就像我们自己住的小窝一样，干净了才舒服嘛。
要是不小心把别的细菌也带进去了，那可就乱套啦，就分不清哪些是大肠菌群，哪些是不请自来的小客人啦。
大肠菌群检测操作规范培训(ppt 49页)
6、大肠杆菌分裂照片
三、检测仪器、设备
冰箱：0～4℃ 恒温培养箱：36±1℃ 恒温水浴锅：46±1℃ 微生物显微镜
架盘药物天平：0g～500g，精确至0.5g 三角瓶：500ml 灭菌吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径90mm 试管：18×180mm
四、检测培养基及试剂
八、注意事项
乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试 管，若有气泡上冒，也算产气。
在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属 光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。
伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板 检测。 37.5g于1升蒸馏水中，摇匀，加热 煮沸，121℃15分钟高压灭菌。
五、检测前培养基准备
检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培 养基小导管内是否有气体。
按产品品种将培养基分别放在试管架内， 同时将9ml 0.85%灭菌盐水管也放入相应的 试管架内。
5、接种后培养
将接种完的试管连同试管架一起置于 36±1℃的培养箱内培养24±2h，观察乳糖 胆盐发酵管的变化情况。
6、结果查询并记录
若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则 报告大肠菌群阴性。
若有产酸产气，则要做证实试验。
（三）证实试验
1、伊红美蓝琼脂平板分离 将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分
1、细菌的形态
细菌个体微小、形态各异 球菌 杆菌 弧菌与弯曲菌 螺旋菌及螺旋体 不规则形
弧菌
2、细菌的结构
细菌的基本结构包括：细胞壁、 细胞膜、 间体、细胞浆、核糖体、细胞质。
细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、 菌毛和芽胞。
3、细菌的繁殖
细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁 殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二， 然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质 膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔 壁，这样便产生两个子细胞。
水环境卫生细菌学检测—大肠菌群检验
六、任务考核
考核内容
考核指标
培养基制作 是否规范
乳糖发酵
无菌操作、整个过程操作的规范性
平板分离培养
划线方法、取菌前后的操作规范、划 线操作规范
革兰氏染色
是否熟练、规范，判断是否准确
数量检索与报告 方法是否正确
分值
25 20
20
15 20
大肠埃希氏菌检验
教学内容
1. 大肠埃希氏菌的性状特点； 2.检测各环节操作规范。
（3）素质态度要求
态度端正，积极主动学习，严守操作规范，团结协作。
一、大肠菌群检验原理与程序
大肠菌群是水体粪便污染的指示菌。天然水体的细菌性污染主要源于 生活污水中的粪便，其中可能病原菌种类很多，而大肠菌群是数量最大的， 可以用作水体粪便污染状况的指示菌。
大肠菌群的类别特征：37℃24~48h能利用乳糖产酸产气，好氧和兼性 厌氧，Ｇ-，无芽胞。
二、检验程序
检样乳糖发酵 EC-MUG培养基管培养
结果报告
紫外荧光 检验
准备工作：
1．培养基： 乳糖蛋白胨液体培养基（同大肠菌群检验）
EC-MUG培养基：
胰蛋白胨20g、乳糖5g、3号胆盐或混合胆盐1.5g、磷酸氢二钾 4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、4－甲基伞形酮－β－D－葡萄糖 醛酸苷（MUG）0.05g，pH6.9。
操作的规范性、荧光的观察判断是否 正确
数量检索与报告 方法是否正确
分值
20 20
40
20
大肠菌群检验
教学内容
1.大肠菌群检验原理； 2.大肠菌群检验的程序； 3.检测各环节操作规范。
教学目标
（1）知识目标
• 大肠菌群的性状特征； • 多管发酵法检验原理； • 检验各环节的特征性表现。
mpn法检测大肠菌群的流程
mpn法检测大肠菌群的流程一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好呢。
那都需要啥呢？有培养基呀，像月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤，这可是很关键的东西哦。
还有小试管，得准备好多好多干净的小试管呢。
再有就是移液枪啦，这就像是我们的魔法棒，能准确地吸取各种液体。
当然啦，样品也是必不可少的，如果没有样品，咱检测个啥呀，是不？在准备这些东西的时候呀，可一定要小心，就像照顾小宝贝一样，要保证它们都是干净、无菌的。
二、样品处理。
拿到样品之后，咱不能就直接检测呀。
如果是固体样品，得把它弄成液体的状态呢。
这就好比你要吃一块硬邦邦的饼干，得先把它泡软了才能咽下去一样。
一般是按照一定的比例，把固体样品加到无菌的稀释液里，然后充分地摇晃，让它均匀混合，就像调一杯美味的果汁一样，得让里面的东西都融合好。
要是液体样品呢，那就相对简单一点啦，但也得适当稀释一下，让里面的微生物数量不会太多，不然到时候都数不过来啦。
三、接种。
接下来就是接种这个大工程啦。
用移液枪把处理好的样品液，按照不同的量接种到装有月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤的小试管里。
这就像是给小试管里的培养基送进去一些小客人，也就是可能存在的大肠菌群。
这个接种量可不能马虎哦，多一点少一点都可能影响最后的结果呢。
接种的时候感觉自己就像个小小的科学家，在做着超级精密的实验。
四、培养。
接种完了，就把这些小试管放到培养箱里去啦。
这个培养箱就像是小试管们的小房子，温度和湿度都得刚刚好。
一般是在36℃左右的温度下培养24 - 48小时呢。
在这个过程中呀，小试管里就像一个小小的世界，那些大肠菌群如果存在的话，就在里面悄悄地生长、繁殖。
我们就只能在外面耐心地等着，就像等着小种子发芽一样，心里充满了期待又有点小紧张呢。
五、观察与结果判断。
等培养的时间到了，就可以把小试管拿出来观察啦。
这时候就看小试管里的肉汤有没有变化。
如果有产气的现象，就是小试管里有小气泡，那就有可能有大肠菌群在里面开派对啦。
然后呢，根据不同接种量的小试管的产气情况，去查MPN表，就像查字典一样，从表里面找到对应的大肠菌群最可能数。
大肠菌群测定实验报告
大肠菌群测定实验报告大肠菌群测定实验报告引言：大肠菌群是人体肠道中的一类重要菌群，对人体健康起着至关重要的作用。
本实验旨在通过测定大肠菌群的数量和种类，了解其在人体健康中的重要性，并探讨不同因素对大肠菌群的影响。
实验方法：1. 实验材料准备：收集参与实验者的粪便样本，标记编号。
2. 样本处理：将粪便样本均匀取样，并加入适量的生理盐水进行稀释。
3. 菌落计数：将稀释后的样本分别均匀涂布在含有营养物质的琼脂平板上，进行培养。
4. 菌落观察：观察培养后的琼脂平板上的菌落形态，记录不同形态的菌落数量。
5. 菌种鉴定：通过形态学特征和生化试验等方法，对菌落进行鉴定，确定大肠菌群的种类。
实验结果：经过菌落计数和菌种鉴定，我们得到了以下实验结果：1. 大肠菌群数量：参与实验者的大肠菌群数量在不同个体间有所差异，平均菌落计数为X CFU/g。
2. 大肠菌群种类：通过菌种鉴定，我们确定了参与实验者大肠菌群的主要种类，包括大肠埃希菌、肠球菌等。
讨论：1. 大肠菌群与人体健康：大肠菌群在人体健康中起着至关重要的作用。
它们参与食物消化、维持肠道黏膜屏障功能、合成维生素等多种生理过程。
因此，大肠菌群的数量和种类的稳定与人体健康密切相关。
2. 影响大肠菌群的因素：大肠菌群的数量和种类受到多种因素的影响，包括饮食习惯、生活环境、抗生素使用等。
不良的饮食习惯、环境污染以及滥用抗生素可能会导致大肠菌群失衡，从而引发肠道疾病。
3. 维护大肠菌群健康的方法：保持均衡的饮食，摄入足够的膳食纤维和益生菌，避免滥用抗生素，定期进行大肠菌群检测等，都是维护大肠菌群健康的重要方法。
结论：通过本次实验，我们了解到大肠菌群在人体健康中的重要性，并明确了影响大肠菌群的因素。
为了维护大肠菌群的健康，我们需要注意饮食习惯、生活环境以及合理使用抗生素等。
进一步研究大肠菌群与人体健康的关系，有助于预防和治疗肠道相关疾病，提高人体健康水平。
参考文献：1. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., & Finlay, B. B. (2010). Gut microbiota in health and disease. Physiological reviews, 90(3), 859-904.2. Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K. S., Manichanh, C., ... & Wang, J. (2010). A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 464(7285), 59-65.。
大肠菌群检测知识及MPN法检测的注意要点
大肠菌群检测知识及MPN法检测的注意要点一、大肠菌群的定义：1、指一群在36。
C条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2、该菌群主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。
3、大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是一组与粪便污染有关的细菌。
这群细菌包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌。
4、生化特征及血清学反应并非完全一致。
5、典型大肠杆菌的IMVIC与硫化氢试验结果：++--。
二.分布：1广泛分布于自然环境。
2、来源于人和温血动物的粪便。
三.卫生学意义：1大肠菌群作为粪便污染的指标菌评价样品中是否受到粪便的污染。
2、大肠菌群计数的高低，直接反映了样品受粪便污染的程度。
3、表示对人体健康是否具有潜在的危险性。
大肠菌群是理想的粪便污染的指标菌4、是人类和温血动物肠道菌群，在数量上占优势。
5、随粪便排出体外后，在外界环境影响下，其存活时间应与肠道致病菌大致相似或稍长。
6、检验方法简便，易于检出与计数。
7、对消毒剂的抵抗力应不低于肠道致病菌。
四、大肠菌群在不同培养基上的形态：1大场菌群在1ST培养基里阳性结果2、大场菌群在BG1B培养基里阳性结果3、大场菌群在结晶紫中性红胆盐琼脂VRBA上的菌落特征4、大场菌群在去氧胆酸钠盐琼脂上的菌落特征5、大场菌群在伊红美蓝琼脂上的菌落特征6、大场菌群在显色培养基上的菌落特征五、大肠菌群检验MPN法接种量剖析：接种量问题，GB4789.3-2016中7.2初发酵试验规定〃选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管1ST肉汤，每管接种Im1（如超过Im1,则用双料1ST）〃。
这里所说的接种量Im1并非Im1样品接种量（即MPN检索表中的Im1样品接种量）,而是接种的稀释液的体积V=Im1（为了区分，本文中用V表示），那么实际的接种量m（为了区分,本文中用m来表示）为mχp（p为稀释液浓度）。
大肠菌群检测的实验报告
大肠菌群检测的实验报告
实验目的：通过对人体大肠菌群的检测，了解大肠菌的数量以及种类，了解人体各部位的大肠菌群构成情况，为日后的健康管理提供参考。
实验原理：人体内的大肠菌群是一种重要的微生物群落，它们的数量和种类与人体健康息息相关。
大肠菌群检测主要通过分析大肠菌的16S rRNA序列来进行。
通过PCR扩增出大肠菌的16S rRNA序列，再通过测序和分析，可以得出大肠菌群中的菌种种类和数量。
实验方法：
1.取样：分别在口腔、鼻腔、肛门和菌群丰富的位置进行取样。
使用无菌棉签分别取样，并放入无菌离心管中。
2.样本处理：将无菌棉签浸入1ml的TE buffer中，并摇动离心管使样本均匀悬浮。
3.菌 DNA提取：使用实验提供的菌 DNA提取试剂盒进行DNA提取。
4.检测菌群：将提取的DNA放入PCR反应管中，进行PCR扩增。
所得产品用于测序和分析。
结果分析：通过测序和分析，得出大肠菌群中的菌种种类和数量，并进行比对分析。
根据比对结果，得出人体各部位的大肠菌群构成情况。
实验结论：大肠菌群检测可得出人体各部位的大肠菌群构成情况，对于日后的健康管理和疾病预防有重要意义。
例如，通过检测可发现大肠菌群丰富的位置，提示该部位易感染细菌，需要加强卫生管理；另外，检测还可以判断肠道微生物失衡的情况，便于及时调节饮食和睡眠习惯等生活方式，维护肠道健康。
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法进入无菌室步骤1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。
5—1小时。
2．关灯后0•5小时后放可进入。
3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套实验步骤1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。
（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml）8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。
）10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。
（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。
所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面）13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。
（方法见标准）15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
但是，如果上面的产品要求MPN<5 /100 克，这是一个极端的例子，如果采用加样量 为3.33克，9管全阴性，也是得不到合适的 结果的，这样的话就应该采用加样量为33.3 克的规范做法。
再举两个极端的例子： 产品要求<5/吨（当然这是不可能的）， 那么如果你采用0.333克加样量，然后进行 换算，是没有任何意义的，如果真要测定， 就需要采用333千克的加样量。当然，这种 情况是不会发生的。
在实验中如何选择合适的稀释度？
MPN表
1、新国标的MPN表的基准问题: 新国标的MPN表采用了3个稀释度，分 别是十倍－百倍－千倍，加样量是3管，每 管1毫升，意味着加入样品的量为0.333克。 在样品加入量为0.333克的情况下，使 用新国标MPN表，得到MPN/克 的数值。
2、改变加样量的问题。 在实际操作中，因为一些原因需要改变 加样量，一般是10倍增加或者降低，同样使 用本表，得到的数值需要做10倍调整。 下面我们一起来看几个例子！ ↓↓
3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其 他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 电子天平：感量 0.1 g。 均质器、振荡器、接种环
无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、 10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器 及吸头。 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 无菌培养皿：直径 90 mm。 杜氏小管 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。
因此，根据《瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》 大肠菌群MPN/100ml： ≤3的标准。此次 实验需要用到双料和单料LST肉汤，其中双 料LST肉汤3管，单料LST肉汤6管，水样量 为10ml、1ml、0.1ml，且每一稀释度接 种3管。
小结
从这个意义上讲，稀释度的选择是根据产品 要求进行的，理论上： 如果要求得到每克产品菌群含量，加样 量应该是0.333克比较合适。 如果要求得到每10克产品菌群含量，加 样量应该是3.33克比较合适。 如果要求得到每100克产品菌群含量， 加样量应该是33.3克比较合适。
当然，对于上面的产品要求MPN<30 /100 克，采用加样量为33.3克，会比较麻烦，大 家可以采用加样量为3.33克，要求9管全阴 性，这样也可以说的过去。
食品中大肠菌群数是指以1毫升（或1克）检 样中大肠菌群最可能数（MPN）来表示。本 实验依据GB 4789.3-2010制定。
三、设备和材料 设备： 恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、电子天平、 均质器、振荡器、无菌吸管、无菌锥形瓶、 无菌培养皿、菌落计数器、PH试纸、接种 环、杜氏小管、试管等。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品 置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的 无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃 珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械 振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品 匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述 操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。 每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸 头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过 程不得超过15min。
比如： 加样量为3.33克，这样查表得到的数值，应 该降低10倍。 如果其阳性管为2－1－0，查表为15，这样 的话，结果应该为 MPN 1.5/克，或者MPN 15/10克，或者MPN 150/100克。
再比如： 加样量为0.0333克（这样的情况是， 不使用十倍稀释液，而使用百倍－千倍－万 倍稀释液，各用三管，每管1毫升）。这样 查表得到的数值，应该增高10倍。 如果其阳性管为2－1－0，查表为15， 这样的话，结果应该为 MPN 150/克，或者 MPN 1500/10克，或者MPN 15000/100 克。
食品微生物学检验
大肠菌群计数（GB 4789.3-2010 ）
大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需 氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据 卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的 细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便 污染的指示菌，根据进一步的生化试验，可将 这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆 菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴 沟肠杆菌等。
（二）初发酵试验 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每 管接种1mL，36℃± 1℃ 培养48h±2h, 观察倒管内是否有气泡产生，产气者进行复 发酵实验，未产气者为大肠菌群阴性。
（三）复发酵实验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养 物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管 中, 36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。 产气者,计为大肠菌群阳性管。
矿泉水
10ml 1ml 0.1ml
根据初发酵和复发酵产气情况填写表格，产气记为“+”； 不产气记为“—”，最后根据产气管数对照MPN表格得出 最后的结论。
10版MPN表
03版MPN表
瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》(GB 17324-2003) 细菌菌落总数cfu/ml： ≤20 大肠菌群MPN/100ml： ≤3
7.3 复发酵试验(证实试验) 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养 物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管 中, 36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。 产气者,计为大肠菌群阳性管。 7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告 按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠 菌群的MPN值。
7.2 初发酵试验 每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品 匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接 种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每 管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 LST肉汤),36℃± 1℃ 培养24h±2h,观察 倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进 行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培 养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未 产气者为大肠菌群阴性。
培养基和试剂： 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿 乳糖胆盐肉汤（BGLB）、无菌生理盐水、 NAOH和HCL标准溶液。
四、操作步骤： 1、液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置 盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌锥形瓶中振摇,充分混匀,制成1∶10的样 品匀液。 2、样品匀液的PH值应在6.5~7.5之间，必 要时可用标准溶液调节PH值。
这样的话，就需要增加加样量，变成加样量 为3.33克，如果全部是阴性0-0-0，得到结 果为<0.3/克，或者是<3/10克，或者是 <30/100克。这样的结果才能符合要求。 如果更精确的操作，应该是加样量为 33.3克。这样如果全部是阴性0-0-0，得到 <3/100克，结果为2-1-0，得到MPN 15/100克，也是合格产品。
第一法 大肠菌群 MPN 计数法
操作步骤 7.1 样品的稀释 7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放 入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的 无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min 均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍 击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的 样品匀液。
4 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐 （Brilliant Green Lactose Bile，BGLB） 肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA） 磷酸盐缓冲液、9毫升无菌生理盐水、 无菌 1 mol/L NaOH、无菌 1 mol/L HCl
3、用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇 试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其 混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
4、根据对样品污染状况的估计,按上述操作, 次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递 增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不 得超过15min。
第二法 大肠菌群平板计数法
矿泉水中大肠菌群的测定
一、实验目的 1、了解大肠菌群在食品检验中的意义 2、掌握矿泉水中大肠菌群的检验原理和测 定方法； 3、熟练稀释分离和无菌操作技术
二、实验原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气， 需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便 指标来评价食品的卫生质量，并推断食品是 否污染肠道致病菌。
产品要求<10000/克（1万/克），如果你 采用0.333克加样量，即便是9管全部产气， 得到>1100/克，这也是没有任何意义的， 还是没有办法来判断产品是否合格。这里就 可以看做是要求<1000/0.1克，或者 <100/0.01克，或者是<10/0.001克，采 用的方法应该是加样量为0.0333克，或者 是0.00333，或者是0.000333克。
7.1.3 样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必 要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl调 节。 7.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注 意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇 试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其 混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
3、关于和产品标准对应的问题。 大家应该注意到，这个问题其实是一个 稀释度的选择问题。另外，这个问题也可以 回答是否可以直接换算的问题。