构建表达载体的实验流程及其注意事项2014-12

5’p G 3’OH
5’p CTGCA 3’OH
3’OH CTTAA 5’p 3’OH G 5’p
Sma I
CCCGGG GGGCCC
注意： 1、不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的； 2、同一公司的酶，使用相同的缓冲液或不同的缓冲液而
不显著影响酶活性时，可同时做双酶切。 3、一种酶可能有几种缓冲液。
2、反应体系
10× ligation buffer T4 ligase（5U/μL） 载体片段 目的片段 灭菌的双蒸水
ห้องสมุดไป่ตู้
1.0 μL 0.2 μL
补足到10.0μL
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注意：
1、 一定要检测回收效果，带亮（浓度高）方可用于下一步连接。
通常，重组分子只有几十万分之一。
回收片段中无酒精等影响连接的残留。
一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。
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遗传转化所用载体（1）
一、基因枪转化
1、对载体类型无选择； 2、载体不宜过大，目的基因不宜过大。 3、可以转化 “启动子-目的基因-终止子” 片段。
二、农杆菌转化
1、农杆菌载体，含有左右边界； 2、 可以转化大的目的基因。
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候选基因功能分析
2、将目标片段、载体片段的泳道相邻，根据亮度估测其浓度。
连接时，目的：载体=3：1（分子个数）
别忘记长片段插入的EB多。分子个数一样多时，长片段更亮。
3、 如果是单酶切，为了防止载体自身环化，可以用牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）处理，去掉酶切后5‘端的磷酸。
酶切结束，向酶切体系中加入1.0μL CIP，37 ℃ 0.5-1hr即可。
所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点
二、PCR法
1、 无内含子，可用基因组DNA为模板，有内含子则用cDNA。 2、若PCR难度很大，宜将PCR产物连到克隆载体上，测序后，再酶切 连接到表达载体上。不推荐直接酶切PCR产物。 3、在加loading buffer前，可取出几微升，作为二扩模板。 4、设退火温度梯度，多做几管。回收时损失大半。 5、尽管PCR产物只有一条特异带，电泳挖取目标带也是必要的。
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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如何阅读质粒图谱
1、质粒类型和大小（真核/原核/穿梭质粒） 2、复制起点（ori） 3、筛选标记（抗生素标记） 4、多克隆位点（MCS） 5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位点） 6、表达系统元件
其它的DNA、其它的内切酶或DNA酶
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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过柱法回收
1、PCR产物带 2、酶切片段
注意： 1） 电泳的带要亮：要求PCR体系、酶切体系要大。 2） 柱子上的树脂吸附能力有限 3）尽量让酒精等挥发彻底，以免影响后续的连接反应。 4）凝胶回收试剂盒是否失效（盐离子浓度：KI） 5）洗脱液体积一定大于临界值。预热。
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质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
2、PCR验证
如：用目的基因引物扩增，检查目的基因是否存在
3、测序验证
最后的选择。
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世间无难事，
只怕有心人。
2012-03-15
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人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。
4、 对照质粒生长，而连接产物转化不成功，这说明你的连接是不成 功。
5、连接液不能反复多次冻溶，因为里面含有ATP。建议不要使用 生产日期不明的连接酶和连接液（看似很会过日子，实际是个 败家子）。
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。
氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。
Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。
卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。
卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。
2、溶液配制：
一、超表达载体
1、CaMV 35S启动子； 2、玉米Ubi启动子； 3、其它。
二、RNAi载体
1、含有intron，转录后形成发卡，沉默效率高； 2、 多用其本身启动子。
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汇报内容
1 载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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一、克隆位点的选择
1、首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。 2、然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的 酶切位点。
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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连接反应
1、连接方法
1）4 ℃，2-3d：酶活低，粘性末端的氢键结合稳定 2）37 ℃，2hr：酶活高，氢键结合不稳定。5×ligation buffer 3）16 ℃，过夜：发挥酶活性，兼顾粘性末端短暂配对结构的稳定
37℃培养过夜，观察结果 6. 将150mL锥形瓶中放入5～10mL培养基，加入抗生素，挑取
菌斑，250转/min振荡培养过夜。（摇菌前可先做菌液PCR） 7. 提取质粒，电泳，酶切
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重组质粒筛选
1、抗生素筛选法 2、互补法
蓝白斑筛选： PUC系列载体含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和 头１４６个氨基酸偏码区。 DH5α含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。
（启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号）
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常用抗生素抗性基因
1、杀菌机理： 四环素（tet): 四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。
Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合
热激转化
1. 手持冰盒到-80 ℃ 冰箱前，取出感受态管，插入冰中。 2. 手指捏感受态管底2-4sec使其融化后，加入连接产物，枪尖
温和搅匀，于冰上30min。 3. 42℃水浴90sec（一定要准确，不要时间过长）。 4. 冰浴２min后，加入800μL的LB在37 ℃振荡30～45min。 5. 取200μL涂布于含Amp(50μg/mL)等相应抗生素的 平板，
3、PCR、酶切
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质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
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核酸酶操作注意事项
通常，不同公司出产的内切酶，它的菌株来源、制备工艺、纯 度及活力、酶切活性的优化等都可能存在不同，试剂公司会对自 己的内切酶进行比较全面的分析。因此，说明书及目录中的技术 资料是最具有针对性的资料。
注意事项： a. 内切酶如无特殊要求，应该保存在-20~-30度。 温度过低：酶会冻结，反复冻融，降低酶活 温度过高： b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。 不可用手捏管底部 移液器吸取时，酶管不可离开冰面。 c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。 d. 吸取酶时的tips，最好是长些。
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分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践， 却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若 一着不慎，即会陷入困境。
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
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怎样使用公司目录
不同酶的反应缓冲液及活性 双酶切 酶切后具有共同的粘性末端
酶的质量标准 酶活单位：酶量，时间 酶的浓度：10 units/uL; 20 uints/uL等 保存条件: -20～-30 ℃ 切割位点：有无其他活性 酶切体系: buffer及与其它酶双切的buffer等 所用底物： DNA量，切后再连接的程度 反应温度：一般为37℃,但许多酶对温度有特殊要求 甲 基 化： 星 活 性: 所加酶量过多 保护碱基:
TER： （ TE，pH 8.0，含RNase 20μg/mL） 去除RNA
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质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
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质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
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汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
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内切酶buffer
盐离子 promega TaKaRa NEB
低--中--高 A—B—C—D
L—M—H 1—2—3—4
…… K
……
通用
1、双酶切时注意buffer的选择； 2、酶在非最优buffer中的活性会降低，应调整酶量和反应时间。
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一）酶切不开或酶切不完全 ？？
1、质粒不纯：
杂蛋白（A260/A280＜1.8 ）；抑制剂（酚、盐、乙醇 ）
2、酶失活：
有过期时间（能有效酶切，可继续使用 ）；存放、使用不当
3、buffer：
是否充分化融；双酶切
4、保护碱基： 5、甲基化：
甲基化缺陷的菌株
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二）酶切后电泳时出现smear？？
1、内切酶含量过高
内切酶含量＜酶切体系的10％
2、星活性：
甘油浓度、离子浓度、反应温度、酶含量、反应时间
3、污染：
二、保护碱基数（直接酶切PCR产物）
1、在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基。 2、 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正 常进行； 有些则加3个以上，NdeI就属这类，需加入至少6个保护碱基，常用的 HindIII也要三个。
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目的基因获得
一、从已有载体上截取
构建表达载体的 实验流程及其注意事项
中国农业大学 梁荣奇
把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需 的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体
注意事项：
-- 选择合适的载体 -- 载体具有适合的酶切点 -- 适合地连接反应 -- 选择适合扩增质粒的菌株 -- 筛选、验证目的克隆 -- 转化对照