发光免疫分析技术
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22
问题二:
（直接）化学发光免 疫分析
化学发光剂
• 吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光
（470nm）
24
制备吖啶酯标记物
• 利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗体分子 中的羧基，再与吖啶酯中的氨基结合形成酰胺 键。
25
微粒子分析模式
26
双抗体夹心化学发光免疫分析
27
直接化学发光免疫分析
• (直接)化学发光免疫分析 – chemiluminescence immunoassay
• 电化学发光免疫分析 – electrochemiluminescence immunoassay
9
化学发光免疫技术
发光酶免疫分析
化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
10
问题一:
发光酶免疫分析
酶免疫分析的发光底物
• 吖啶酯发光的氧化反应简单快速： • 具备较低背景，确保敏感度； • 吖啶酯容易标记，稳定也保存： • 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要求较高；
28
问题三:
电化学发光免疫分析
发光剂
三联吡啶钌作为发光剂
30
发光剂
• 三联吡啶钌
– 吡啶（氮杂苯） – 联吡啶 – N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 – 三联吡啶钌活性衍生物
发光免疫分析技术
临床免疫学教研室
李会强 教授
发光免疫分析
• 将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。方法不仅具有发光分析的高 灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具 有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成 为生物学研究领域中一种新的重要分析手段。
2
标记免疫分析
• 发展历史： – 放射免疫分析（60年代） – 酶免疫分析（70年代） – 发光免疫分析（80年代）
பைடு நூலகம்
350nm
14
AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
15
4-MUP
激发后发射荧光
448nm
360nm
16
双抗体夹心化学发光酶免疫分析
17
双抗体夹心荧光酶免疫分析
18
仪器设备
• 直接检测
– 鲁米诺（HRP） – VITROS Eci 全自动增强化学发光免疫分析系
统（ABS、发光增强剂） – 金刚烷（AP） – Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
38
问题四:
荧光偏振免疫分析
检测原理
光线通过偏振滤 光片后，形成一 个方向的平面光 称为偏振光。
偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～ 550nm)
40
检测原理
41
检测原理
42
检测原理
[荧光偏振]雅培AxSYM 全自动免疫分析
仪
43
时间分辨荧光免疫分析
44
荧光素
• 辣根过氧化物酶 – 鲁米诺及其衍生物 – 对-羟基苯乙酸(HPA)
• 碱性磷酸酶 – 4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二 氧乙烷(AMPPD) – 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
12
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
13
HPA
激发后发射荧光
450nm
48
技术类型
• 双抗体夹心法
– 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形 成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物， 酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发 射613nm荧光。
49
技术类型
• 双抗体夹心法
➢E
➢E
u
➢DELFIA labeled detection
u
antibody
镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需 应用双功能基团的螯合剂，形成镧系元素离子螯合剂-抗原（或抗体）复合物。
双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）
标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+
➢Virus
➢Capture antibody ➢Solid support
50
技术类型
• 三丙胺（TPA）
31
电化学发光原理
32
电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由 基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
33
电化学发光原理
二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
34
电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
35
标记物的制备
45
荧光素
46
技术类型
• 固相抗体竞争法
– 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光 强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
47
技术类型
• 固相抗原竞争法
– 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记 抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测 定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
3
发光免疫分析
• 主要特征： – 发光剂作为标记物 – 纳米微球作为固相载体 – 自动化水平
4
Type of LIA
Luminescence Immunoassay, LIA
1.Fluorescence Immunoassay ,FIA 2. chemiluminescence immunoassay ,CLIA
5
发光现象
• 一种物质由电子激发 态回复到基态时，释 放出的能量表现为光 的发射，称为发光 。
6
发光类型
光照发光 化学发光 生物发光
7
生物发光类型
8
化学发光 (chemiluminescence)
• 化学发光酶免疫分析 – chemiluminescence enzyme immunoassay
• 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学发光分 析的标记物，分子中含有N-羟基琥珀酰胺 （-NHS）可以抗体、抗原分子中的氨基结 合形成稳定化合物。
• 三丙胺（TPA）作为电子供体，参与电极表 面的氧化还原反应。
36
电化学发光免疫分析（双抗体夹 心）
37
电化学发光免疫分析
罗氏电化学发光仪E170S
19
仪器设备
– 微粒子发光酶免疫分析
• 固相材料
– 700 nm微球
• 德国西门子公司
– Immulite 免疫分析仪
20
仪器设备
• 激发后检测
– 4-MUP – 美国雅培公司
• AxSYM免疫发光分析仪
– 发光酶免疫分析（荧光酶免疫） – 荧光偏振免疫分析
21
96-T板式酶促发光免疫分析 • 96-T 微孔板 – 优势 • 适合批量操作 – 缺点 • 抗体包被容量 • 固相反应模式
问题二:
（直接）化学发光免 疫分析
化学发光剂
• 吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光
（470nm）
24
制备吖啶酯标记物
• 利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗体分子 中的羧基，再与吖啶酯中的氨基结合形成酰胺 键。
25
微粒子分析模式
26
双抗体夹心化学发光免疫分析
27
直接化学发光免疫分析
• (直接)化学发光免疫分析 – chemiluminescence immunoassay
• 电化学发光免疫分析 – electrochemiluminescence immunoassay
9
化学发光免疫技术
发光酶免疫分析
化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
10
问题一:
发光酶免疫分析
酶免疫分析的发光底物
• 吖啶酯发光的氧化反应简单快速： • 具备较低背景，确保敏感度； • 吖啶酯容易标记，稳定也保存： • 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要求较高；
28
问题三:
电化学发光免疫分析
发光剂
三联吡啶钌作为发光剂
30
发光剂
• 三联吡啶钌
– 吡啶（氮杂苯） – 联吡啶 – N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 – 三联吡啶钌活性衍生物
发光免疫分析技术
临床免疫学教研室
李会强 教授
发光免疫分析
• 将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。方法不仅具有发光分析的高 灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具 有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成 为生物学研究领域中一种新的重要分析手段。
2
标记免疫分析
• 发展历史： – 放射免疫分析（60年代） – 酶免疫分析（70年代） – 发光免疫分析（80年代）
பைடு நூலகம்
350nm
14
AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
15
4-MUP
激发后发射荧光
448nm
360nm
16
双抗体夹心化学发光酶免疫分析
17
双抗体夹心荧光酶免疫分析
18
仪器设备
• 直接检测
– 鲁米诺（HRP） – VITROS Eci 全自动增强化学发光免疫分析系
统（ABS、发光增强剂） – 金刚烷（AP） – Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
38
问题四:
荧光偏振免疫分析
检测原理
光线通过偏振滤 光片后，形成一 个方向的平面光 称为偏振光。
偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～ 550nm)
40
检测原理
41
检测原理
42
检测原理
[荧光偏振]雅培AxSYM 全自动免疫分析
仪
43
时间分辨荧光免疫分析
44
荧光素
• 辣根过氧化物酶 – 鲁米诺及其衍生物 – 对-羟基苯乙酸(HPA)
• 碱性磷酸酶 – 4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二 氧乙烷(AMPPD) – 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
12
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
13
HPA
激发后发射荧光
450nm
48
技术类型
• 双抗体夹心法
– 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形 成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物， 酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发 射613nm荧光。
49
技术类型
• 双抗体夹心法
➢E
➢E
u
➢DELFIA labeled detection
u
antibody
镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需 应用双功能基团的螯合剂，形成镧系元素离子螯合剂-抗原（或抗体）复合物。
双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）
标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+
➢Virus
➢Capture antibody ➢Solid support
50
技术类型
• 三丙胺（TPA）
31
电化学发光原理
32
电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由 基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
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电化学发光原理
二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
34
电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
35
标记物的制备
45
荧光素
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技术类型
• 固相抗体竞争法
– 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光 强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
47
技术类型
• 固相抗原竞争法
– 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记 抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测 定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
3
发光免疫分析
• 主要特征： – 发光剂作为标记物 – 纳米微球作为固相载体 – 自动化水平
4
Type of LIA
Luminescence Immunoassay, LIA
1.Fluorescence Immunoassay ,FIA 2. chemiluminescence immunoassay ,CLIA
5
发光现象
• 一种物质由电子激发 态回复到基态时，释 放出的能量表现为光 的发射，称为发光 。
6
发光类型
光照发光 化学发光 生物发光
7
生物发光类型
8
化学发光 (chemiluminescence)
• 化学发光酶免疫分析 – chemiluminescence enzyme immunoassay
• 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学发光分 析的标记物，分子中含有N-羟基琥珀酰胺 （-NHS）可以抗体、抗原分子中的氨基结 合形成稳定化合物。
• 三丙胺（TPA）作为电子供体，参与电极表 面的氧化还原反应。
36
电化学发光免疫分析（双抗体夹 心）
37
电化学发光免疫分析
罗氏电化学发光仪E170S
19
仪器设备
– 微粒子发光酶免疫分析
• 固相材料
– 700 nm微球
• 德国西门子公司
– Immulite 免疫分析仪
20
仪器设备
• 激发后检测
– 4-MUP – 美国雅培公司
• AxSYM免疫发光分析仪
– 发光酶免疫分析（荧光酶免疫） – 荧光偏振免疫分析
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96-T板式酶促发光免疫分析 • 96-T 微孔板 – 优势 • 适合批量操作 – 缺点 • 抗体包被容量 • 固相反应模式