分子生物学试验设计

分子生物学

利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法

1 研究背景

烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。

2 材料与方法

2.1 试验材料

试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。

2.2 测定烟碱含量

烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。

2.3 RNA提取

提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。

2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化

取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。

3 预计结果

3.1 烟碱含量的测定

与对照相比打顶后烟碱含量显著上升

3.2 RNA电泳检测

总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。

3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR

PCR扩增产物条带比较清晰，基本没有拖尾现象。说明打顶后烟草PMT基因表达量明显增加。

4 意义

从调控烟碱合成第一步的关键酶PMT入手，根据PMT基因设计引物进行半定量RT-PCR，结果表明打顶后PMT基因表达明显上调；同时，打顶后烟碱合成量较打顶前明显上升。这表明上部烟叶烟碱含量和腐胺-N-甲基转移酶基因表达量的变化趋势是一致的。由此可以利用测定烟碱合成关键酶的基因转录水平来分析烟碱合成情况，在农业生产中具有一定的指导意义。