时间分辨荧光分析法 副本ppt课件

• 是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，是目前最灵 敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19g/ml，较放射免疫 分析（RIA）高出3个数量级。它用镧系元素标记抗原或 抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术 测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨， 可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏 度。
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二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点
1.原理
TRFIA 是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、 多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、 增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反 应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应 细胞的杀伤反应等) 发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后 产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测 反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
2.3.2 固相抗体竞争法是对一些小分子半抗原化合物,因分 子质量小,不能直接进行固相包被,如多肽、甲状腺激素类 和一些药物等,都必须经过化学耦联剂与载体蛋白质进行共 价键结合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定条孔壁,制成固相 抗原.
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四、时间分辨荧光分析法的应用
1.在免疫学的应用 1.1 测定细胞因子:细胞因子不仅仅参与免疫应答反应,而且
示踪剂的使用 一般用Eu2O3制备成EuCl3,再经纯化和 常温真空抽干,然后干燥保存。
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1.2 稀有元素双功能螯合剂
稀土元素作为金属离子,很难直接与抗原抗体结合,因此 在标记时需要有一种双功能基团的螯合物,它们分子内或带 氨基和羧基或带有异硫氰酸基和羧酸基,一端与稀土离子连 接,一端与抗原或抗体的自由氨基(组氨酸、酪氨酸) 连接。
分析缓冲液、增强溶液。 • 基本技术包括包被技术、标记技术、反应模式。
1.基础试剂：
1.1示踪剂的选择 所使用的稀土元素主要位于元素周期表中的 ⅢB族,包
括钪(scandium,SC)、钇(yttrium , Y)和镧系元素。到 目前为止,只有铕(europium , Eu)、铽(terbium ,Tb)、 钐(samarium ,Sm)、钕 (neodymium ,Nd)、镝 (dysprosium ,Dy)等5种被用作TRFIA示踪剂,尤以 Eu3 +常用。
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2.3 反应模式 常用的有双位点夹心法和固相抗体竞争法。
2.3.1 双位点夹心分析法使用针对被测物上不同抗原决定簇 的两个单克隆抗体,一个用Eu3 +标记,另一个包被固相载体, 经过免疫反应形成免疫复合物后,再将Eu3 +从复合物上完 全解离下来,在Eu3 +的增强液中与另一种螯合剂结合,在协 同剂的作用下,形成一个Eu3 +包裹于其内部的微胶囊(胶态 分子团) 。它在激发光作用下能发射出很强的荧光信号,其 强弱与待测抗原(或抗体) 含量相关。该法用于测定蛋白质 类大分子化合物。
• 镧系元素与通常的荧光物质相比较，镧系元素离子螯合 物荧光的衰变时间要长的多，为传统荧光的 103～106倍。
• 镧系离子与双功能螯合剂螯合后，可形成稳定的螯合物， 稳定性非常高，生产出的产品保质期可以长达 2 年。
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三、时间分辨荧光分析技术简介
• TRFIA的基础试剂包括示踪剂、稀有元素双功能螯合剂、
时间分辨荧光分析法及其应用
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目录
• 一、时间分辨荧光分析法的基本概念 • 二、时间分辨荧光分析法基本原理与优点 • 三、时间分辨荧光分析技术简介 • 四、时间分辨荧光分析法的应用 • 五、时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测
方面的应用 • 六、展望
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一、基本概念：
1.有些物质受到光的照射时，除吸收某种波长的光之外还 会发射出波长相同或比吸收波长更长和的光，这种现象称 为光致发光。最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
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时间分辨荧光免疫原理图
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2.优点
• TRFIA 技术具有酶标记分析技术和同位素标记技术的 优点: 具有灵敏度高、特异性强、稳定性好，且测定范围 宽，试剂寿命长，操作简便和非放射性等特点：
• 镧系离子与螯合剂形成螯合物后，Stokes 位移能够达 到 200 nm 以上，很容易分辨激发光和发射光，从而激 发光干扰就可以排除。
1.3 增强溶液
免疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外 光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子 经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强 液。增强液一般由β-二酮体、三辛基氧化磷(TOPO)、 TritonX-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾(pH2.0 ~3.2)组 成。
抗原或抗体标记时,铕离子首先要作为标记物标记到抗原 或抗体上。标记时不同蛋白质的反应性依赖于蛋白表面的 游离氨基酸数目和蛋白质特异等电点。一般来说,游离氨基 酸数目越大,蛋白质的特异等电点越高,蛋白质易与螯合剂 反应,从而产生较高的标记率,但其标记比率与免疫反应不 成正比关系。镧系离子Eu3 +可用来标记核酸探针。
2.物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最 低振动能级返回到基态时所发射出的光称为荧光 (fluorescence)。
3.根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和物 质含量测定的方法称为荧光分析法(fluorometry)。
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• 5.时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroisnmuno assay,TRFIA）
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2.基本技术：
2.1 包被技术
TRFIA包被技术,是保持其灵敏度重要因素,因此在包被 抗体之前,往往要对抗体进行纯化,以提高抗体的包被量和 均一性。国内外最早的使用的包被的缓冲体系为pH9.6的 碳酸盐缓冲液,90年代后改为柠檬酸缓冲液,pH为4.5 ,效 果明显优于碳酸盐缓冲系统。
2.2 标记技术
在肿瘤、炎症发生和发展过程中起重要作用。因此,准确测 定细胞因子含量,对于了解它们病理生理作用是十分重要的。 1.2 测定补体:补体成分在多种自身免疫性疾病中起作用,临 床上常检测补体C3来评价免疫系统的功能。用
由于TRFIA的方法灵敏度高,在1979年它的理论形成后,