第九课电泳图谱的图像分析

由于在进行斑点检测时会错误的识别一些蛋白质斑点， 比如将一些污染的非蛋白质点识别为蛋白质点、将本来 是一个蛋白质点识别为两个蛋白质点或者反之。所以在 匹配之前最好进行处理，同时将gel scan 、gel image 和gel spot图打开，然后单击edit spot tool，出现一个 对话框，此对话框中有增加斑点（make a spot at cursor）, 删除斑点（remove spot at cursor）,合并斑 点（combine spot in box）等图标，可根据你的目的而 选择其中一个图标进行相应的斑点处理。这些处理只能 在gel image图象中处理，但相应的在gel spot图象中会 同时得到显示。
Scan。）
单击工具栏上的control the image display 图标，会出 现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值以改变明 亮度。
用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白质点的部 分，以减少分析的复杂性，但要注意对你要分析的多块凝 胶图像最好是切割成同样大小。 （在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要切割的区 域，然后在image>advance crop>save crop settings下保 存crop的设定条件并输入保存的名称，其他的图象切割时 在image>advance crop>load crop settings中选定先前保 存的名称即可 ）
归一化 Normalization
为了矫正银染对蛋白质点定量分析的影响，所有点的含量 通过单个点的光密度值比上胶上所有点光密度质而正常化 （Normalize）, 单击Edit>Normalize, 出现一对话框，选择 左上角Enable Normalize，下面的窗口被激活，在Basis下 选择Total of all Valid Spots, 在Scaling下选择 PPM(×1000000), 然后单击 go。这样所有的点都正常化 （Normalize）了。
在Select Spots Which are 中可以选择Increased, Increased or Decreased 或者是Decreased 等，激活选 项后可以输入倍数关系, 默认的是2 times, 可以输入其他数 值， 如3 times。参数设好后就单击go, 在参考胶上就会出 现黄色圈标记的蛋白质斑点，如果你选择是Increased B>A 2 times, 那么这些黄色圈标记的蛋白质斑点即为在量 上B大于A 两倍的蛋白质点.
三 、斑点匹配 (Matching spots)
蛋白质斑点检测完了之后，为了比较和分析不同凝胶中蛋白 质斑点的改变，PDQUEST 可以建立一个Matchset。 单击match>creat matchset, 出现一个Matchset的对话框，输入 文件名称，保存路径，选择（select）或上载（load）gel spot 图像的文件名，然后单击creat, 出现一对话框，选择其中的一 个图象做为参考图象（standard member）, 整个Matchset用单 个窗口（signal window）来表示，其中的亚窗口 （subwindow）分别用来表示参考图像（用REF来表示）和成 员胶（member gel）图像。
标志点以绿色三角标记，每块胶上匹配上的蛋白质 斑点以绿色字母标记，没有匹配上的蛋白质斑点用红 色圈来标记，即是有无差异表达的蛋白质点。
四 、数据分析及输出 （analysis and report）
为了分析蛋白质斑点之间差异表达，PDQUEST提供了多 个分析程序，包括蛋白质斑点量(Quantity)分析，散点图工 具（Satter Plot Tool） ,量的柱状图分析（Graph）等在内的 多种分析程序。
一、 图象采集与加工 (editing images)
1、扫描：凝Βιβλιοθήκη 染色后用清华紫光扫描仪扫描，透射模式，
全彩RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以 tiff格式保存。
2、图片加工：
在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可以。 （单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”命令， 选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名或单 击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文件会自 动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的文件格式2D
Matchset 建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的作用是对整个 凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位（position）以便进行匹配 （match）。 单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有 landmark, unlandmark, match gel, match all gels等斑点匹配的工具, 在match菜单中也有 这些工具。 标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点，并尽量避开 蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下确定该蛋白质斑点为所有 成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自 动匹配功能来完成不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark 斑点个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上的斑点是否 匹配上了。
双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术 之一, 双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数 千种蛋白质，经染色后蛋白质再PAGE上可形成密度 不同、分布不均的复杂点图谱。 如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱 上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类， 挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件 所要解决的问题。
对错误匹配的蛋白质斑点或没有识别到的匹配可进行 手工方式编辑。在这里也可以进行编辑斑点功能，单击 view>interchange all images, 这样所有的成员胶和参考 胶有Gel spot 状态下变成了Gel image, 而在Gel image 状态下可进行Edit Spot Tools 以编辑蛋白质斑点。
量化柱状图 Graphs
单击Reports>More Graphs>Page Graphs, 在有边会出 现一对化框，显示所有蛋白质点在不同胶上的量化柱状图， 如果要显示所要分析的蛋白质点的量化柱状图，则在对话框 的Input下选择Analysis set, 出现一对话框，然后选择分析 的名称即可。在Reports>Quantity Graphs下可输出所有 的蛋白质点（All Match Spots）或者是特定分析的蛋白质 点（Specificd Analysis Set）在不同胶上的量化柱状图。
二 、斑点检测 (spots detection)
图象采集与加工后就要进行斑点检测，PDQUEST 2-D 分析软件通过一个称之为“蛋白质斑点检测向导 （spot identification wizard）”的程序来实现 的。
单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard” 程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、最 大斑点、最小斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节 检测的灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序 允许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和 其他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象 会显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示， 检测的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可 被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质斑 点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots 窗口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝胶 图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式分 别为gel image 和gel spot。
PDQuest 软件简介
PDQuest软件是显示（imaging）、分析 （analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个 软件包
硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，
64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统 软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，BioRad Laboratory,Hercules,CA
散点图工具 Scatter plot
单击Reports 下的Scatter plot，会出现散点图分析的对话 框，可以选择x, y轴，分别代表一块胶，Markers 下可以选 择倍数，下面的散点图即显示了两个2-D胶图像中蛋白质点 之间的相关性，上面会显示二者的相关系数，如果相关系数 大于0.4，说明二者有较大的相关性，如果小于0.4大于0.2, 说明相关性较小，小于0.2, 说明没有相关性。在Reports >Scatter plots 下可以将所有的凝胶图之间的相关图都打印 出来。
PDQuest 软件的使用
以PDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳分 析的基本实验过程做一简单介绍。
凝胶的图像处理分析及细 胞蛋白谱的建立
典型流程





凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
PDQuest 软件
电泳图谱的图像分析
Differential analysis
回顾
State 1
2DE
PMF LCMS/MS State 2 Database search
?
Functional analysis
MS/MS
电泳图谱的图像分析简介 what can we get from image analysis?