第五章基因工程相关技术
基因工程的四大技术
基因工程的四大技术
1.基因克隆技术：基因克隆技术是指将某个有意义的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA分子，再将其导入细胞中，使细胞表达出与该DNA片段相关的功能蛋白质。
这一技术是基因工程的重要基础，也是其他技术的前提。
2. 基因敲除技术：基因敲除技术是利用RNA干扰或CRISPR/Cas9技术，将目标基因的DNA序列进行改变或剪切，使其失去功能。
这一技术可以用于研究基因功能，识别疾病基因，以及开发新的治疗方法。
3. 基因编辑技术：基因编辑技术是利用CRISPR/Cas9等技术，直接对基因进行编辑，使其发生精准的改变，如点突变、删除、插入等。
这一技术可以用于治疗遗传病、改良农作物品种等领域。
4. 基因合成技术：基因合成技术是利用化学合成方法，将DNA 序列按照设计的顺序合成，形成具有特定功能的基因。
这一技术可以用于合成人工基因、改良生物代谢途径等应用。
- 1 -。
5、15 基因工程--上下游技术
2 反转录PCR(RT-PCR)
用于直接扩增经反转录为CDNA的特定RNA序列的PCR 方法称为RT-PC方法。此方法敏感度极高,且简单易行。 目前许多公司设计了多种形式的RT-PCR试剂盒,使用 十分方便,例如"一步法RT-PCR试剂盒",利用 SuperScript逆转录酶和TaqDNA聚合酶的混合体系, 所有反应在一个试管内完成,灵敏度极高,只需0.1pg总 RNA便可扩增3.5kb的CDNA片段;"高温反转录-PCR 系统"采用热稳定型RNAaseH-反转录酶,可在70℃条 件下完成反转录过程,最长可反转录12kb的CDNA分子。
3 定量PCR
定量PCR主要分为DNA-PCR和mRNA-PCR定量两类。 DNA-PCR采用同位素或荧光等标记经电泳分离的PCR 扩增产物,进行自显影后根据底片的曝光强弱对模板 DNA进行定量。本实验需预先采用已知浓度的标准 DNA模板,在PCR扩增后测定放射性并绘制标准曲线,根 据标准曲线确定扩增产物量。mRNA-PCR需先经逆转 录获得CDNA后再进行PCR扩增,采取同DNA-PCR定量 的方法确定RNA数量,这种方法由于 现在测定DNA序列主要有两类方法： 1. Sanger等提出的酶法。 2. Maxam及Gilbert提出的化学降解法。
两种方法尽管大相径庭,但结果却是一致的。
20世纪70年代两种方法刚问世时,化学方法测序重 现率高,较易操作,只需高质量的化学试剂,因此为 多数研究人员所接受。而酶法需单链DNA模板和 特异的寡核苷酸引物及高质量的聚合酶,操作较复 杂。随着M13噬菌体和载体的发展,引物合成日渐 方便及测序技术的日臻完善,目前主要采用Sanger 等发明的酶法测序。
1、上游阶段：首先获得目的基因，然后用限制性内切
基因工程的主要技术原理
基因工程的主要技术原理基因工程是一种利用现代分子生物学和生物化学技术来对生物体进行基因组的修改、操作和调控的技术。
它的主要技术原理涉及到以下几个方面：1.DNA重组技术：DNA重组是基因工程的核心技术之一、它通过切割不同生物体中的DNA片段，然后重新组合、连接，将特定的基因或基因片段导入到目标组织、细胞或生物体中。
DNA重组技术包括PCR、限制酶切、DNA连接等。
2.遗传转化技术：遗传转化是将外源DNA导入目标生物细胞或组织中的过程。
常用的转化方法包括细菌的转化、植物的遗传转化以及动物细胞的转染等。
3.基因克隆技术：基因克隆是指通过复制DNA片段来得到多个完全相同的基因分子或有关基因分子的方法。
基因克隆包含了DNA提取、DNA扩增、DNA定序等技术。
5.选择标记技术：为了辅助识别和选择已经被转化的细胞或生物体，常常需要在外源基因上引入选择标记基因。
选择标记基因通常携带特定抗性或基因标记，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
6.基因表达调控技术：为了使外源基因在目标生物体中得到高效表达，常需对其进行适当调控。
基因表达调控技术包括启动子的选择、转录因子的调控、信号通路的调节等。
7. 基因测序技术：基因测序是确定DNA序列的方法，可用于分析基因组结构、功能和演化。
目前，最主要的基因测序技术是高通量测序技术，如Illumina测序技术和PacBio测序技术。
8.产生转基因生物技术：基因工程的一个重要应用是产生转基因生物。
转基因生物是指通过基因工程技术将外源基因导入到目标生物体中，使其获得新的性状或功能。
常见的转基因生物包括转基因植物、转基因微生物等。
以上是基因工程的主要技术原理。
随着科学技术的不断进步，基因工程技术将进一步发展和应用，为解决人类面临的许多生物学和医学问题提供更好的解决方案。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
生物学知识点 基因工程
生物学知识点基因工程基因工程是生物学中的一个重要分支，它涉及到对基因的操作和改造，以达到改良生物体的目的。
本文将介绍基因工程的基本概念、技术方法以及应用领域。
一、基因工程的概念与原理基因工程是指通过对生物体的基因进行人为的操作和改造，以达到改良生物体的目的的一门学科。
其基本原理是利用现代分子生物学的技术手段，对生物体的基因进行剪接、克隆、转移等操作，从而实现对生物体特性的调控和改变。
基因工程的核心技术是基因重组技术，即将不同生物体的基因进行重组，形成新的基因组合，然后将其导入目标生物体中，使其表达出新的特性。
基因重组技术主要包括以下几个步骤：1. DNA提取：从生物体中提取出含有目标基因的DNA片段。
2. 基因剪接：利用限制酶将目标基因与载体DNA进行剪接，形成重组DNA。
3. 转化：将重组DNA导入到宿主细胞中，使其表达出目标基因。
4. 选择与筛选：通过选择性培养基或标记基因等方法，筛选出带有目标基因的转基因细胞或生物体。
5. 鉴定与分析：对转基因细胞或生物体进行鉴定和分析，确认其是否成功表达目标基因。
二、基因工程的应用领域1. 农业领域：基因工程在农业领域的应用十分广泛。
通过基因工程技术，可以改良农作物的抗病性、耐逆性和产量等性状，提高农作物的品质和产量。
例如，转基因水稻可以提高抗虫性和耐盐碱性，转基因玉米可以提高抗除草剂和杂草的能力。
2. 医学领域：基因工程在医学领域的应用主要包括基因治疗和基因诊断。
基因治疗是指利用基因工程技术，将正常的基因导入到患者体内，以治疗遗传性疾病或其他疾病。
基因诊断是指通过对患者的基因进行检测和分析，以确定患者是否携带某种疾病的遗传基因。
3. 环境保护领域：基因工程可以应用于环境污染治理和生物修复。
通过基因工程技术，可以改造微生物，使其具有降解有机污染物的能力，从而实现对环境污染物的清除和修复。
4. 工业领域：基因工程在工业领域的应用主要包括生物制药和生物能源。
基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
基因工程的基本技术路线
基因工程的基本技术路线在这个瞬息万变的科学时代，基因工程就像是开启了一扇通往未来的大门。
相信很多小伙伴对基因工程这个词不陌生吧？简单来说，基因工程就是通过各种技术手段对生物的基因进行改造，来达到我们想要的结果。
就好比是给你的手机换个壳，里面的系统不变，但外观却焕然一新。
今天就让我们轻松聊聊基因工程的基本技术路线，看看它究竟是怎么一回事！1. 基因克隆1.1 什么是基因克隆？基因克隆，听起来就像是“复制粘贴”的感觉，其实就是把一个特定的基因复制出来，搞个“一模一样”的版本。
为什么要这么做呢？因为我们需要研究基因的功能，或者用这些基因来生产某些有用的蛋白质。
比如说，科学家们可以通过克隆某种植物的抗病基因，来培育出更强壮的农作物，这样一来，农民的收成可就不愁了。
1.2 基因克隆的步骤那么，基因克隆的过程到底是怎样的呢？这可是个不小的工程，首先得找出我们想要克隆的基因。
这个过程就像是在找一颗针掉在了大海里，得小心翼翼才能找到。
找到之后，我们就会用酶把这个基因从DNA中剪切出来。
接下来，将它插入到一个载体上，这个载体就像是一辆小车，能把基因送到合适的地方。
最后，把载体放入细胞里，让它在细胞中复制，等时间一到，我们就能收获一大堆“克隆版”基因了。
2. 基因编辑2.1 CRISPR技术说到基因工程，基因编辑就不能不提！现在最流行的编辑工具就是CRISPR了，听起来酷吧？CRISPR就像是一个超级精准的剪刀，可以在特定的地方“剪”掉或“插入”基因。
这种技术的出现，真是让科学家们欢呼雀跃。
想象一下，我们可以直接对植物的基因进行修改，让它们更耐旱、抗虫害，种地的成本一下子就降下来了。
2.2 基因编辑的应用基因编辑的应用简直是无穷无尽！不光是农作物，动物也能受益。
比如说，科学家们可以编辑小猪的基因，让它们长得更快、更健康，简直是“猪界超模”。
再比如说，人类基因组的研究，甚至可以帮助我们治疗某些遗传病，真是“扭转乾坤”的好技术。
第五章 微生物基因工程育种
1960年，F.Jacob和J.Monmd提出了操纵元 （操纵子）的概念，揭示了原核生物基因表达 调控的重要规律。
基因的现代概念
移动基因（movable gene） 断裂基因（split gene） 假基因（pseudogene） 重复基因（repeated genes） 重叠基因（overlapping genes） 或嵌套基因（nested genes）
基 因 工 程 流 程 示 意 图
基因工程的应用
基因工程技术已经在医学、工业、 农业等各个领域得到了广泛的应用。
在医学上的应用
基因工程被用于大量生产过
去难以得到或几乎不可能得到的
蛋白质－肽类药物。
转基因动物和植物
转基因动物首先在小鼠获得成功。现在
转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/
第五章 工业微生物基因育种
王陶 2012年2月
目的与要求
了解和掌握基因工程育种的原理与方法； 了解基因工程的主要载体与基因定位诱变的 原理与方法。
教学重点：质粒的特性与基因工程操作原理 教学难点：基因定位诱变的原理
教学内容
1、概述 基因工程在微生物育种中的地位和作用，原理 2、基因工程载体 几种常见的载体 3、基因工程所用的酶 限制性内切酶，核酸酶，连接酶，聚合酶等 4、基因工程的主要步骤 5、基因定位诱变
孟 德 尔 研 究 的 七 对 性 状
豌豆杂交操作
孟 德 尔 分 离 律
孟 德 尔 自 由 组 合 律
黄圆 绿圆 黄皱 绿皱
1909年，丹麦的遗传学家W.
Johanssen 根据希腊语“给予生命”之义，创造了 “gene‖一词。但它只是一个抽象的单 位，并不代表物质实体。
基因工程的核心技术是()技术
基因工程的核心技术是( )技术基因工程的核心技术是（DNA的重组）技术DNA重组技术一般知第一节工具酶基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要结合基因或其中的一个片段，需要DNA酶（DNa polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。
一、DNA限制性内切酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA受到后一种宿主的“限制”。
由此发现了限制-修饰系统。
各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。
这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。
限制-修饰系统是细胞的一种防卫手段。
如果用噬菌体去感染限制-修饰系统有活性的细菌，噬菌体DNA 没有先经修饰，它与先经修饰的噬菌体相比，感染效率要低几个数量级。
未经修饰的噬菌体DNA进入细胞后被限制酶切成片段，片段的数目与DNA分子中限制酶的识别点数目成正比，这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解，就会开始裂解感染，由此产生的子代噬菌体全部带有修饰过的DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修饰系统的细菌。
目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已超过175种，其中80多种是切割DNA双链。
（一）命名原则限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
基因工程技术
基因工程技术基因工程技术是一种可以人为地操控生物体的遗传信息的科学技术。
通过基因工程技术，科学家可以对生物体的基因进行修改、调整和插入新的基因，从而改变生物体的性状和功能。
随着技术的不断发展，基因工程技术在医学、农业、工业等领域具有广泛的应用和潜力。
本文将从基因工程技术的概述、医学应用、农业应用和伦理道德等方面进行论述。
一、基因工程技术的概述基因工程技术是一种通过修改、调整和插入基因的技术，以改变生物体的性状和功能。
它主要包括基因克隆、基因传递和基因表达等步骤。
在基因克隆中，科学家通过提取和复制目标基因，得到多个基因的复制体。
在基因传递中，复制体被导入到宿主细胞中，成为宿主细胞的一部分。
在基因表达中，目标基因将在宿主细胞中被转录和翻译，从而产生蛋白质。
基因工程技术的应用范围广泛，包括医学、农业、工业等领域。
二、基因工程技术的医学应用基因工程技术在医学领域有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，科学家可以制造大量的重组人胰岛素，用于治疗糖尿病患者。
此外，基因工程技术还可以用于制造基因药物，如基因治疗药物，通过将正常基因导入患者体内，修复患者体内缺陷基因的功能。
此外，基因工程技术还可以用于生产疫苗、生物传感器和生物材料等。
三、基因工程技术的农业应用基因工程技术在农业领域也有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，科学家可以改良农作物的抗病性、耐逆性和品质。
其中，转基因作物是指经过基因工程技术改造的农作物，其具有抗虫、抗病、耐旱等优点。
转基因作物的种植可以提高农作物的产量和质量，减少杀虫剂和农药的使用量，对于解决世界饥饿问题具有重要意义。
四、基因工程技术的伦理道德问题随着基因工程技术的发展，伦理道德问题也逐渐引起人们的关注。
人们担心基因工程技术可能带来的道德伦理问题，如基因歧视、基因改良婴儿和生物多样性等。
基因歧视是指在就业、教育和社会等方面，基于基因信息造成的不平等对待。
基因改良婴儿是指使用基因工程技术修改胚胎的基因，以达到某种预期的效果。
基因工程涉及的主要技术
200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。
基因工程涉及的主要技术
多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏
血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它
•95oC
•TGCATGCAT •3’ •ACGTACGTA •5’
•5’•ATCTTGAAC
•模板
•TGCATGCAT •3’
•3’•TAGAACTTG
•ACGTACGTA •5’
•模板（template） 基因工程涉及的主要技术
（2）DNA模板与引物复性
•40-65oC
•引物（primer）:
• 一般程序 1、供体的核酸分离
供体细胞培养
收集(菌体)细胞
细胞破碎
分离总DNA 分离细胞器
分离总RNA
分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA染色体DNA(组建基因组)cDNA（组建cDNA）
基因工程涉及的主要技术
DNA提取的几种方法
（1）基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它
• 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成 双链的结构。
➢ 同源或部分同源探针
➢ 总cDNA探针
➢ 特异性cDNA探针
➢ 人工合成的寡核甘酸探针 • DNA-DNA
•杂交双链分子
基因工程涉及的主要技术
探针标记
u放射性标记 • 32P，3H，35S，14C，125I 等 u 非放射性标记 • 地高辛，生物素，荧光素等 • 用于标记dUTP
《基因工程》----考试重点总结
第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程（gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。
基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。
第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。
从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。
基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是DNA也可以是RNA，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。
基因工程的理论基础：⑴. 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA，明确了遗传的物质基础。
⑵. DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。
⑶. 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。
(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。
自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：⑴. DNA体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的开始）。
⑵. 克隆载体的发展与应用。
⑶. 大肠杆菌转化体系的建立。
⑷. 琼脂糖电泳技术的应用。
⑸. DNA测序技术的应用。
⑹. 核酸杂交技术的应用。
基因传众生之源每章详细内容
基因传众生之源每章详细内容一、前言基因传这本书真的超级有趣呢。
它就像是一部基因的史诗，带我们走过基因发展的漫长历程。
每一章都像是一个宝藏，装满了新奇的知识和动人的故事。
二、第一章：遗传物质的发现之旅这一章就像是一场神秘的探险。
从早期人们对遗传现象的模糊认识开始讲起，那时候大家都只是有个大概的感觉，知道有些东西会在家族里遗传。
然后就出现了一些聪明的科学家，他们开始各种研究。
孟德尔种豌豆的故事可太经典啦，他就像一个细心的园丁，通过观察豌豆的各种性状，什么高茎矮茎、圆粒皱粒的，发现了遗传的基本规律。
这就好比是在基因这个大宝藏的外面发现了一把小钥匙。
之后呢，又有其他科学家不断深入，一点点接近基因的真相。
这一章就像是一个序幕，拉开了基因神秘面纱的一角。
三、第二章：基因的化学本质这一章开始深入到基因的本质啦。
原来基因是由化学物质组成的呢。
科学家们为了搞清楚这个化学物质到底是什么，也是费了好大的劲儿。
从最开始的各种猜测，到后来发现DNA可能是关键。
这个过程中还有好多有趣的实验，像艾弗里的肺炎双球菌转化实验，那可是相当厉害的实验。
就好像是在一个黑暗的屋子里，慢慢找到了那盏能照亮基因真相的灯。
DNA的结构是双螺旋，这个发现简直是个巨大的突破。
就像拼图一样，一块一块地拼出了基因化学本质的全貌。
四、第三章：基因的表达与调控基因可不是在那闲着没事的，它们会表达，会调控。
这一章就像是基因的工作手册。
讲述了基因是如何把自己携带的信息转化成生物体的各种性状的。
就像是一个神秘的指令系统，基因发出命令，然后细胞按照这个命令去工作。
有转录、翻译这些过程，每个过程都像是一个精密的机器在运转。
而且基因的调控也很神奇，它知道什么时候该表达，什么时候该休息。
就像一个聪明的小管家，管理着生物体内的各种事务。
五、第四章：基因与疾病这一章有点沉重呢。
它讲了基因和疾病的关系。
原来很多疾病都和基因有关，有的是基因本身出了问题，有的是基因的表达调控乱了套。
基因工程的主要技术及其原理
基因工程的主要技术及其原理基因工程是一种利用分子生物学和遗传学知识对生物体进行基因改造的技术。
它可以用于改良农作物、生产药物、治疗疾病等领域。
基因工程的主要技术包括基因克隆、基因编辑、转基因等，下面将分别介绍这些技术的原理和应用。
一、基因克隆技术基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制出来，并将其插入到另一个生物体中的技术。
其原理是利用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后将感兴趣的基因片段插入到质粒或病毒载体中，最后将载体转化到宿主细胞中。
基因克隆技术可以用于生产大量的特定基因，用于研究基因功能、生产蛋白质等。
二、基因编辑技术基因编辑是指利用特定的酶对DNA序列进行精准的修改的技术。
目前最常用的基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统，其原理是利用Cas9蛋白和RNA引导序列形成复合物，精准地切割目标DNA序列，然后通过修复机制进行修复或插入新的DNA序列。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、治疗遗传疾病、改良农作物等方面。
三、转基因技术转基因是指将外源基因导入到目标生物体中，使其表达外源基因产生的蛋白质或表型。
其原理是利用载体将外源基因导入到目标生物体的细胞中，然后使其稳定地整合到目标生物体的染色体中。
转基因技术可以用于改良农作物、生产药物、治疗疾病等领域。
基因工程技术在农业、医药、生物学等领域有着广泛的应用。
在农业领域，基因工程技术可以用于改良农作物的抗病虫性、耐逆性等性状，提高农作物的产量和质量。
在医药领域，基因工程技术可以用于生产重组蛋白质药物、治疗遗传疾病、研发新型疫苗等。
在生物学研究领域，基因工程技术可以用于研究基因功能、构建基因组库等。
然而，基因工程技术也面临着一些挑战和争议。
一方面，基因工程技术可能会引起环境风险和健康风险，例如转基因作物可能会对生态系统产生影响，基因编辑技术可能会引起不可逆的基因突变等。
另一方面，基因工程技术的应用也涉及到伦理道德、食品安全、知识产权等问题，需要进行严格的监管和管理。
基因工程实验操作技术
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
5、15 基因工程--上下游技术
Taq DNA poly-merase
Taq DNA聚合酶(Taq DNA poly-merase)是从嗜热水
生菌(Thermus aquaticus)中分离获得的,该酶基因全
长2496个碱基对,编码832个氨基酸,酶蛋白相对分子 量为9.4×104,在70~75℃活性最高,即或在95℃高温 仍具有活性,因此无需在每一循环反应中再加酶。在正 常反应条件下,经过25~30个扩增循环(即扩增倍数达到 106)后,Taq DNA聚合酶量便成为了反应进行的制约因 素,如需继续扩增,要将产物DNA样品稀释 1000~10000倍,作为模板再进行新的PCR扩增反应。 和其他聚合酶一样,TaqDNA聚合酶也是Mg2+依赖酶, 对Mg2+浓度十分敏感。
导人的方法主要有转化、转染等方法 , 此外也可采用电融 合、显微注射和基因枪等技术。
4 鉴定带有目的基因的克隆
从大量的细胞繁殖群体中,筛选出克隆有重组DNA分子 的寄主细胞。为了挑选出重组子,针对不同基因的表达 产物,采用各自特有的测活方法确定其生物活性;也可以 采用酶联免疫方法确定其抗原性;以目的基因为探针,通 过DNA杂交方法可以直接确定重组子。
Pfu DNA聚合酶
Pfu DNA聚合酶是从嗜热菌Pyrococcus furiosis中分
离得到的,称高保真耐高温DNA聚合酶,能够纠正PCR扩 增中发生的核昔酸错误。该酶比Taq DNA聚合酶及其 变体错误率低10倍,Pfu DNA聚合酶的超常纠错功能是 由该酶性质决定的,其他耐热DNA聚合酶与Pfu DNA聚 合酶合用可以部分降低错误率,但达不到单独使用该酶 的效果。然而Pfu DNA聚合酶扩增率低于Taq DNA聚 合酶,这是由于该酶具有3'→5'外切酶活性。
基因工程知识点
基因工程知识点基因工程是一门关于生物基因的科学与技术，涉及到生物学、遗传学、分子生物学等多个学科领域。
通过对基因进行分析、修改和重组，基因工程可以改变生物体的遗传信息，从而创造出具有特定性状的新生物体或改良已有的生物体。
1. DNA的复制与修饰基因工程的第一步是对目标基因进行复制和修饰。
在DNA复制中，科学家可以使用聚合酶链反应（PCR）技术来大量复制目标基因。
然后，可以采用限制性内切酶来切割DNA片段，以便进行进一步的修改。
2. DNA的重组与合成基因工程的核心是对DNA分子进行重组和合成，以构建具有特定性状的基因组。
这可以通过DNA重组技术来实现。
该技术利用限制性内切酶将具有相同限制酶切位点的两个DNA分子进行剪切，并通过DNA连接酶将两个分子连接起来形成新的DNA分子。
3. 基因的转导与表达一旦目标基因经过修饰和重组，下一步是将其转导至宿主生物体。
这可以通过多种方法实现，其中最常用的是利用载体。
载体是一种能够稳定传递外源DNA到宿主细胞的工具，例如质粒、病毒等。
一旦外源基因进入宿主细胞，它们将会以不同的方式表达出来，例如转录成RNA、翻译成蛋白质等。
4. 基因工程在医学上的应用基因工程在医学领域有着广泛的应用。
例如，通过基因工程技术，可以合成大量的重组人胰岛素，用于治疗糖尿病。
另外，基因工程还可以用于生产重组疫苗，如乙型肝炎疫苗和人乳头瘤病毒疫苗等。
此外，基因工程还有助于研究遗传病的发病机制，并可能为这些疾病的治疗提供新的策略。
5. 基因工程在农业上的应用基因工程技术在农业领域的应用也非常广泛。
通过基因工程改良作物的抗虫性、抗病性和耐逆性，可以提高农作物的产量和品质，减少农药的使用。
例如，将一些具有抗虫性的基因导入到作物中，可以提高作物抵抗虫害的能力，从而减少农药的使用量。
总结基因工程作为一门复杂而又有前景的学科，为科学家们提供了许多改变生物体的机会。
通过对基因的分析、修改和重组，基因工程可以为人类的健康、农业的发展甚至整个生态环境带来深远的影响。
基因工程的常规技术
连接酶
连接酶用于连接DNA片段，使其形成重构的基因 或载体。
多聚酶链反应
PCR技术可以迅速扩增寻找特定基因片段。
基因克隆技术
1
片段构建
选择目标基因并切割出DNA片段。
2
载体构建
将目标基因片段连接到载体上，如质粒。
3
转形
将重构的载体导入宿主细胞中。
基因变异技术
随机突变
通过暴露细菌或真核生物于突变 诱导剂，引起基因突变。
Hale Waihona Puke 定点突变使用CRISPR-Cas9等工具直接编辑 特定位点上的基因序列。
基因插入
将新的基因序列插入到生物体细 胞中，改变其特性。
基因组编辑技术
基因组编辑技术可以精确改变生物体DNA序列。常见的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9、TALEN和ZFN。
基因表达调控技术
基因表达调控技术可以控制基因的活性水平，包括转录因子修饰、RNA干扰和 放大子活性调节。
基因工程的常规技术
基因工程涉及一系列常规技术，包括基因克隆、基因变异、基因组编辑、基 因表达调控、基因组合成和基因传递技术。这些技术在各个领域都发挥着重 要作用。
常规基因工程技术
限制性内切酶
通过将DNA切割成片段，限制性内切酶在基因工 程中发挥着重要作用。
酶联免疫吸附检测
这一技术常用于检测基因表达水平，帮助研究基 因功能。
利用高速氦气或金属颗粒将基因直接转移至细胞内。
应用领域
医学
基因工程应用于疾病治疗、基因诊断和个性化药 物研发。
工业
利用微生物生产重要药物、酶和生物聚合物。
农业
通过基因编辑和转基因技术改良农作物，提高产 量和抗病能力。
基因工程原理及实验技术
基因工程原理及实验技术基因工程是一种利用DNA技术改变生物的基因组成和功能的技术，它是现代生物技术的重要分支之一、基因工程的原理主要涉及到基因的克隆、重组和转入宿主细胞等过程。
在实验上，基因工程采用一系列的实验技术来进行基因的克隆、重组和表达。
基因工程的原理主要包括以下三个步骤：基因克隆、基因重组和基因转移。
首先，基因工程的第一步是基因克隆，通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法，将目标基因从其宿主细胞中扩增出来。
然后，将扩增的目标基因插入到载体DNA中，形成重组DNA。
载体常用的有质粒DNA、病毒DNA 等。
第二，基因重组是将目标基因插入到载体DNA中，形成重组DNA。
重组的方法主要有两种，一是限制性内切酶切割，通过酶切将目标基因和载体DNA切开，然后利用互补的末端序列使目标基因与载体DNA连接；二是利用连接酶连接，直接将目标基因与载体DNA连接形成重组DNA。
重组DNA得到后，可以通过转化、通过感染等方法引入宿主细胞。
第三，基因转移是将重组DNA转移到宿主细胞中，使宿主细胞具有新的基因特性。
宿主细胞可以是细菌、植物或动物细胞等。
细菌表达系统是广泛用于基因工程的一个常见实验技术。
将重组DNA转入细菌中，然后通过培养、筛选等方法，筛选出带有目标基因的细菌。
利用这些细菌，可以生产大量的目标基因产物。
在基因工程的实验中，有一些常见的技术也是必不可少的。
如PCR技术是一种在体外扩增DNA片段的方法，它可以高效快速地扩增目标基因。
PCR技术是基因工程中的一项基础技术，可用于克隆、基因突变、基因定量等实验。
另外，在基因工程实验中，还常用到DNA测序技术、蛋白质表达和纯化技术、细胞培养技术等。
总之，基因工程的原理主要涉及基因的克隆、重组和转移，通过一系列的实验技术来实现。
基因工程的发展为我们带来了很多巨大的利益，例如疾病的诊断和治疗、转基因作物的培育、蛋白质生产等。
同时，我们也需要充分考虑基因工程的伦理和安全性问题，确保其应用的合理性和安全性。
基因工程第五章 PCR技术原理
dATP dGTP dCTP dTTP
Mg2+
buffer
DNA amplification
5' 3' 3' 5'
dATP dGTP dCTP dTTP
Mg2+
buffer
DNA amplification
5' 3' 3' 5'
dATP dGTP dCTP dTTP
Mg2+
• 其实在Mullis提出PCR概念以前，Khorana等人在20 世纪60年代末70年代初就提出了PCR技术的概念， 只不过当时使用了修复复制的概念。 • 也许是当时科学技术的发展需求和进展不够，没有 达到使其进一步发展的动力，使得Khorana等人的 想法被人淡忘了15年。 • 但有一点是不争的事实，正是由于Mullis及其同事 在80年代的出色工作，才使的PCR成为当今生物学 及相关学科使用最广泛的技术，使得常规克隆已不 再是分离基因的唯一手段，在1993年获得若贝尔奖 也是当之无愧的。
Mg2+
buffer
DNA amplification
5' 3'
---------------------
3' 5'
dATP dGTP dCTP dTTP
Mg2+
buffer
DNA amplification
5' 3'
----------------------
3' 5'
dATP dGTP dCTP dTTP
Mg2+
buffer
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本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
聚丙烯酰胺 凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）
PAGE原理
Acr(单体丙烯酰胺) Bis(交联剂) AP(催化剂过硫酸铵) TEMED(加速剂)
以此凝胶为支 持物的电泳称 PAGE。
电泳的合适电压和温度
❖ 电泳时电压不应该超过 20V/cm，电泳温度 应该低于30℃。
❖ 注意如果电泳时电压和 温度过高，可能导致出 现条带模糊和不规则的 DNA带迁移的现象。 特别是电压太大可能导 致小片段跑出胶而出现 缺带现象
DNA样品的纯度和状态
❖ 注意样品中含盐量太高和含杂质 蛋白均可以产生条带模糊和条带 缺失的现象。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
琼脂糖凝胶
DNA片段的回收
琼脂糖凝胶DNA片段的回收
操作流程
切胶
融胶
电转 电泳 离心
硝酸纤维膜
洗脱
目
线
的
性
基
载
因
体
本章内容
❖ 用棉塞塞住瓶口,并用牛 皮纸封住扎紧后,将烧瓶 于120℃消毒20min.
LB平板培养基配制
❖ 消毒结束后, 在超净工作台内将培养 基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度 为3~5毫米).
❖ 侍培养基冷却凝固后,于4℃中保存备 用.
细菌划线培养
❖ 取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌接 种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.
细菌划线培养
❖ 将平板置入37℃培养箱中倒置培养 12~16小时,然后取出观察有无菌落长出.
PAGE注意事项
❖ （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免 缓冲液渗漏。
❖ （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时 影响电流的通过。
❖ （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止 样品因对流而被稀释。
❖ （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有 气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
Ca2+
Ca2+
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
DNA 分子
Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+ Ca2+Ca2+
Ca2+
感受态
Ca2+
Ca2+
大肠杆菌 Ca2+
Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+CaC2a+2+Ca2+
选择电泳方法
１．一般的核酸检测只需要琼脂糖凝 胶电泳就可以； ２．如果需要分辨率高的电泳，特别 是只有几个bp的差别应该选择聚丙 烯酰胺凝胶电泳； ３．用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨 大的DNA链用普通电泳可能跑不出 胶孔导致缺带。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和 TBE，而TBE比TAE有着 更好的缓冲能力。
核酸琼脂糖 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理与操作
核酸的琼脂糖凝胶电泳—注意事项
准备干净的配胶板和电泳槽 选择电泳方法 适合的电泳缓冲液 正确选择凝胶浓度 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察
准备干净的配胶板和电泳槽
注意:DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象
电泳缓冲液配制
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，
PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳 产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
正确选择凝胶浓度
❖ 浓度通常在0.5～2％之 间，低浓度的用来进行 大片段核酸的电泳，高 浓度的用来进行小片段 分析。低浓度胶易碎， 小心操作和使用质量好 的琼脂糖是解决办法。
Marker的选择
❖ DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知 大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
凝胶的染色和观察
❖ 实验室常用的核酸染色 剂是溴化乙啶（EB）， 染色效果好，操作方便， 但是稳定性差，具有毒 性。而其他系列例如 SYBR Green， GelRed，虽然毒性小， 但价格昂贵。
❖ 注意变性的DNA样品可能导致 条带模糊和缺失，也可能出现不 规则的DNA条带迁移。在上样 前不要对DNA样品加热，用 20mM NaCl缓冲液稀释可以 防止DNA变性。
DNA的上样
❖ 正确的DNA上样 量是条带清晰的 保证。注意太多 的DNA上样量可 能导致DNA带型 模糊，而太小的 DNA上样量则导 致带信号弱甚至 缺失。
基因工程概论
第五章: 基因工程基本技术
主讲教师: 答疑电话:
Email:
引言
酶切
目 的 基 因
载
目
线
体
的
性
基
载
琼脂糖凝胶 因
体
回收技术
M
转化
电泳技术
连 接 反 应
肠感 杆受 菌态
大
重组载体
鉴定
筛选
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
钙磷复合物
DNA 分子
LB平板培养基配制
用天平准确称取下列物品并 置入一个洁净的100毫升 三角烧瓶中:
❖ 胰蛋白胨 1g ❖ 浓缩酵母浸出粉 0.5g ❖ NaCl 0.5g ❖ 1.5g的琼脂粉
LB平板培养基配制
❖ 在烧瓶中置入一磁力搅 拌棒并加入100毫升 ddH2O溶解上述物质, 然后磁力搅拌混匀.
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
感受态大肠 杆菌的制备
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感原理
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+
DNA 分子
大肠杆菌
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
DNA 分子
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+