第五章基因工程相关技术
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基因工程概论
第五章: 基因工程基本技术
主讲教师: 答疑电话:
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引言
酶切
目 的 基 因
载
目
线
体
的
性
基
载
琼脂糖凝胶 因
体
回收技术
M
转化
电泳技术
连 接 反 应
肠感 杆受 菌态
大
重组载体
鉴定
Baidu Nhomakorabea筛选
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+
DNA 分子
大肠杆菌
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
DNA 分子
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
DNA 分子
Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+ Ca2+Ca2+
Ca2+
感受态
Ca2+
Ca2+
大肠杆菌 Ca2+
Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+CaC2a+2+Ca2+
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
感受态大肠 杆菌的制备
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
❖ 用棉塞塞住瓶口,并用牛 皮纸封住扎紧后,将烧瓶 于120℃消毒20min.
LB平板培养基配制
❖ 消毒结束后, 在超净工作台内将培养 基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度 为3~5毫米).
❖ 侍培养基冷却凝固后,于4℃中保存备 用.
细菌划线培养
❖ 取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌接 种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.
电泳的合适电压和温度
❖ 电泳时电压不应该超过 20V/cm，电泳温度 应该低于30℃。
❖ 注意如果电泳时电压和 温度过高，可能导致出 现条带模糊和不规则的 DNA带迁移的现象。 特别是电压太大可能导 致小片段跑出胶而出现 缺带现象
DNA样品的纯度和状态
❖ 注意样品中含盐量太高和含杂质 蛋白均可以产生条带模糊和条带 缺失的现象。
选择电泳方法
１．一般的核酸检测只需要琼脂糖凝 胶电泳就可以； ２．如果需要分辨率高的电泳，特别 是只有几个bp的差别应该选择聚丙 烯酰胺凝胶电泳； ３．用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨 大的DNA链用普通电泳可能跑不出 胶孔导致缺带。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和 TBE，而TBE比TAE有着 更好的缓冲能力。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
琼脂糖凝胶
DNA片段的回收
琼脂糖凝胶DNA片段的回收
操作流程
切胶
融胶
电转 电泳 离心
硝酸纤维膜
洗脱
目
线
的
性
基
载
因
体
本章内容
核酸琼脂糖 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理与操作
核酸的琼脂糖凝胶电泳—注意事项
准备干净的配胶板和电泳槽 选择电泳方法 适合的电泳缓冲液 正确选择凝胶浓度 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察
准备干净的配胶板和电泳槽
注意:DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象
Marker的选择
❖ DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知 大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
凝胶的染色和观察
❖ 实验室常用的核酸染色 剂是溴化乙啶（EB）， 染色效果好，操作方便， 但是稳定性差，具有毒 性。而其他系列例如 SYBR Green， GelRed，虽然毒性小， 但价格昂贵。
PAGE注意事项
❖ （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免 缓冲液渗漏。
❖ （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时 影响电流的通过。
❖ （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止 样品因对流而被稀释。
❖ （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有 气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
聚丙烯酰胺 凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）
PAGE原理
Acr(单体丙烯酰胺) Bis(交联剂) AP(催化剂过硫酸铵) TEMED(加速剂)
以此凝胶为支 持物的电泳称 PAGE。
❖ 注意变性的DNA样品可能导致 条带模糊和缺失，也可能出现不 规则的DNA条带迁移。在上样 前不要对DNA样品加热，用 20mM NaCl缓冲液稀释可以 防止DNA变性。
DNA的上样
❖ 正确的DNA上样 量是条带清晰的 保证。注意太多 的DNA上样量可 能导致DNA带型 模糊，而太小的 DNA上样量则导 致带信号弱甚至 缺失。
电泳缓冲液配制
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，
PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳 产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
正确选择凝胶浓度
❖ 浓度通常在0.5～2％之 间，低浓度的用来进行 大片段核酸的电泳，高 浓度的用来进行小片段 分析。低浓度胶易碎， 小心操作和使用质量好 的琼脂糖是解决办法。
细菌划线培养
❖ 将平板置入37℃培养箱中倒置培养 12~16小时,然后取出观察有无菌落长出.
钙磷复合物
DNA 分子
LB平板培养基配制
用天平准确称取下列物品并 置入一个洁净的100毫升 三角烧瓶中:
❖ 胰蛋白胨 1g ❖ 浓缩酵母浸出粉 0.5g ❖ NaCl 0.5g ❖ 1.5g的琼脂粉
LB平板培养基配制
❖ 在烧瓶中置入一磁力搅 拌棒并加入100毫升 ddH2O溶解上述物质, 然后磁力搅拌混匀.
第五章: 基因工程基本技术
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引言
酶切
目 的 基 因
载
目
线
体
的
性
基
载
琼脂糖凝胶 因
体
回收技术
M
转化
电泳技术
连 接 反 应
肠感 杆受 菌态
大
重组载体
鉴定
Baidu Nhomakorabea筛选
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+
DNA 分子
大肠杆菌
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
DNA 分子
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
DNA 分子
Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+ Ca2+Ca2+
Ca2+
感受态
Ca2+
Ca2+
大肠杆菌 Ca2+
Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2C+a2+Ca2+Ca2+Ca2+Ca2+CaC2a+2+Ca2+
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
感受态大肠 杆菌的制备
感受态大肠杆菌：在基因工程操作过程中，我们把处于易 接收外源ＤＮＡ状态的大肠杆菌，称为感受态大肠植菌．
经典氯化钙法制备感受态大肠杆菌的原理
❖ 用棉塞塞住瓶口,并用牛 皮纸封住扎紧后,将烧瓶 于120℃消毒20min.
LB平板培养基配制
❖ 消毒结束后, 在超净工作台内将培养 基倒入消过毒的平皿中(培养基的厚度 为3~5毫米).
❖ 侍培养基冷却凝固后,于4℃中保存备 用.
细菌划线培养
❖ 取一块无抗菌素的LB平板培养基,在超净工作台内,用细菌接 种环挑取细菌,于培养基上作蛇形画线.
电泳的合适电压和温度
❖ 电泳时电压不应该超过 20V/cm，电泳温度 应该低于30℃。
❖ 注意如果电泳时电压和 温度过高，可能导致出 现条带模糊和不规则的 DNA带迁移的现象。 特别是电压太大可能导 致小片段跑出胶而出现 缺带现象
DNA样品的纯度和状态
❖ 注意样品中含盐量太高和含杂质 蛋白均可以产生条带模糊和条带 缺失的现象。
选择电泳方法
１．一般的核酸检测只需要琼脂糖凝 胶电泳就可以； ２．如果需要分辨率高的电泳，特别 是只有几个bp的差别应该选择聚丙 烯酰胺凝胶电泳； ３．用普通电泳不合适的巨大DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨 大的DNA链用普通电泳可能跑不出 胶孔导致缺带。
适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和 TBE，而TBE比TAE有着 更好的缓冲能力。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备 ❖ 基因组DNA的提取与纯化 ❖ RNA的提取与cDNA合成
琼脂糖凝胶
DNA片段的回收
琼脂糖凝胶DNA片段的回收
操作流程
切胶
融胶
电转 电泳 离心
硝酸纤维膜
洗脱
目
线
的
性
基
载
因
体
本章内容
核酸琼脂糖 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳原理与操作
核酸的琼脂糖凝胶电泳—注意事项
准备干净的配胶板和电泳槽 选择电泳方法 适合的电泳缓冲液 正确选择凝胶浓度 电泳的合适电压和温度 DNA样品的纯度和状态 DNA的上样 Marker的选择 凝胶的染色和观察
准备干净的配胶板和电泳槽
注意:DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象
Marker的选择
❖ DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知 大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
凝胶的染色和观察
❖ 实验室常用的核酸染色 剂是溴化乙啶（EB）， 染色效果好，操作方便， 但是稳定性差，具有毒 性。而其他系列例如 SYBR Green， GelRed，虽然毒性小， 但价格昂贵。
PAGE注意事项
❖ （1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免 缓冲液渗漏。
❖ （2）用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时 影响电流的通过。
❖ （3）样品中应含一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止 样品因对流而被稀释。
❖ （4）加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有 气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。
本章内容
❖ 核酸的琼脂糖凝胶电泳 ❖ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ❖ 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 ❖ 感受态大肠杆菌的制备
聚丙烯酰胺 凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）
PAGE原理
Acr(单体丙烯酰胺) Bis(交联剂) AP(催化剂过硫酸铵) TEMED(加速剂)
以此凝胶为支 持物的电泳称 PAGE。
❖ 注意变性的DNA样品可能导致 条带模糊和缺失，也可能出现不 规则的DNA条带迁移。在上样 前不要对DNA样品加热，用 20mM NaCl缓冲液稀释可以 防止DNA变性。
DNA的上样
❖ 正确的DNA上样 量是条带清晰的 保证。注意太多 的DNA上样量可 能导致DNA带型 模糊，而太小的 DNA上样量则导 致带信号弱甚至 缺失。
电泳缓冲液配制
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，
PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳 产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
正确选择凝胶浓度
❖ 浓度通常在0.5～2％之 间，低浓度的用来进行 大片段核酸的电泳，高 浓度的用来进行小片段 分析。低浓度胶易碎， 小心操作和使用质量好 的琼脂糖是解决办法。
细菌划线培养
❖ 将平板置入37℃培养箱中倒置培养 12~16小时,然后取出观察有无菌落长出.
钙磷复合物
DNA 分子
LB平板培养基配制
用天平准确称取下列物品并 置入一个洁净的100毫升 三角烧瓶中:
❖ 胰蛋白胨 1g ❖ 浓缩酵母浸出粉 0.5g ❖ NaCl 0.5g ❖ 1.5g的琼脂粉
LB平板培养基配制
❖ 在烧瓶中置入一磁力搅 拌棒并加入100毫升 ddH2O溶解上述物质, 然后磁力搅拌混匀.