5.7双水相萃取

葡聚糖本质上是一种几乎不能形成偶 极现象的球形分子，而PEG是一种具有共 享电子对的高密度直链聚合物。各个聚合 物分子都倾向于在其周围有相同形状、大 小和极性的分子，同时，由于不同类型分 子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相 互吸引力，因此聚合物发生分离，形成二 个不同的相，这就是所谓的“聚合物不相 溶性”。
系统聚合物组成
系统物化性质
盐及缓冲液 温度
1、双水相中聚合物组成的影响 当两种不同聚合物的溶液混合时，可能存 在三种情况：
完全混溶性（匀相溶液）； 物理的不相溶性（相分离）； 复杂的凝聚（相分离）。
eg. 离子和非离子型聚合物都可使用在双水 相系统的构成上，但当这两种聚合物是离 子化合物并带有相反电荷时，它们相互吸 引并发生复杂的凝聚。
生物小分子物质的分离：
双水相体系萃取分离技术对青霉素G钠盐等 生物小分子物质的分离也可以取得理想效 果；
药物的分离和提纯：
如基因工程药物、抗菌素、动、植物药物 的提取，也可以利用该技术开发我国传统 的中草药；
在分析检测中的应用：
液- 液分配层析(LL PC)
将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物) 上， 另一种聚合物的溶液作为流动相，这种柱
温度的变化 虽然影响液相物理 性质的变化，从而 影响溶质在两相间 的分配，但总的来 说，影响不敏感。
图8 不同温度下葡聚糖500/ 聚乙二醇6000/水系统相图
七、双水相系统的应用
生物行业 食品工业
表5 双水相萃取在生物分离中的应用
酶的提取和纯化
表6 从破碎的细胞中萃取分离酶
菌体
酶
双水相组 成 PEG-粗 Dex PEG/盐
双 水 相 萃 取 现 象 最 早 是 1896 年 由
Beijerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶 混合时发现的，被称为“聚合物的不相 溶性”。
20 世 纪 60 年 代 瑞 典 Lund 大 学 的
Albertsson P A及其同事们最先提出双水 相萃取技术并做了大量工作。
70 年代中期西德的 Kula M R 和 Kroner
可见，高聚物 - 高聚物体系对活性物质 变性作用小，界面吸附少，但价格高。因 而寻找廉价的高聚物-高聚物体系是双水相 萃取技术发展的一个重要方向。
目前比较成功的是用变性淀粉 PPT 代替昂贵的 DEX。 PPT-PEG体系已被用 于从发酵液中分离过氧化氢酶、 β-半乳 糖苷酶等。
该体系具有很多优点：
三、双水相系统的重要特征
两相的黏度：萃取相在2~10mPa.s范围
内，而发酵液匀浆相在 100~10000mPa.s 范围内。
双水相系统呈现出低的界面张力。
四、双水相体系的类型
表1 几种典型双水相体系 聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、羟丙基葡聚糖 聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、聚蔗糖
细胞色素C 肌红蛋白
尿激酶
磷酸盐
PEG
0.65
16.3
5.0
2.0*10-4
⑶. 双水相萃取同亲和层析相结合
在PEG或DEX上接上一定的亲和配基， 这样不但使体系具有双水相处理量大的特 点，而且具有亲和层析专一性高的特点。
表10 亲和层析和亲和双水相比较
亲和双水相 亲和配基 收率% 处理量 u/ml 120 染料浓 度 umol.m 20~24 收率% 亲和层析 处理量 u/ml 20 染料浓 度 umol.m 2
葡聚糖也可 由其他多糖代替， 可得到类似的结 果，如右图所示。
图4 200C聚乙二醇/羟丙基淀粉 和聚乙二醇/葡聚糖系统的相图
2、双水相系统物理化学性质的影响
双水相系统的性质主要取决于下列物理 参数：密度（ ρ ）和两相间密度差、黏度 （μ）和两相间黏度差、表面张力（σ）。
表4 聚乙二醇4000/葡聚糖PL500系统的物理化学常数
K H等人首先将双水相系统应用于从细胞 匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了 胞内酶的提取效果。
1989年Diamond等推导出生物分子在双
水相体系中的分配模型，但尚有局限。
由于成本方面的原因，双水相萃取技术
上的优势被削弱，真正工业化的例子很 少。
二、双水相体系的形成
典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇 （ PEG ）和葡聚糖（ DEX ），各溶质均为 低浓度时，可得到单相匀质液体；当溶质 浓度增加时，溶液变得浑浊，静止形成双 液层：上层富集PEG，下层富集葡聚糖。
硫酸葡聚糖钠盐 聚丙烯乙二醇 羧基甲基葡聚糖钠盐 甲基纤维素
羧甲基葡聚糖钠盐
聚乙二醇
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、酒石酸钾钠
五、双水相萃取的理论基础
相平衡关系
图1 PEG/DEX体系相图
物质在两相中的分配
生物大分子在两相中的分配仍服从分配定
律。
ct k cb
六、双水相系统中物质分配的影响因素
CibacronBlue3GA
90
60
ProcionRec HE-3B
95
100
12~15
85
35
4
近年来亲和双水相发展极为迅速，仅 在PEG上可接的配基就有十多种，分离产 物达到几十种，分配系数成百上千倍的提 高。
思考:
1、双水相体系是如何形成的？ 2、双水相萃取的基本原理是什么？ 3、影响双水相萃取得率的因素有哪些？ 4、试分析亲和双水相的分离机制。
下，用超滤或渗析等膜过滤回收；
蛋白质积聚在PEG中：加入盐使蛋白质重
新分配到盐相中。PEG的分离同样可用膜 分离来实现。
十、双水相萃取技术的进展
1、廉价双水相体系的开发
表6 两种双水相体系的比较
体系 优点 缺点 PEG/DEX 盐浓度低，活性 价格贵，黏度大，分 损失小 相困难 PEG/盐 成本低，黏度小 盐浓度高，活性损失 大，界面吸附多
细胞色素 牛血清蛋白
乳酸脱氢酶 过氧化氢酶
磷酸果糖 激酶
140000 250000
800000
0.06 0.11
<0.01
0.05 0.23
0.01
0.09 0.40
0.01
0.16 0.79
0.02
0.10 1.15
0.03
表3 PEG分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响
蛋白质 体系的组成 相对分 子量 D-500（9%） D-500 D-500（8%） D-500（8%） /P/P/P（8%）/P4000(7.1%) 6000 (6%) 20000(6%) 40000(6%) 12384 0.17
虽然葡聚糖T500 和水解过的葡聚糖 相对分子量在同一 数量级，但二者的 双节线离得远，这 种差别是由于聚合 度分布性效应造成 图2 的。
200C聚乙二醇4000/葡聚糖系统双节点曲线， 比较三种不同类型的葡聚糖
表2 葡聚糖分子对不同相对分子量蛋白质分配系数的影响 蛋白质 相对分子 量 葡聚糖 40 12384 69000 0.18 0.18 葡聚糖组成 葡聚糖 70 0.14 0.23 葡聚糖 葡聚糖 220 500 0.15 0.31 0.17 0.34 葡聚糖 2000 0.21 0.41
细胞浓度 /% 20 30
分配系 数 2.95 8.2
Candida Boidinii Saccharomg ces Cerevisine Escherichia Coli
过氧化氢 酶 已糖激酶
收 率 /% 81 92
天冬氨酸 酶
PEG1550 /磷酸钾盐
25
5.7
96
7
细胞组织的分离
用三甲胺PEG/ Dextran 体系可分离含胆 碱受体的细胞；
PEG/质 量分数% 6.0 6.5 8.0 9.0 Dextran/ 质量分数 % 5.8 6.1 7.6 8.5 Δρ/ μ/ μ g/ 界面宽度/ VT/VB 质量分数 (Kg/m (mPa.s) (mPa.s) 3) % 6.2 10.5 19.8 24.8 1.5 1.4 1.7 1.9 18 32 64 79 4.1 3.6 4.3 4.4 43 100 3.3 364 σ/ (mN/ m) 0.3*10
病毒的纯化：
用PEG/ NaDS 体系可对脊髓病毒和腺病 毒进行纯化,回收率可达90%
生长激素的纯化： 用 PEG/ 盐体系可提
纯人的生长激素,回收率Y= 60%；
干扰素的分离： 用PEG- 磷酸酯/ 盐体
系分离β- 干扰素, Y= 97 %; 从重组大 肠杆菌匀浆中提取α- 干扰素, Y= 99.15 % ,纯度提高25 倍
0.52 0.13
细胞色素
0.17
0.34 0.08
0.13
0.14 0.05
0.12
0.11 0.03
牛血清蛋白 69000 乳酸脱氢酶 14000 0
过氧化氢酶 25000 0
0.82
0.38
0.16
0.10
由表2、表3可见，蛋白质的分配系数随着 葡聚糖相对分子量的增加而增加，随着 PEG相对分子量的增加而降低。

比 PEG- 盐体系稳定，与 PEG-DEX 体系 相图相似； 蛋白质溶解度大； 黏度小； 价格便宜。

2、双水相萃取技术同其他分离技术结合
⑴. 双水相体系同生物转化相结合
图10 利用双水相体系将木质纤维素转化为乙醇流程
利用葡萄糖和淀粉生产乙醇；
利用葡萄糖生产丙酮丁醇；
利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖；
-2
0.12*1 0-2 2.0*10
-2
4.1*10
-2
eg. PEG-(NH4)2SO4双水相系统萃取糖化酶 (NH4)2SO4 浓 度 固 定 不 变 时 ， 增 加 PEG400 的浓度有利于酶在上相的分配， 当 PEG400 浓度在 25~27% 时，分配系数高 达47.3，浓度过高则不利于酶的分配。 PEG400 浓 度 固 定 为 26% 时 ， 增 加 (NH4)2SO4浓度，糖化酶的分配系数也增大。 (NH4)2SO4的最适浓度为16%。
层析技术可分离蛋白质、核酸以及细胞混
合物。
食品工业中用来从酸水解产物中提取风味
物质：
二肽、氨基酸、核苷酸等
八、双水相萃取的工艺流程
目的产物的萃取
PEG的循环Βιβλιοθήκη Baidu
无机盐的循环
连续错流萃取回收酶的流程图
九、成相聚合物的回收
膜处理
沉淀
离子交换和吸附
电泳或亲和分配和双水相萃取相结合
蛋白质分配在盐相：盐可用错流操作方式
酵母菌存在下
肺炎克雷氏菌存在下
图5 细胞物质浓度对酶分配的影响
3、盐和缓冲液的影响
水溶液中存在的离子会影响溶质在两 相间的分配。因为阴阳离子的不均匀分配 会产生相界面电位，影响蛋白质、核酸等 荷电大分子的分配。通常增加盐浓度可提 高酶的分配系数。
图6 聚乙二醇4000/硫酸铵系统中，支链淀 粉酶的分配系数与硫酸铵总浓度的关系
eg. 在 PEG-DEX系统中加入 NaClO4或 KI，能增加上相对带正电物质的亲和效 应，并迫使带负电物质进入下相；若加 入Li3PO4，则与上述效应刚好相反。
因此，只要设法改变界面电位，就 能控制蛋白质等荷电大分子转入某一相。
图7 聚乙二醇葡聚糖系统中支链淀粉酶的分配与pH值的关系
4、温度的影响
萃取新技术之
第七节 双水相萃取
一、概述
双水相萃取（ Two-aqueous phase extraction ） 又 称 水 溶 液 两 相 分 配 技 术 （ Partion of two aqueous phase system）是近年来出现的引人注目、极有 前途的新型分离技术。 其特点是能够保留产物的活性，操作 可连续化，能耗低，处理容量大。
水解酪蛋白；
发酵生产乳酸； 将青霉素G转化为氨基青霉烷酸等
⑵. 双水相萃取技术同膜分离技术相合
表7 双水相萃取同膜分离结合的例子
萃取物 内侧流 体 磷酸盐 磷酸盐 外侧 流体 PEG PEG 分配系 数 0.18 0.009 内侧流 速 /cm.s 16.3 4.0 外侧流 速 /cm.s 6.6 5.0 传质系数 /cm/s 5.5*10-6 7.5*10-7