第十四章 免疫学检测技术

第十四章 免疫学检测技术
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
抗原和抗体可以发生高度专一性的结合
• 抗原或抗体检测原理：
借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的 各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定 性或定量的检测。
Equivalence – Lattice formation
多克隆抗体与单克隆抗体
多克隆抗体与单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
骨髓瘤细胞 （ HGPRT-TK- ) 在HAT中不能生长 脾脏淋巴细胞 （HGPRT+TK+） 体外培养过程中死亡 ↓←PEG 杂交瘤细胞 (HGPRT+、TK+) ↓ 在HAT中大量长期繁殖 ↓ 克隆化 ↓
产生单抗
第一节 免疫学检测技术原理
3. 免 疫监视（Immunological surveillance）：机 体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使 细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些 细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下 或失调时，会导致肿瘤或癌症。
抗原 （Antigen）
抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞， 并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生 反应的物质。
抗原性（Antigenicity）：包括免疫原性和反应原性
二个方面 • 免疫原性：抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细 胞的性能。 • 反应原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体 内或体外发生反 应的性能。
抗原 （Antigen）
构成抗原的条件 1. 异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，只
有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。 亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。 自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体 蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白
• 抗原或抗体检测原理：
抗原抗体的结合具有高度专一性 借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种 现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的 检测。
对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理
Ab excess
Ag excess
Equivalence – Lattice formation
对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理
• 二、沉淀反应
4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定 量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的 是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未 知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内 的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根 据沉淀圈的大小确定抗原的含量
二、沉淀反应
另外还有其他众多的免疫检测技 术和手段，其机理都利用了抗原抗体 的沉淀反应。 例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳等。
抗原或抗体检测原理
• 免疫学（Immunology）： 是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应 答的规律及免疫应答的调节的一门科学。
• 免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识 别自我与非自我的过程。排除异己，维护 自身稳定的生理反应。
免疫的功能： 1. 抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物 侵袭的能力。又称免疫防御。 抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫 2. 自身稳定（Homeostasis）：机体在新陈代谢过 程中，产生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能 就是清除这些细胞，维持机体的生理平衡。
Ag
Ab1
Ab2
抗体（Antibody，Ab)
• 免疫球蛋白的双重性 • 免疫球蛋白的功能 1. 与抗原结合 2. 激活补体 3. 组织结合 4. 调理作用 5. 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC）
免疫球蛋白的功能
抗体（Antibody) 的产生与功能
抗体产生的主要过程
抗体
抗体的制备
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。
二、沉淀反应
当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形成 沉淀。
1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原， 在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉 淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗 体的分子比。 2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗 原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出 现环状沉淀。不能用于定量测定。
免疫电泳
二、抗原或抗体检测的现代方法：
P312 1. 免疫荧光技术 2. 酶联免疫分析法 3. 放射免疫分析法
第一节免疫学检测技术原理
二、抗原或抗体检测的方法： 1. 免疫荧光技术
将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术
常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)和罗丹明（rhodamine B200,RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸 的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明 的黄绿色及玫瑰红色。
抗原（如类毒素）
抗体？
抗原？
注射
血清
抗体的制备 • 抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含 特异性抗体的血清。
• 多克隆抗体 (PAb)： 多个抗原决定簇免疫机体
所产生的多种抗体的混合物。
• 单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） ：
只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。
一、凝聚反应(Agglutination) 二、沉淀反应
1、溶液中的沉淀反应 2、凝胶扩散沉淀 3、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳
三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术
酶联免疫吸附（ELISA）
一、凝集反应
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合 反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整 的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在 一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称 为凝集原，抗体称为凝集素。
第一节 免疫学检测技术原理
二、抗原或抗体检测的方法：
1. 免疫荧光技术 直接荧光法 间接荧光法
第一节 免疫学检测技术原理
二、抗原或抗体检测的现代方法：
P313 2. 酶联免疫分析法 3. 放射免疫分析法
第二节 免疫荧光技术在食品检测中 的应用
一、基本原理：
将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标 记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应 后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技 术，称为免疫荧光素技术。
第二节 免疫荧光技术在食品检测中 的应用
一、基本原理：
免疫荧光素技术
第二节免疫荧光技术在食品检测中 的应用
二、抗体的荧光标记 P315 （一）荧光抗体的制备 • 搅拌法 • 透析法 （二）荧光抗体的鉴定
鉴定指标：效价、 荧光素与蛋白质的结合比率
第二节 免疫荧光技术在食品检测中 的应用
三、标本的制作 P316
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
ELISA 基本原理 碱 性 磷 酸 酶 或 过 氧 化 物 酶
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 二、ELISA的种类 直接法测定抗原 间接法测定抗体 P320
抗原
一种细菌可以刺激多少种抗体产生？
根据抗原的化学性质分： • 天然抗原：微生物及其产物抗原如 • 菌体抗原（O 抗原） • 鞭毛抗原（H 抗原） • 表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原） • 细菌的毒素抗原 • 病毒抗原（V 抗原） • 人工抗原：人工合成多肽、蛋白等
抗体（Antibody)
一、概念 是抗原刺激B淋巴细胞, 使之增殖分化成 浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应 的免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)
免疫荧光检测技术已经广泛应品卫生领域也应用的越来越多。
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
一、基本原理 P319 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高 特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的 一种标记免疫技术。 酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA
双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼 脂，取4mL倒在普通载玻片上，凝固后打孔， 中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测 定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴 入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。
二、沉淀反应
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同， 沉淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧 有多条，彼此互不干扰。
二、沉淀反应
3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶 作介质的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物 质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗 体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀 弧。 沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的 大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗 体存在多种体系时，会出现多条沉淀弧。
根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进 行定量检测。 P 312
第一节 免疫学检测技术原理
可作为抗原进行检查的物质： 微生物及其大分子产物 人和动物细胞 人和动物体内的各种大分子 各种半抗原
抗原或抗体检测原理
较早的抗原抗体反应检测方法
1、凝集反应 （Agglutination) 2、沉淀反应 (Precipitation) 3、补体结合试验 (Complement fixation test ) 4、中和试验 (Neutralization test)
抗体（Antibody)
一、概念 二、免疫球蛋白的基本结构 免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其 他分泌液中的一类结构相似的球蛋白。 1. 由4 条肽链组成： 2 条重链， 2 条轻链 2. 一个抗体单分子： 2 个抗原结合位点