泰国伯克霍尔德菌错误鉴定1例

泰国伯克霍尔德菌错误鉴定1例

段梦;唱凯;王艺;黎敏;周道红;鲁卫平

【摘要】目的鉴定1例曾被错误鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌的泰国伯克霍尔德菌.方法对1例肺脓肿合并败血症患者的痰液和血液标本进行细菌分离培养、生化鉴定、分子生物学鉴定和药敏试验鉴定.结果培养出革兰阴性短小杆菌;生化鉴定特征符合泰国伯克霍尔德菌;测序结果显示与泰国伯克霍尔德菌相似度达100％,与类鼻疽伯克霍尔德菌相似度为99％;全基因组测序结果显示该菌与泰国伯克霍尔德菌E444具有最近的亲缘关系.药敏试验结果显示该菌对亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感.结论成功鉴定了1例泰国伯克霍尔德菌.

【期刊名称】《临床检验杂志》

【年(卷),期】2016(034)003

【总页数】3页(P237-239)

【关键词】泰国伯克霍尔德菌;类鼻疽伯克霍尔德菌;鉴定

【作者】段梦;唱凯;王艺;黎敏;周道红;鲁卫平

【作者单位】第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科,重庆400042

【正文语种】中文

【中图分类】R446.5

泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis，B.thailandensis)过去曾被认为

是伯克霍尔德菌属中一种对人和动物无致病性的环境腐生菌，该菌与类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，B.pseudomallei)在菌落形态、免疫原性和抗菌药物敏感谱等表型特征非常相似，难于区分，曾被划为B.pseudomallei的1个生物型[1]。1988年，Brett等依据16S rRNA基因序列差异，将4株来源于环境的类鼻疽伯克霍尔德菌样菌种(B.pseudomallei-like specie)提议为1个新种，

因最早分离自泰国而被命名为B.thailandensis。世界上2个主要的类鼻疽流行区，即东南亚和澳大利亚北部，均已发现B.thailandensis，主要存在于以上地区的土

壤中，特别是稻田。2014年，我国学者郑霄等[2]首次报道从海南类鼻疽流行区的土壤和水源中发现B.thailandensis。但由B.thailandensis引起的人类感染国内

外鲜有报道[3]。2013年10月我科从1例肺脓肿合并败血症患者的痰液和血液标本中，分离出1株曾被错误鉴定为B.pseudomallei的B.thailandensis，报告如下。

患者，男，76岁，系重庆市某区农民。因“咳嗽、发热、气促等症状10余日”，曾就诊当地医院，给予静脉输液(具体用药不详)12 d未见明显缓解。于2013年

10月25日至我院就诊，X线胸部平片及胸腹部CT检查均提示：右肺上叶前段占位性病变，考虑肺脓肿可能性大，肺癌不能除外；双肺多发小片状及结节影，考虑感染性病变，肿瘤待排；右肺中叶部分性肺不张，双下胸膜增厚粘连。血液学检查：WBC 37.16×109/L，PLT 661×109/L、N 29.73×109/L。入院查体：体温39 ℃，脉搏89 次/分，呼吸25次/分，血压127/53 mmHg；神志清楚，精神较差，急

性病面容，面部表情不安，全身浅表淋巴结未扪及肿大，听诊双肺呼吸音减弱，右

肺可闻及湿性啰音，双下肢水肿。无高血压及先天性心脏病史，无糖尿病史，无手术史及输血史，无近期外伤史，无不良嗜好。2013年10月27日送检痰培养和血培养，均培养出B.thailandensis，编号为BPM。期间患者使用亚胺培南/西司他

丁钠抗炎治疗，10月30日下午患者主动要求出院返回居家治疗，病情时轻时重，意识时有不清醒，于11月2日病情加重而死亡。

取痰标本接种血平板、巧克力平板和麦康凯平板(均为赛默飞公司)，置5% CO2、35 ℃培养；无菌采集血液接种1套血培养瓶置Bact/ALERT 3D 120 全自动血培

养仪(法国Bio Mérieux公司)检测。血培养需氧瓶23.45 h报告阳性，直接涂片革兰染色显示革兰阴性杆菌，厌氧瓶培养5 d无细菌生长。阳性需氧瓶培养液转种

血平板及痰培养血平板均生长相同形态菌落：光滑、湿润、不透明、具有银灰色金属光泽；巧克力平板上菌落光滑、湿润、不透明、具有银色金属光泽；麦康凯平板上菌落淡红色、湿润、扁平、具有金属光泽。细菌革兰染色镜下形态：革兰阴性短小杆菌。菌落及镜下形态分别见图1和图2。

采用Vitek 2 Compact 全自动微生物鉴定仪及配套GN卡(法国Bio Mérieux公司)进行细菌鉴定，结果为B.pseudomallei，生物编码为：0003451513500211，鉴定率为97%。采用API 20NE鉴定系统(法国Bio Mérieux公司)进行复核菌种

鉴定，结果仍为B.pseudomallei，生物编码为：1157577，鉴定率为50.5%，T

值0.5，然而生化反应中阿拉伯糖(arabinose，ARA)为阳性，该特征符合

B.thailandensis。

4.1 16S rRNA基因序列分析以细菌基因组DNA为模板，参照文献[4]合成

16S rRNA 基因引物。F：5′-GATCATGGCTCAGATTGAAC-3′，R：5′-CTACGGT

TACCTTGTTACGA-3′，扩增产物长度为1 397 bp。

PCR反应采用宝生物公司PCR试剂盒。50 μL反应体系：10×PCR buffer 5.0 μL，

25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，20 μmol/L 上、下游引

物各1.0 μL，5 U/μL ExTaq DNA聚合酶0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 38.5 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s(35个循环)；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物由南京金斯瑞公司进行双向测序，测序结果与GenBank

核酸数据库进行BLAST序列比对，显示该序列与B.thailandensis(GenBank No. CP000085.1和CP000086.1)相似度达100%，与B.pseudomallei(GenBank No. CP004379.1和CP004380.1)相似度为99%。

4.2 全基因组测序由深圳华大基因公司完成，通过Illumina Hiseq 2 000平台

测序，基于测序数据组装得到该菌基因组大小为6 454 019 bp，GC含量67.88%，共76个scaffold，114个contig。运用SOAPaligner(版本：2.21)序列比对软件，将测序得到的整条read序列和参考序列进行比对。在比对时，每条read允许的

最大错配数为5，如果1条read可以比对到参考序列的多个位置，则只选1个。

根据比对结果，计算出平均深度和覆盖度。通过比较基因组学分析，该株菌序列与参考基因组序列B.thailandensis E264 GeneBank No. CP000085.1和

CP000086.1同源性分别为96.5%和96.05%。对该菌基因组进行了精细图测序，

以该菌(BPM)DNA为参考序列，B.mallei ATCC 23344、B.pseudomallei 1106a、B.thailandensis 2002721723、B.thailandensis E264、B.thailandensis E444为比对菌株，采用TreeBeST软件 PHYML(最大似然法)算法构建系统进化树。结果

显示BPM与B.thailandensis E444具有最近的亲缘关系，系统进化树见图3。

采用Vitek 2 Compact 配套AST-GN13药敏卡(法国Bio Mérieux公司)进行抗菌药物敏感性试验，结果显示：该菌株对亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感；对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢替坦、头孢吡肟、氨曲南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星耐药。