某种苯酚降解细菌的分离,纯化,鉴定
苯酚降解细菌实验报告
苯酚降解细菌实验报告引言苯酚是一种有机溶剂和消毒剂，在工业生产和日常生活中广泛使用。
然而，由于其具有较强的毒性和对环境的潜在危害，苯酚的降解成为了一个重要的研究领域。
本实验旨在从自然环境中分离得到能够降解苯酚的细菌，并对其降解效果进行评估。
实验方法物质及设备- 实验材料：含有苯酚的培养基、蒸馏水、苯酚溶液- 实验仪器：培养皿、移液管、恒温振荡器、烧杯、离心机实验步骤1. 从自然环境中采集土壤、水样品。
2. 将土壤、水样品分别加入含有苯酚的培养基中。
3. 分别在不同温度下（比如25、37）进行恒温振荡培养，培养时间根据实验需求确定。
4. 取样品进行稀释，并分别接种在含有苯酚的琼脂培养基上。
5. 利用平板计数法，计算出细菌的菌落数目。
6. 采用高效液相色谱法检测苯酚的含量。
7. 进一步筛选表现出较强降解能力的细菌，进行进一步鉴定。
实验结果细菌菌落数目在实验过程中，我们成功分离到了一株对苯酚具有较强降解能力的细菌。
经过平板计数法的计算，其细菌菌落数目为1.2x10^6 CFU/ml。
苯酚的降解效果我们利用高效液相色谱法对苯酚的降解情况进行了检测。
实验结果表明，在细菌作用下，苯酚的降解速率较快。
在48小时内，苯酚的浓度从初始浓度的100 mg/L 降至5 mg/L，降解率达到了95%以上。
数据分析与讨论细菌的降解机制细菌通过代谢苯酚的酶系将苯酚降解为无机化合物，并利用其作为碳源和能源。
该细菌可能通过以下途径降解苯酚：1. 将苯酚通过羟化作用转化为苯酚羟化物；2. 苯酚羟化物经进一步代谢，生成苯甲酸、邻苯酚等化合物；3. 经过一系列代谢反应，最终生成无机化合物，如水和二氧化碳。
细菌的应用前景本实验分离得到的对苯酚具有降解能力的细菌，拥有较高的降解效率和广泛的适应性。
这些细菌可应用于苯酚的处理和环境修复，对于解决苯酚污染问题具有良好的应用前景。
结论通过本次实验，我们成功地分离出具有苯酚降解能力的细菌，并对其降解效果进行了评估。
苯酚降解菌的分离
实验方法
• 一、细菌的富集和分离 • 1、从校园小河污泥中取污泥，称取5.00g加到50ml含有
25mg/L苯酚的PMM培养基中。 • 2、于30℃,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次苯酚无
实验方法
• 2降酚菌的分离纯化： • 1、梯度平板法 • ①制备梯度平板：12ml不含苯酚的无菌耐
酚培养基倾斜于一直径9cm的培养皿中，立 即将此培养基协防形成斜面，并刚好遮住 底。待凝固后，平放，再加入12ml含苯酚 固体培养，完全遮住下层。 • ②稀释涂布分离： • 样品液稀释：将富集的培养基做10倍系列 稀释（至10^-3）
• 实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结 果没有是由于实验技术的原因，所以组员 要自己课下学习。
• 实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都 是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学 校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。
• 苯酚的毒性
Thanks
湖水污泥微生物中苯酚降解菌的 分离与特性测定
实验意义
苯酚是染料、农药、医药等行业 的重要生产原料和中间体,是工业废水 中的常见污染物之一。由于它具有较 强的生物毒性,许多国家已将其列入重 点污染物名单之中,并且采取各种措施 来消除环境中的苯酚污染。而且它的 水体污染很难去除。 所以在这些措施中,生物修复是一种低 成本的环境友好型污染消除方式,它的 关键是获得具有苯酚降解功能的微生 物。
机培养液。 • 隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加
至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终 浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培 养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l 。 • 3、最后取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为 300mg/L的PMM固体培养基平板上，30℃培养3d后挑取 形态上有差异的单菌落,。 • 以上所有培养均用黑布遮盖。
2022-2023学年江苏省淮安市涟水县一中高二5月月考生物试题
2022-2023学年江苏省淮安市涟水县一中高二5月月考生物试题1.下列有关种群及种群特征的叙述中，不正确的是（）A．五岛湖公园的湖水中所有鲫鱼构成一个种群B．种群密度是种群最基本的数量特征，某种群的个体数量越多，其种群密度就越高C．出生率和死亡率、迁入率和迁出率是决定种群数量变化的主要因素D．年龄结构、性别比例都可用于预测种群数量变化2.使用化学农药、采用生物防治的方法都可防治农作物害虫。
下列有关叙述中，不正确的是（）A．使用化学农药治理害虫，农药会污染水体、大气和土壤B．使用化学农药治理害虫，会使害虫的抗药性增强，并杀死害虫的天敌C．采用生物防治，可降低农业的生产成本，提高经济效益D．可利用生物之间的捕食、寄生、互利共生等种间关系，进行生物防治3.下列是关于生物群落、及其结构与群落演替的叙述，不正确的是（）A．自然生态系统中，生物群落通常由各种动物、植物、微生物构成B．群落结构有垂直结构和水平结构两大类型C．在火山岩上、冰川泥上发生初生演替，火灾后森林发生次生演替D．人类活动会改变群落演替的方向和速度4.下列是关于生态位的叙述，错误的是（）A．生态位是指生态系统中一个种群在空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系B．群落结构越复杂，生态位多样性越大，生物利用环境资源的能力就越强C．研究某种动物的生态位，通常要研究它的栖息地、食物、天敌以及与其他物种的关系等D．研究某种植物的生态位，通常要研究它在研究区域内的出现频率、种群密度、株高等特征等5.传统美食的制作体现了生物发酵技术，下列相关叙述正确的是（）A．酸奶和泡菜制作中均需要及时通氧，保证乳酸菌的有氧呼吸B．通过传统发酵技术可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白，用作动物饲料C．果酒、果醋制作所利用的菌种均能够进行有氧呼吸D．为降低杂菌污染，发酵前需要对器具、原料等进行灭菌6.下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是（）A．应根据微生物代谢类型选择合适的培养基并控制好培养基的pHB．待培养基冷却至室温后，在酒精灯火焰附近倒平板C．使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢弃D．实验操作时应避免已灭菌的材料用具与周围物品接触7.某研究性学习小组拟培育一种名贵花卉的脱毒苗，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→生芽、生根→移栽”。
高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性
中国环境科学 2021,41(5)：2441~2448 China Environmental Science 高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性刘庆辉,李剑*,杨航,王志宇,李艳,张玮川,贾银娟,张秋根,罗旭彪(南昌航空大学,重金属污染物控制与资源化国家地方联合工程研究中心,江西南昌 330063)摘要：从污水处理厂活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌L5-1,经菌落形态观察和16S rDNA基因测序,结果表明菌株L5-1为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),美国国家生物信息中心(NCBI)的注册号为MN784421.将苯酚设置为唯一碳源,对其生长和苯酚降解特性展开研究.结果表明: 菌株L5-1在10%接种量、温度30~35℃、pH值7~8的条件下,均能高效降解培养基中苯酚(培养基体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L,14h时降解率>93%).而在最优降解条件下(10%接种量,培养温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%),初始苯酚浓度为500mg/L,菌株在14h内的苯酚降解率可达97.1%;而当初始苯酚浓度为1000mg/L,菌株也可在46h内达到97.71%的降解率.运用Haldance方程动力学模拟菌株在不同浓度苯酚下的生长过程,其最大比生长速率为0.355h-1,半饱合常数104.27mg/L,抑制常数为322.83mg/L,R2=0.997. 菌株L5-1为目前已报道的Bacillus菌属中降解苯酚能力较强的菌株,为实际处理含酚废水中提供理论参考.关键词：Bacillus cereus；苯酚；生物降解；动力学中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2021)05-2441-08Isolation and degradation characteristics of highly efficient phenol-degrading bacteria Bacillus sp. L5-1. LIU Qing-hui, LI Jian*, YANG Hang, WANG Zhi-yu, LI Yan, ZHANG Wei-chuan, JIA Yin-juan, ZHANG Qiu-gen, LUO Xu-biao (National-Local Joint Engineering Research Center of Heavy Metals Pollutants Control and Resource Utilization, Nanchang Hangkong University, Nanchang 330063, China). China Environmental Science, 2021,41(5)：2441~2448Abstract：A highly efficient phenol-degrading bacterium named L5-1 was isolated and screened from the activated sludge from a sewage treatment plant. The colony morphology observation and 16S rDNA gene sequencing showed that the strain L5-1 was Bacillus cereus, with the registration number of MN784421 in the US National Center for Biotechnology Information (NCBI). A series of experiments with Phenol as the only carbon source were conducted to study the growth and phenol degradation characteristics of this strain L5-1. The results showed that under the conditions of 10% inoculum, temperature range of 30 to 35℃, pH range of 7 to 8 , the strain L5-1 effectively degraded phenol in the culture medium (with the 100mL of medium volume and the initial phenol concentration of 500mg/L), the degradation rate was better than 93% in 14h. Under optimal degradation conditions (10% inoculum, culture temperature at 35℃, pH 7.0, and NaCl concentration at 1%), The phenol degradation rate reached 97.1% within 14 hours when the initial concentration was set at 500mg/L. When the initial phenol concentration was set to 1000mg/L, the strain L5-1 still reached 97.71% degradation rate within 46 hours. The Haldane kinetic model was used to simulate the growth process of strains under different concentrations of phenol. The maximum specific growth rate was 0.355h-1, the semi-saturation constant was 104.27mg/L, the inhibition constant was 322.83mg/L, R2=0.997. This study confirmed Strain L5-1 was a Bacillus strains with strong phenol degradation ability among the reported strains of the genus Bacillus, and provided certain theoretical references for the actual treatment of phenol-containing wastewater.Key words：Bacillus cereus；phenol；biodegradable；kinetics苯酚污染废水是一种典型的高毒性工业废水,是纺织加工、煤炭气化、石油精炼、皮革制造、树脂合成、医药制造、香料生产、合成纤维等许多工业过程中常见的有机污染物[1].并且苯酚具有很强的流动性,在浓度很低时(1mg/L)也能快速渗透到周围生态环境中,导致水体有难闻的气味和味道,对动植物有长效性和生物积累性[2].美国和中国也先后将苯酚列入首批水中优先控制污染物名单[3].目前含酚废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法.利用生物法替代物理化学法矿化废水中的苯酚具有成本低、效率高等特点,且降解后的最终产物多为环境无害物质,如低碳化合物,二氧化碳和水[4-5].因此,利用生物法处理含酚废水受到广泛关注.近年来,国内外学者就如何利用微生物降解苯收稿日期：2020-09-25基金项目：国家自然科学基金资助项目(21467018);江西省教育厅项目(GJJ170576);江西省重点研发计划项目(20181ACG70021)* 责任作者, 副教授,***************.cn2442 中国环境科学 41卷酚污染废水进行了大量的研究, 筛选出多种菌株,有根瘤菌(rhizobia)[6]、不动杆菌如Acinetobacter calcoaceticus[7]和Acinetobacter sp.AQ5NOL 1[8]、红球菌如Rhodococcus erythropolis[9]和Rhodococcus spp.CM-HZX1[10]、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)[11]等.其中有许多能降解高浓度苯酚并具有良好耐受性的微生物,如Jiang等[12]从湖北某药厂的生物池中分离出Candida genus,能在72h内降解800mg/L苯酚.陈晓华等[13]从北京一处人工湿地分离出的Ochrobactrum sp.可耐受1300mg/L苯酚并在48h内对1000mg/L苯酚降解率达到82.2%,王图锦等[14]从一个焦化厂受污染的土壤中分离出不动杆菌,能在60h内完全降解初始浓度1200mg/L苯酚. Shourian 等[15]从制药处理废水中分离出的Pseudomonas sp.能在85h内降解1000mg/L苯酚.在目前发现的众多苯酚降解菌中,有不少研究报道Bacillus菌属能有效降解苯酚. Bacillus thuringiensis J20 在120h内对700mg/L的苯酚降解率为88.6%[16],Bacillus brevis 降解1000mg/L苯酚需132h[17].其中Bacillus cereus 降解废水中苯酚的研究较少,苯酚降解效率也较低,菌株Bacillus cereus F6在8h内仅能降解100mg/L 苯酚[18],Bacillus cereus B3降解800mg/L的苯酚需72h[19].本文取江西南昌象湖污水处理厂的曝气池活性污泥,在实验室模拟工业含酚废水逐步驯化苯酚降解菌,筛选出一株对高浓度苯酚耐受并且降解效果优异的菌株L5-1,探讨了培养条件(接种量、温度、pH值、盐度、初始苯酚浓度)对L5-1生长及苯酚降解的影响.并将实验数据与Haldance方程动力学模型相拟合,探究了菌株生长和初始苯酚浓度之间的关系,以期为微生物处理苯酚污染废水提供理论参考.1材料与方法1.1菌种的来源本研究用来分离筛选菌株的样品取自江西南昌象湖污水厂曝气池活性污泥(黑色絮状).1.2培养基的制备无机盐培养基(g/L):NH4NO31.50,KH2PO4 1.50, K2HPO4 1.2, NaCl 5.00, MgSO4 0.06, MnSO4 0.02, H3BO3 0.02,ZnSO4.7H2O 0.03, FeSO4 0.05,通过1mol/L的NaOH和HCl调节pH值.定容至指定体积后灭菌备用.富集培养基(g/L):牛肉浸膏4,蛋白胨8,NaCl 4.定容至指定体积后灭菌备用.固体培养基:在已配好的液体培养基中加入1.8%(质量分数)的琼脂粉制成固体培养基,经高压灭菌锅中灭菌后倒入无菌培养皿冷却备用.1.3菌种的富集与驯化将适量活性污泥加入到100mL无菌生理盐水中,在30,150r℃/min下充分振荡1h,取10%体积的菌液,在无菌环境下接种到灭菌后的富集培养基中.在30,150r℃/min下培养到对数增长期后,取10mL富集菌液接种到90mL的无机盐培养基中,并添加苯酚作为唯一碳源.在同样的培养条件下重复此操作,以100mg/L为增加量逐步提升苯酚浓度至1000mg/L.选择生长较好的培养基进行下一步实验.1.4苯酚降解菌的筛选与纯化用无菌水将培养至对数期的菌液稀释成不同浓度梯度.在无菌环境下均匀地涂布在固体培养基表面.在恒温培养箱中倒置培养,定时观察,挑取形态及大小、颜色不同的单一菌落,于事先配置好的300mg/L苯酚的固体无机盐培养基上划线,得到单一纯菌.将分离的单一纯菌富集培养至OD600为1.0左右,作为接种体备用.以10%(体积比)的接种量加入到无机盐培养基中,添加苯酚作为唯一碳源.在30℃、150r/min,以相同条件下没有加入菌液但添加了相同浓度苯酚的无机盐培养基作为对照组,通过定时检测各培养基的苯酚浓度选择出降解效果最好的菌株,最后再反复划线确保得到单株菌种.并用斜面低温保存.1.5菌株生长和苯酚降解率的测定细菌生长量的测定:采用不含菌液的无机盐培养基作为对照参比,在波长600nm处测定菌种吸光值(OD600).代入公式(1)计算菌体质量浓度(DCW)[19].600DCW(mg/L)314.5OD=× (1) 苯酚浓度采用4-氨基替比林法测定苯酚浓度[20],代入公式(2)计算培养基苯酚降解率(%)100%=−×苯酚降解率初始苯酚度微生物浓处浓浓理后苯酚度初始苯酚度(2)1.6菌株的鉴定及系统发育树的构建5期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 24431.6.1 形态学及生理生化鉴定 将菌株接种于固体培养基中观察其菌落形态,采用扫描电镜(SU1510)在10000倍下观察菌株L5-1的表面形态.测定菌株革兰氏染色、好氧性等生理生化指标.1.6.2 16S rDNA 序列分析 将要鉴定的菌株在固体培养基中划线培养至对数期后,用试剂盒(上海生工)提取分离出菌株L5-1的基因组DNA,采用细菌通用引物27F 和反向引物1492R 扩增反应DNA 序列[21].将产物电泳检测后进行测序分析(上海生工).测序结果在BLAST 和MEGA4.1软件中进行基因库比对分析和以邻位相接法构建系统发育树,初步获得菌株的生物学分类地位. 1.7 菌株生长及降解苯酚特性以不同体积比的接种量(6%、8%、10%、12%、14%)、不同培养温度(15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃)、不同pH 值(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、不同NaCl 浓度(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)在体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中进行单因素试验,在150r/min 的振荡培养箱中培养, 间隔1h 取一次样,测定培养基中生物量和苯酚降解率,确认其最适宜的苯酚降解条件.菌株在不同初始苯酚浓度下的降解:根据以上试验确定的最佳接种量、温度、pH 值以及NaCl 浓度接种于不同初始苯酚浓度(200~1400mg/L)的无机盐培养基中,在150r/min 的培养箱中间隔2h 取一次样,测定培养基中的生物量和苯酚含量.以上试验均重复3次.1.8 苯酚降解动力学分析在微生物降解苯酚的过程中,降解底物苯酚既作为微生物的唯一碳源,又因为其毒性会对微生物生长产生抑制作用[22].因此本研究采用Haldane 方程来描述初始苯酚浓度对菌株L5-1生长的影响[23], 如公式(3)所示max phenol2phenolphenol =s iC C K C K µµ++(3)式中: µ为微生物比生长速率, h -1;µmax 为最大比生长速率, h -1;C phenol 为苯酚质量浓度, mg/L ;K s 为半饱和常数, mg/L;K i 为抑制常数, mg/L.并用Origin8.0将实验数据与动力学方程拟合. 2 结果与讨论2.1 苯酚降解菌的筛选与鉴定图1 菌株L5-1的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of strain L5-1×10000图2 菌株L5-1的16S rDNA 序列进化树Fig.2 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of strain L5-12444 中国环境科学 41卷通过多次富集驯化和分离纯化后,本研究得到4株对高浓度苯酚具有较高降解效果且能够良好生长的菌株,其中一株菌株具有良好的苯酚耐受性以及高效的苯酚降解率,将该菌株命名为L5-1,观察其菌落形态和部分生理生化特征,结合16S rDNA鉴定其菌种.经观测,L5-1菌落形态为白色,圆形,不透明,表面粗糙.革兰氏染色呈红色,为革兰氏阳性菌.进行琼脂柱穿刺实验发现其为兼性好氧菌.扫描电镜(10000×)结果如图1所示,可以看出菌体为杆状,表面较为平整,不透明,大小在1.5~2µm左右,且生长状况良好.测定16Sr DNA核酸序列,并将序列在GenBank 数据库中作比对分析,构建了菌株L5-1与其他相近菌株之间的系统发育关系(图2).结果显示菌株L5-1与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus. MH19)相似性为99.6%,根据同源性分析结果,该菌株归属于Bacillus sp.,鉴定结果为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).该菌株的基因序列已提交至NCBI基因库,其注册号为MN784421.2.2接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响图3 不同接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.3 Effect of different inoculation amount on phenoldegradation by Strain L5-1接种量的多少会对菌株降解苯酚产生直接影响,接种量过少会导致菌株更容易受到苯酚的抑制作用,接种量过高则会增加投入成本,会造成菌株之间对碳源的竞争,影响降解效果.如图3所示,接种量为6%菌液时,培养基中菌株在14h内对500mg/L苯酚的降解率为74.4%,菌株降解苯酚的停滞期随着接种量的增高而明显缩短,培养基中苯酚的浓度也在不断降低,接种量为10%、12%时,在14h内培养基中浓度为500mg/L的苯酚均被完全降解,接种量为14%时,在14h内培养基中苯酚降解率为96.8%.说明适当的提高接种量是提升菌株降解苯酚效果的一种有效途径.可以看出接种量超过10%时菌株对苯酚的降解效果提升不明显,接种量过大时反而影响到菌株的降解效果,且会增加经济成本,综合考虑选择10%作为菌株L5-1的最佳接种量.2.3温度对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响温度是影响微生物生长繁殖的重要因素,选择出合适的温度能有效提高微生物酶活性,有助于提升参与苯酚降解的酶促反应速率[23].从图4中可以看出,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚温度为35,℃并在30~35℃之间对500mg/L苯酚在14h的降解率都大于95%(30℃为95.4%,35℃为96.9%),且生长状况良好.该菌株具有典型的嗜中温特点,培养温度在15和45℃时生物量和降解率都达到最低(15℃时降解率19.7%,45℃时降解率24.6%).这可能是因为培养温度过低会使参与酚类降解的微生物酶活性降低,细菌新陈代谢速率变慢,温度过高则容易让微生物酶失去活性[24].OD60图4 温度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响Fig.4 The effect of temperature on the growth of strainL5-1and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.4pH值对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响如图5所示,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚pH值为7.0,14h内对500mg/L苯酚降解率为97%,培养基中pH值低于7.0后,随着pH值的下降菌株对苯酚的降解率逐渐下降,当培养基中pH值为4.05期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2445时,菌株基本不生长.当pH 值超过7.0后,菌株在碱性条件下对苯酚的降解率和生长状况相比酸性条件下有明显提高(pH 值为5.0时31.3%,pH 值为6.0时70.6%,pH 值为8.0时93.4%,pH 值为9.0时61.7%,pH 值为10.0时7.8%).这是因为苯酚在降解过程中会产如己二酸、丙酮酸等有机酸,致使培养基的pH 值逐渐降低,所以中性和偏碱性环境相比酸性环境更有利于菌株降解苯酚[25-26].并且在偏酸和偏碱的条件下,菌株L5-1的生长和苯酚降解效率都明显下降.这可能由于pH 值影响到了微生物的生长和代谢,进而影响到微生物对培养基中营养物质的吸收和苯酚的降解[27].在pH 值为6.0~9.0条件下,菌株L5-1在14h 内对苯酚的降解率都大于60%,表面菌株L5-1对pH 值有良好的耐受范围且该菌株更耐碱性环境.O D600pH 值图5 pH 值对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.5 Effect of pH on the growth of strain L5-1 anddegradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.5 NaCl 对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响在工业废水的排放过程中,除了高浓度含酚污染物之外,通常还含有大量盐分,过高的盐分会抑制菌株的生长且对微生物有一定的毒害作用[28].如图6所示,菌株最适宜NaCl 浓度为1%.当NaCl 浓度在2%~6%范围内时,菌株L5-1和苯酚降解率在68h 内对500mg/L 苯酚降解率都为97%左右,当培养基中NaCl 浓度超过6%时,菌株的生长和苯酚降解随着NaCl 浓度的升高而明显受到抑制.当培养基中NaCl 浓度增加至10%时,菌株L5-1的生长量和苯酚降解率仍达到0.58和62.7%,表明菌株对盐浓度有很好的耐受性.王丽娟等[29]发现Bacillus ZU -R6在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时内降解率仅在50%左右,在8%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时降解率仅在20%左右.黄中子等[30]发现一株Virgibacillu sp.在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 内的去除率达98%.因此,菌株L5-1与现有的菌株相比具有较宽的盐浓度适应范围和较快的降解速率,在处理含盐苯酚废水中有一定的优势.O D600图6 NaCl 浓度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.6 Effect of NaCl concentration on the growth of strainL5-1 and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,68h2.6 菌株生长与苯酚的降解菌株L5-1在最佳降解条件下(10%的接种量、温度为35℃、pH 值为7.0、NaCl 浓度为1%)接种至初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中,其随时间的生长与苯酚降解曲线如图7所示.O D600图7 最佳条件下菌株L5-1的生长及苯酚降解曲线 Fig.7 Growth and phenol degradation curve of strain L5-1under optimal conditions 500mg/L由图7可知,L5-1经历了近4h 的停滞期,在此期2446 中国环境科学 41卷间苯酚浓度下降缓慢,5~9h进入对数生长期,细菌数量增长极其迅速,苯酚含量随着细菌数量的增加而迅速下降,并在接种13h后达到静止期,此时培养基中细菌总数达到最大,其OD600值为0.93.到14h时,对500mg/L苯酚的降解率达到97.1%.2.7初始苯酚浓度对降解率的影响菌株在不同初始苯酚浓度下,苯酚浓度随时间降解效果如图8所示.当初始苯酚浓度为200mg/L时,在6h内苯酚降解率达到89%.46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.71%.随着初始苯酚浓度的提高,菌株的停滞期也相应的增加,菌株降解相同含量的苯酚所需的时间逐渐延长.当初始苯酚浓度为1200mg/L时,66h才将培养基中苯酚浓度降解到32mg/L左右,降解率为97.4%.而当初始苯酚浓度为1400mg/L时,苯酚66h内的降解率仅为29.0%,由此可见,高浓度苯酚对菌株L5-1的生长有强烈的抑制或毒害作用,使得菌株降解苯酚速率变得尤为缓慢.图8 不同初始苯酚浓度对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.8 Degradation of phenol by strain L5-1 at different initialconcentrations of phenol2.8菌株L5-1对苯酚的降解动力学研究将微生物比生长速率和苯酚初始质量浓度通过非线性最小二乘法按照方程拟合(图9),方程动力学参数为:µmax=0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i为322.83mg/L,降解苯酚最适浓度为183.78mg/L.实验数据与模型拟合吻合良好,相关系数R2为0.997.结果表明,苯酚是一种抑制底物,初始苯酚浓度低于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率与初始苯酚浓度成正比关系,这是因为培养基中降解菌缺乏足够的碳源供其生长,此时培养基中底物的浓度对菌株的生长速率起主导作用.初始苯酚浓度高于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率成负相关,此时初始苯酚浓度的升高使其对菌株抑制作用逐渐增强.表1中为目前已报道的几种微生物苯酚降解动力学参数,其中µmax表示最大比生长速率,K s饱和常数大小表示菌株对苯酚的亲和性,K s越小表示菌株对苯酚的亲和性越大,菌株的比生长速率也就更快, K i抑制常数则表示苯酚对菌株的抑制强度和毒害大小,K i值越大,苯酚对菌株的抑制和毒害作用也就越小,菌株耐受苯酚程度就越大[22].由表可以看出,菌株L5-1比较于其它苯酚降解菌的最大比生长速率和饱和常数相差不大,属于一般水平,其抑制常数大于Ochrobactrum sp.CH10[13]、波茨坦短芽孢杆菌[22]和Trichosporo n.sp[31]等其它苯酚降解菌,说明菌株L5-1具有良好的苯酚耐受能力.表1不同微生物的苯酚降解动力学Haldhance方程参数Table 1 Haldhance equation parameters of phenol degradation kinetics of different microorganisms菌种µmax(h-1) K s(mg/L) K i(mg/L)R2 Bacillus sp.L5-1(本文) 0.355 104.27 322.83 0.997 Ochrobactrum sp. CH10[13]0.441 77.77 110.6 0.973 Brevibacillus borstelensis[22]0.334 14.07 196.89 0.992 Halomonas sp. H17[23] 0.31 191.63 683.050.997Trichosporon.sp[31] 0.667 51.14 271.70.997Alcaligenes faecalis[32] 0.150 22.20 245.40 0.987图9 菌株L5-1苯酚降解动力学Fig.9 Kinetics of degradation of phenol by strain L5-13结论3.1从污水处理厂活性污泥中分离出一株苯酚降5期刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2447解菌.鉴定分析为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为L5-1.该菌株对苯酚具有高效的降解能力.其中最佳降解条件是接种量为10%,生长温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%.3.2菌株降解不同初始浓度苯酚动力学与Haldance模型吻合良好,经拟合其生长参数为µmax= 0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i=322.83mg/L.相关性系数(R2)为0.997.3.3该菌株相比于其他Bacillus cereus降酚菌株具有较宽的环境适应范围和更高的降解效率,14h对500mg/L苯酚的降解率达到97.71%,46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.7%.因此,该菌株在含酚废水的生物降解领域有极大的应用潜力.参考文献：[1] Mao Z, Yu C, Xin L. Enhancement of phenol biodegradation byPseudochrobactrum sp. through ultraviolet-induced mutation [J].International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):7320-7333. [2] Massalha N, Shaviv A, Sabbah I. 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微生物降解苯酚污染的研究进展
许雅洁，张怡洋，刘阳，等.微生物降解苯酚污染的研究进展［J ］.中南农业科技，2023，44（5）：233-241．苯酚是一种具有强毒性且难去除的工业污染物，是从工业过程中排放出来的，如纺织加工、煤气化、炼油、皮革制造、树脂合成、香水生产等［1-5］。
苯酚具有毒性、致突变性和致癌性，对环境有严重的破坏作用［6］。
由于大规模的工业应用，苯酚不可避免地被引入水或土壤环境，造成水体和土壤污染，由于其毒性大，即使在低浓度下也可能构成严重的生态危害。
苯酚及酚类化合物对水体的污染主要以焦化废水为主（焦化废水是指化工类企业在工业加工过程中产生的高毒性、高污染废水），其主要来源于生产煤和汽油的企业，以及加工液化气、运输制冷等过程。
同时化工厂附近的土壤也会受到一定程度的污染，进而污染农作物及其制作的食品，最终危害人类健康。
苯酚不仅在环境中具有明显的累积效应，而且容易与其他有机化合物共存形成新的复合污染物，或在水中发生取代或其他化学反应转化为比苯酚毒性更高的酚类化合物，如氯酚、甲基酚和烷基酚等，而且在生物体内难以分解。
酚类化合物的毒性随结构和官能团的不同而变化，这些物质的顽固性和持久性更大，增加了对苯酚污染治理的难度，间接增加了对人体的危害程度［7，8］。
苯酚作为重要的有机化工原料和工业商品，生产的相关下游产品涉及人们生活的很多方面，如可生产作为汽车外壳涂料的双酚A 以及生产为水杨酸［7］。
此外，苯酚还可用作溶剂、试验试剂和消毒剂等，如作为具有杀菌特性的乳膏和剃须皂，或被用作内部防腐剂和胃麻醉剂。
因此，苯酚在染料、制药、化肥、塑料、玻璃纤维、食品工业和石化等各种行业都有应用［9，10］。
2019年，全球苯酚需求量约为1200万t ，预计未来需求量还会增加。
随着中国经济的飞速发展，国内产业对苯酚的需求也在不断上升，2016—2021年中国苯酚消费量呈稳步增长态势，2021年中国苯酚表观消费量为367.3万t ，依据往年增长速率预计2023年中国苯酚表观消费量将达到400万t 以上［11，12］。
发酵简答题
1. 简述菌种保藏的基本原理和方法？2. 酶解法制备淀粉水解糖的优点和缺点有哪些？3. 简述发酵过程的组成部分？4. 简述发酵工业对微生物菌种的要求七、回答题（本大题共2小题，第一小题7分，第二小题6分，共13分）1．分析发酵时泡沫产生的原因、泡沫对发酵的影响，并说明常见除去泡沫的方法。
2．分析发酵工业中杂菌污染的危害、原因和预防措施五、1．菌种保藏的原理是将菌种在低营养水平、缺氧状态，干燥和低温等条件下贮藏，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力，从而减少其变异。
方法有斜面低温保藏法、蒸馏水保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮保藏法等。
2．以酶为催化剂，在常温常压下将淀粉水解为葡萄糖的方法。
优点：反应条件温和；副反应少；可在较高淀粉浓度下水解，对原料要求不高；糖液的质量高、营养物质较丰富。
缺点：水解时间长，酶制备较复杂，设备较多。
3．菌种的培养基原料来源广、廉价；培养条件易控制；发酵周期短；菌株高产；菌种抗性强，如抗病毒（噬菌体）能力强；菌株性状稳定，不易变异退化；菌种安全性高，不产生有害物质。
4．危害有：杂菌产生的一些物质会影响产量或产品质量、消耗大量的营养物质而影响生产菌的正常生长，杂菌产生的一些物质可以抑制生产菌的生长，杂菌会寄生于生产菌体内，杀死生产菌。
评分标准：根据答案要点及书写情况酌情给分。
六、原因：①机械泡沫。
②发酵泡沫。
影响：减少发酵的有效容积、增加了染菌的机会；泡沫严重时，影响通气搅拌的正常进行，影响生产率。
消泡方法：化学消泡和机械消泡。
评分标准：根据答案要点及书写情况酌情给分。
五、论述绘图题1、列举膜分离技术并作相应说明。
2. 绘图并说明氧从气相传递到液相的菌体中需要克服的几种阻力。
第页共9 页 3. 噬菌体的特点、感染过程危害程度及治理措施。
39．发醇过程中异常现象（发酵液转稀、发酵液过浓、耗糖缓慢、pH不正常）处理措施？40．Monod(莫诺)方程表明了什么和什么的重要关系？简介Monod(莫诺)方程？41．补料分批发酵技术的特点, 与分批发酵，连续发酵的区别？42 通风发酵设备中的机械搅拌发酵罐必须满足的基本条件？六、论述题：（每小题10分，本大题共20分）43．如何提高高产菌的稳定性？44．发酵过程中溶解氧的控制措施？（从供氧和需氧量方面考虑）39．发酵液pH对发酵的影响包括哪些方面？40．比底物消耗速率方程？41．补料分批发酵的适用范围？42．优良的发酵装置应具有的基本特征包括哪些内容？六、论述题：（每小题10分，本大题共20分）43．试述对微生物反应器设计的基本要求？44．大规模微生物发酵工程生产, 选择菌种应遵循的原则是什么？（微生物发酵工程对微生物菌种的要求主要包括哪些内容）三、简答题（6题，每题4分，共24分）4、简述种子制备过程中种子级数对发酵过程的影响？答：过多会增加发酵操作环节，造成衰退菌体细胞过多，发酵过程控制难度增大。
苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究
上海师范大学硕士学位论文苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究姓名：何小丽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：肖明20090501上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究学校专业：微生物学学位申请人：何小丽指导教师：肖明摘要酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。
这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。
从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。
1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。
该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。
其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。
其它7株降酚菌株P2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。
这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。
2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。
于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。
3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。
山东省师大附中2025届生物高三上期末质量检测试题含解析
山东省师大附中2025届生物高三上期末质量检测试题请考生注意：1．请用2B铅笔将选择题答案涂填在答题纸相应位置上，请用0．5毫米及以上黑色字迹的钢笔或签字笔将主观题的答案写在答题纸相应的答题区内。
写在试题卷、草稿纸上均无效。
2．答题前，认真阅读答题纸上的《注意事项》，按规定答题。
一、选择题：（共6小题，每小题6分，共36分。
每小题只有一个选项符合题目要求）1．研究发现，某种水稻害虫的基因X发生突变后产生了抗药性，则下列叙述正确的是（）A．基因突变一定导致基因碱基排列顺序发生改变B．基因X的突变导致嘌呤数与嘧啶数的比值发生了改变C．基因X的突变为害虫的进化提供了方向D．农药的使用使基因X产生了抗药性变异2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得只能利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。
下列相关叙述错误的是（）A．图示②中不同浓度碳源的培养基不会影响细菌的数量B．图示②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源C．若图中④为对照实验，则其中不应加入苯酚作为碳源D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落3．糖元沉积病贮积病是由于遗传性糖代谢障碍，致使糖元在组织内过多沉积而引起的疾病，临床表现为低血糖等症状。
下图为人体糖代谢的部分途径。
糖元沉积病Ⅰ型是6-磷酸葡萄糖酶基因（E）突变所致。
据图分析，下列说法正确的是A．抑制葡萄糖激酶会制约糖元的合成，并未制约体内的细胞呼吸B．以葡萄糖为底物，细胞呼吸过程会合成ATP,不需要ATP供能C．血糖浓度低时，正常人体分泌胰岛素增加，使血糖浓度恢复到正常水平D．给糖元沉积病Ⅰ型患者注射胰高血糖素不能使血糖浓度恢复到正常水平4．2019年诺贝尔生理学或医学奖揭示了人体细胞适应氧气变化的分子机制，在缺氧条件下，缺氧诱导因子（HIF）会增加，激活相关基因表达促进红细胞生成，下列说法正确的是（）A．缺氧条件下，红细胞进行无丝分裂增加红细胞数量B．氧气含量低时，HIF可能会被保护而不会被降解C．若细胞中的HIF被抑制可便该细胞中氧气含量增加D．在红细胞的细胞核内可完成相关基因的表达过程5．在植物的抗冷胁迫过程中，脱落酸（ABA起到关键的作用。
除草剂2.4-D 降解菌株的分离、筛选与鉴定
摘 要: ２ꎬ４￣二氯苯氧乙酸( ２ꎬ４￣ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄꎬ２ꎬ４￣Ｄ) 是一类广泛应用于单子叶作物田间杂草防除的除草
剂ꎬ但其大量施用导致的环境残留已对生态环境造成严重威胁ꎮ 通过富集培养的方法ꎬ从 ２ꎬ４￣Ｄ 污染土壤样品中筛选分
Ｉｓｏｌａｔｉｎｇꎬ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ２ꎬ４￣Ｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ
ＬＩ Ｘｕｙａｎｇꎬ ＨＵＡＮＧ Ｌｉｌｉｎｇꎬ ＧＵＯ Ｑｉａｎｎａｎꎬ ＧＡＯ Ｒｕｙｕꎬ ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉꎬ ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇꎬ ＬＵ Ｗｅｉꎬ
ＺＨＯＵ Ｚｈｅｎｇｆｕ ∗
Ａｒｔｉｃｌｅｓ
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＳＳＮ ２０９５￣２３４１
研究论文
生物技术进展 ２０１９ 年 第 ９ 卷 第 ４ 期 ３８４ ~３９５
除草剂 ２ꎬ４￣Ｄ 降解菌株的分离、筛选与鉴定
栗旭阳ꎬ 黄丽玲ꎬ 郭倩楠ꎬ 高如雨ꎬ 张 维ꎬ 陈 明ꎬ 陆 伟ꎬ 周正富 ∗
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ) ꎬ ｔｈｅ ＬＣ / ＭＳ ａｎｄ ＬＣ￣ＱＴＯＦ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｔｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ
ｈｉｇｈｌｙ ２ꎬ４￣Ｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ. Ｔｈｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ Ｌ１ꎬ Ｌ２ꎬ Ｌ４ ａｎｄ Ｌ６ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ７２ ｈ ｗａｓ １７.３％ꎬ ２８.０７％ꎬ ３８.９７％ ａｎｄ
菌属( Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ) 等ꎮ 其主要由 α￣酮戊二酸 ( α￣
苯酚降解菌的分离和鉴定
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究摘要从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌，初步确定为假单胞菌属（Pseudomonas）；该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长；可以在20～40℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长；降解苯酚最适温度为35℃，最适pH 值为7.0，最大降解率达到89％。
完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h。
关键词苯酚；生物降解；假单胞菌属苯酚是树脂制造、炼油、焦碳、染料、纺织、农药和医药生产等工业废水中的主要污染物[1-2]，在水体中，5～25mg/L的苯酚即可对鱼类的生存构成威胁[3]。
被美国环保署列入优先控制污染物和65种有毒污染物名单，也是我国优先控制污染物之一[4]。
因此，含酚工业废水的治理在环保中具有重大的意义。
除了传统的理化方法外，用微生物降解苯酚的方法对环境无害且成本低廉，因而在苯酚污染治理中起了越来越重要的作用[5]。
但是，目前生物处理技术只限于处理低浓度的含酚废水，而高浓度含酚废水具有污染物浓度高、可生化性差等特点，制约了这一技术在实际中的应用。
本实验从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌，并对其降解特性进行了研究。
1 材料与方法1.1 培养基无机盐培养液[7]（g/L）：(NH4NO3 1.0，CaCl2 0.1，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 1.0，定容到1 000 mL，pH值7.0～7.2，固体培养基中加入1.5％～1.8％的琼脂，按实际需要加入相应浓度的苯酚。
1.2 高效降解细菌的筛选和驯化从某农药厂废水处理活性污泥中采集污泥样品，称取5.0g污泥置于预先灭菌的100mL苯酚浓度为500mg/L的无机盐培养液中，30℃、150r/min振荡培养，到培养液浑浊后，按1％接种量转接到苯酚浓度为1 000 mg/L的无机盐培养液中，继续振荡培养。
高效苯酚降解菌的分离与降解特性
基金项 目：佳木斯大学学 生创新课题 （课题编号 ：Ｄｚ２０１１—０２１） ＊为通讯作者
· ２５· ２０１１年 ８月
农 业 与 技 术
Ｖｏ１．３１ Ｎｏ．４
荫 种 的甯 集 与驯 化 采用 一 次性 加入 大 剂昂 化 号 】、２、３、４、５、６、７。
合 物 的方法 ［８］。将菌 种在 无菌条 件 下接 种到 ２０ｍＬ
３．１ 结 果
大面积 农 作 物种 植 区 ，利 用 松 花 江 水 进 行 灌 溉 ，
３．１．１ 筛选 出 ７株降解能力强的菌株对苯酚都有 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 一 定 的点适应 性 ，且对苯 酚有很强的降解能力 ， 作用 ，同时人们适用后有毒物质 在人体 内富集 ，
达 ２５％，血酚浓度为 ０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ，１０分钟死亡。 将浓度 为 ｌ０～，１０～，１０～，１０一，ｌ０一 的土样
酚类会对人类的身心健康造成危害，毒害其他生 溶液接种到富集培养基上 ，培养 ４８ｈ后观察。
物 ，破坏了生态系统 的稳定性 ，故我国及其他国
（２）选 择 培 养基［ ］：ＫＮｏ３４．０ｇ，ＮａＣ１ ５．０ｇ，
ｓｏｒｂｅｎｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ８Ｏｌ￣ Ｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏｗａｎｔｓ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ［Ｊ］．ＲＰ￣ｌｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ，２００１，４６ （３）：
２５９—２７１
高 浓度 含 酚污 水 的研 究 仍 有 深 度 可挖 ，因此 必 须 ［８］任源 ，吴超 飞，等 ．苯胺分离菌 的驯化筛选研究 ［Ｊ］．环 境
及不 同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察 ，
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
高中生物 课时跟踪检测(二)分离以尿素为氮源的微生物(含解析)浙科版选修1-浙科版高中选修1生物试题
课时跟踪检测（二）分离以尿素为氮源的微生物1．从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示：(1)图中物质A为________________，若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目，宜采用________________法接种到尿素培养基上，对照组配制的培养基为____________培养基，若用同浓度的土壤稀释液接种，实验组培养皿中菌落数____________(填“大于”“等于”或“小于”)对照组。
在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是_______________________________________________。
(2)下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是( )A．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水B．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素C．NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素D．葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物(3)欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养，应使用________培养基。
答案：(1)无菌水涂布分离LB全营养小于能利用尿素的细菌产生的脲酶，将培养基中的尿素分解，产生的氨使指示剂呈红色(2)B (3)LB液体2．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。
请回答下列问题：(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入______作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用____________________法。
(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于__________________________________；使用________________________________法可以在⑥上获得单菌落。
2022-2023学年人教版(2019)选择性必修三第1章 发酵工程 单元测试卷(含答案)
第1章发酵工程单元测试卷学校：___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、单选题(共50分)1、下列是关于测定土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是( )A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经湿热灭菌后倒平板B.取1×104、1×105、1×106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24~48hD.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数2、金黄色葡萄球菌（SAU）是细菌性肺炎的病原体之一。
细菌性肺炎一般需要注射或口服抗生素进行治疗，当细菌出现耐药性时疗效下降。
A、B、C、D四种抗生素均可治疗SAU引起的肺炎。
为选出最佳疗效的抗生素，研究者分别将含等剂量抗生素A、B、C、D的四张大小相同的滤纸片a、b、c、d置于SAU均匀分布的平板培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图。
下列相关叙述错误的是( )A.A、B、C、D四种抗生素，抑菌效果最佳的是抗生素AB.配制培养基时应将培养基的pH调至中性或弱碱性C.对培养基可以采用干热灭菌的方法灭菌D.滤纸片b周围透明圈中出现一菌落，可能是该菌落发生了基因突变3、苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。
某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得只能利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如下图所示，①为土壤样品。
下列相关叙述错误的是( )A.图示②中不同浓度碳源的培养基不会影响细菌的数量B.图示②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源C.若图中④为对照实验，则其中不应加入苯酚作为碳源D.使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落4、下列关于微生物的培养与分离纯化操作，叙述正确的是( )A.接种好的平板需要进行倒置培养B.在超净台倒平板时不需要在酒精灯火焰旁接种C.培养基需经过消毒后使用D.平板划线法接种时最后一次划线要与第一次划线相连5、稀释涂布平板法对微生物进行计数时的错误操作是( )A.将1mL样品稀释10倍,需加入10mL无菌水B.吸取菌液的移液管需要干热灭菌避免杂菌污染C.将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃D.稀释涂布平板法既能分离纯化微生物,又能计数6、图甲是果酒和果醋发酵的装置图，图乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化。
一株降解苯酚微生物的分离与鉴定
一株降解苯酚微生物的分离与鉴定摘要：从武汉市某化工厂的活性污泥中分离1株能以苯酚为惟一碳源和能源生长的菌株，命名为CY1。
通过逐级驯化，CY1可在含1 000 mg·L-1苯酚的培养基中降解苯酚并生长。
经对该菌株进行形态特征以及16S rDNA序列比对分析，确认该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。
关键词：苯酚；降解；假单孢菌属Isolation and Identification of A Phenol-degrading BacteriumAbstract：A strain CY1 was isolated from the sludge around a chemical plant in Wuhan，Hubei Province. It had ability of utilizing phenol as sole carbon and energy sources. By using step-by-step domesticating method，it could grow in the culture medium byusing 1 000 mg·L-1 phenol as sole carbon source. CY1 was considered to be belonged to Pseudomonas by morphological characteristics and the phylogenetical analysis of the 16S rDNA sequence.Key words：phenol；degradation；Pseudomonas苯酚及其衍生物广泛应用于制药、农药、冶金、塑料等行业，它在环境中能与水中的氯作用生成毒性更大的氯代酚，对人类健康和动植物生长造成的危害不容忽视[1]。
近年来，苯酚降解微生物的研究倍受关注，已鉴定和发现了多种具有苯酚降解能力的菌株，比如根瘤菌(Rhizobia)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、假单胞菌(Pseudo-monas sp.)、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)、酵母菌(Yeasttri-chosporon cutaneum)、反硝化菌等[2]。
一株苯酚降解菌的分离与鉴定
一株苯酚降解菌的分离与鉴定
一株苯酚降解菌的分离与鉴定
目的:筛选能高效降解苯酚的`微生物,并进行初步鉴定.方法:从某焦化厂排水沟采集污泥,通过逐步驯化筛选苯酚降解菌株;利用形态观察、生理生化检测、16S rDNA序列分析进行初步鉴定.结果:筛选获得1株苯酚降解菌JDM-2-1,该菌能够以苯酚为惟一碳源,耐酚能力高达2 200 mg/L,在30℃和pH7.0条件下,42 h内能将800 mg/L的苯酚彻底降解;初步鉴定其为球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus).结论:菌株JDM-2-1是一株高效降解苯酚的球形芽孢杆菌.
作者：王永义彭清忠彭清静陈义光何倩杨冬梅 WANG Yong-yi PENG Qing-zhong PENG Qing-jing CHEN Yi-guang HE Qian YANG Dong-mei 作者单位：吉首大学,生物资源与环境科学学院,湖南,吉首,416000 刊名：生物技术通讯 ISTIC 英文刊名： LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 2007 18(6) 分类号： Q93-331 关键词：苯酚降解 16SrDNA 球形芽孢杆菌。
实验一 苯酚降解菌的分离及降解性测定
实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。
从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。
本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。
实验步骤：1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。
2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。
121℃灭菌20 min。
3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160rmp/min）.4. 测定苯酚降解率。
苯酚降解率的测定方法：a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L）于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460nm波长处比色测定。
b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。
d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。
附：无机盐含酚培养基KH2PO40.5gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O 0.2gCaCl2 0.1gNaCl 0.2gNH4NO3 1.0gFeCl210%溶液1滴苯酚100mg/L水1000mL调pH 值7.5，121℃灭菌20min。
2023-2024学年高中生物沪科版(2020)选择性必修3第1章 发酵工程单元测试(含答案解析)
2023-2024学年沪科版（2020）高中生物单元测试学校 __________ 班级 __________ 姓名 __________ 考号 __________注意事项1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息;2．请将答案正确填写在答题卡上;一、选择题（本大题共计13小题每题3分共计39分）1.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质自然界中存在着降解苯酚的微生物某工厂产生的废水中含有苯酚为了降解废水中的苯酚研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株筛选的主要步骤如图所示①为土壤样品下列相关叙述错误的是（）A. 使用平板划线法可以在⑥上获得单个菌落B. 如果要测定②中活细菌数量常采用稀释涂布平板法C. 图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源D. 涂布平板法在③培养皿中长出的菌落数一定等于最初的活菌数【答案】D【解析】解 A.分离单菌落还可以用平板划线法使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落A正确B.测定②中活细菌数量常采用稀释涂布平板法 B正确C.图中②中的选择培养基中应加入苯酚作为碳源以增大降解苯酚细菌的浓度 C正确D.当两个或两个以上的活菌聚集在一起时在培养皿中会形成一个菌落故涂布平板法在③培养皿中长出的菌落数一般少于最初的活菌数 D错误故选 D2.以苹果汁为原料先接种酵母菌发酵96小时后再接种老陈醋的醋醅（含醋酸菌）酿造苹果醋下列分析错误的是（）A. 酵母菌在发酵早期进行有氧呼吸大量繁殖B. 酵母菌在发酵后期进行无氧呼吸产生酒精和 \ CO_2C. 酒精发酵中有机物的能量大部分留在发酵产物中D. 96小时后应通人无菌空气并适当降低发酵温度【答案】D【解析】解 A.果酒的制作过程中酵母菌在发酵早期进行有氧呼吸大量繁殖 A正确B.酿酒过程中酵母菌在发酵后期进行无氧呼吸产生酒精和 CO_2 B正确C.发酵过程中有机物作为呼吸底物释放的能量部分以热能散失部分转化为ATP中活跃的化学能还有大部分留在发酵产物中 C正确D.酒精发酵需要无氧条件温度18~25℃醋酸发酵需要氧气最适温度是30~35℃故由产酒到产醋应通入无菌空气并适当提高发酵温度 D错误故选 D3.泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌而在发酵初期水槽内经常有气泡产生这些气泡产生的原因及成分分别是（）A. 乳酸菌是兼性厌氧型微生物初期进行有氧呼吸产生CO_2 气体为CO_2B. 因腌制过程中盐进入蔬菜使蔬菜体积缩小气体被排出气体为空气C. 发酵初期酵母菌活动强烈其利用氧产生的气体为CO_2D. 乳酸菌在发酵过程中产生了热量使坛内温度升高空气受热膨胀排出气体为空气【答案】C【解析】A、乳酸菌是厌氧型微生物只能进行无氧呼吸产生乳酸 A错误B、腌制过程中蔬菜体积缩小的原因是植物细胞逐渐失水 B错误CD、在发酵初期水槽内经常有气泡产生这些气泡产生的原因是发酵初期酵母菌活动强烈其利用氧产生的气体为CO_2 C正确 D错误4.下列实验过程中操作错误的是（）A. 可用溴麝香草酚蓝水溶液是否变成黄色来检测酵母菌的呼吸类型B. 腐乳制作过程中卤汤含酒量应控制在\ 12%左右C. 葡萄汁装人发酵瓶时葡萄汁占其体积大约\ 2/3D. 配制解离液时盐酸和酒精按等体积比\ 1:1混合均匀【答案】D【解析】略5.益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌市售的益生菌产品质量参差不齐某益生菌品牌宣传其产品活菌数不少于 10^7个 /g 研究小组尝试检测该品牌益生菌中的活菌含量是否与宣传一致实验步骤为制备培养基→调节pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数下列叙述错误的是（）A. 培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢B. 经高压蒸汽灭菌的培养基所倒平板和接种后培养时的平板均需要倒置C. 对该品牌益生菌进行计数时稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大D. 若要检测培养基是否被污染可将未接种的培养基在相同条件下进行培养【答案】C【解析】解 A.培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢 A正确B.经高压蒸汽灭菌的培养基所倒平板和接种后培养时的平板均需要倒置倒置可以避免皿盖上水珠滴落污染培养基 B正确C.对该品牌益生菌进行计数时稀释涂布平板法统计的数目会比实际值偏低因为当两个或多个细胞连在一起时平板上观察到的只是一个菌落 C错误D.若要检测培养基是否被污染可将未接种的培养基在相同条件下进行培养 D正确故选 C6.“中华老字号”即墨老黄酒具有活血驱寒通经活络的作用即墨老黄酒常用谷物做原料经高温糖化（将淀粉分解）后添加酒曲发酵而成下列叙述错误的是（）A. 黄酒酿造时前期进行一段有氧呼吸后期主要进行无氧呼吸B. 高温糖化过程即可以杀灭杂菌又有利于酵母菌对糖类的利用C. 酒曲中含有大量的酵母菌加酒曲过程相当于接种菌种的过程D. 酿酒过程中随发酵时间推进酒精的产生速率逐步上升【答案】D【解析】答案 D【解析】酒精酸造时前期进行有氧呼吸有利于菌种的大量繁殖后期无氧呼吸有利于进行发酵产生酒精 A选项正确糖化过程在高温下可以消灭谷物中的杂菌又可以使淀粉发生分解形成还原糖有利于酵母菌的利用 B选项正确酒曲中的酵母菌相当于酒精发酵的菌种因此加酒曲过程也就是接种菌种的过程 c选项正确酿酒过程中随发酵时间的推进酒精产生的速率是先上升后下降 D选项错误【考点】发酵工程7.在利用葡萄自然发酵产生果酒的过程中未经杀菌但其他杂菌不能生长的原因是（）A. 经冲洗后的葡萄上只有野生型酵母菌无其他杂菌B. 在缺氧和呈酸性的发酵液中酵母菌能大量繁殖其他杂菌不适应环境而被抑制C. 其他杂菌不能利用葡萄汁中的糖作碳源D. 酵母菌发酵产生大量酒精杀死了其他杂菌【答案】B【解析】解 A.冲洗的目的是洗去浮尘在冲洗过程中杂菌和酵母菌被洗掉的机会是均等的 A错误B.在缺氧和呈酸性的发酵液中酵母菌能大量繁殖其他杂菌不适应环境而被抑制 B正确C.异养微生物都能利用糖 C错误D.酵母菌发酵产生大量酒精杀死了其他杂菌但同时也会抑制自身的生长 D错误故选 B8.下表所列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（）A. ①③B. ③①C. ②④D. ①②【答案】B【解析】解 (1)选择性培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求而设计的培养基允许特定种类的微生物生长同时又能抑制或者阻止其他种类微生物生长利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来所以③中加入青霉素的培养基属于选择培养基．(2)伊红-美蓝培养基常用来鉴别大肠杆菌其原理是大肠杆菌能分解乳糖产生大量的混合酸菌体带H^+ 故菌落被染成深紫色从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽所以①中加入伊红-美蓝的培养基属于鉴别培养基．故选 B．9.为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏下列叙述错误的是（）A. 对于频繁使用的菌种可以采用临时保藏的方法B. 长期保藏菌种时可各取1mL灭菌甘油和培养菌液混合后保存C. 对于需要长期保存的菌种可以采用低温-4℃保藏的方法D. 临时保藏菌种容易被污染或产生变异【答案】C【解析】解 A.对于频繁使用的菌种可以采用临时保藏的方法 A正确B.长期保藏菌种时可采用甘油管藏法即各取1mL灭菌甘油和培养菌液混合后保存 B正确C.对于需要长期保存的菌种可以采用-20℃冷冻箱保存 C错误D.临时保藏菌种容易被污染或产生变异 D正确故选 C10.《齐民要术》记载了一种称为“动酒酢（“酢”同“醋”）法”的酿醋工艺“大率酒一斗用水三斗合瓮盛置日中曝之七日后当臭衣（指菌膜）生勿得怪也但停置勿移动挠搅之数十日醋成” 下列有关叙述错误的是（）A. 该方法的原理是醋酸菌在缺少糖源时可将酒精转化为醋酸B. 加水的目的是对酒进行稀释避免酒精浓度过高杀死醋酸菌C. “衣”位于变酸的酒表面是由原酒中的酵母菌大量繁殖形成的D. 挠搅有利于酒精与醋酸菌充分接触还可以增加溶液中的溶解氧【答案】C【解析】解 A.该方法的原理是醋酸菌在缺少糖源时可将酒精转化为醋酸 A正确B.加水的目的是对酒进行稀释避免酒精浓度过高杀死醋酸菌 B正确C.“衣”是醋酸菌大量繁殖形成的 C错误D.挠搅不仅让醋酸菌与酒精充分混合还可以增加溶液中的溶解氧 D正确故选 C11.泡菜是我国的传统食品之一但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害某兴趣小组准备参加“科技创新大赛” 查阅资料得到下图下列相关叙述正确的是（）A. 亚硝酸盐在人体摄入后都会转变成具有致癌作用的亚硝胺B. 泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量上升是乳酸菌大量繁殖导致C. 图示表明pH下降是因为乳酸菌数量下降导致乳酸产生量减少D. 据上图曲线分析第8天后的泡菜比第3天后的更适于食用【答案】D【解析】解 A.亚硝酸盐在人体摄入后大部分随尿排出只有在特定条件下一部分亚硝酸盐才会转变成具有致癌作用的亚硝胺 A错误B.泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量上升是生成亚硝酸盐的微生物大量繁殖导致 B错误C.图示表明pH下降是因为乳酸积累导致 C错误D.据上图曲线分析第8天后的泡菜中亚硝酸盐的含量比第3天低故第8天后的泡菜比第3天后的更适于食用 D正确故选 D12.根据实验室守则下列做法错误的是()A. 用试管加热任何东西时试管口不能朝向任何人B. 微生物实验必须严格进行无菌操作C. 若有细菌培养物泼洒出来应迅速擦拭D. 用过的培养物都必须经过高压灭菌后再作处理【答案】C【解析】13.嗜热菌又称高温细菌是一类生活在火山口及其周围区域、温泉、工厂高温废水排放区等高温环境中的微生物研究者从温泉中筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌其筛选过程如图1所示将得到的菌悬液转接于同时含有葡萄糖和淀粉作碳源的固体培养基上培养得到若干菌落后用碘液作显色处理结果如图2所示下列说法错误的是（）A. 过程①是对菌液进行稀释过程②的接种方法是稀释涂布平板法B. 图2中周围显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌C. 丙中噬热菌数量迅速增加培养过程中需保证充足的营养和高温条件D. Ⅰ号培养基属于选择培养基淀粉为作为唯一碳源【答案】B【解析】解 A.过程①是对菌液进行稀释过程②的接种方法是稀释涂布平板法以获得单菌落 A正确B.图2中周围不显蓝色的菌落说明其产生的淀粉酶可以在高温下分解淀粉所以周围不显蓝色的菌落含有所需的嗜热菌 B错误C.丙为富集培养丙中噬热菌数量迅速增加培养过程中需保证充足的营养和高温条件 C 正确D.为筛选高效产生高温淀粉酶的嗜热菌Ⅰ号培养基应以淀粉为作为唯一碳源属于选择培养基 D正确故选 B二、多选题（本大题共计4小题每题3分共计12分）14.高通量筛选是获得高性能微生物菌种的重要途径其生产流程简图如下下列说法错误的是（）A. 对出发菌株的选育也可以借助于基因工程等技术实现B. 将配置好的培养基倒人锥形瓶中宜采用干热灭菌法进行灭菌C. 图中的单菌落一定是微生物繁殖形成的纯培养物D. 多孔板上要对菌体进行单克隆的识别和挑选、微生物及其代谢物的分析和检测【答案】B, C【解析】解 A.对出发菌株的选育可以借助于基因工程等技术实现 A正确B.将配置好的培养基倒人锥形瓶中宜采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌 B错误C.涂平板时可能不同种的细菌会重合在一起形成的单菌落不属于纯培养物 C错误D.多孔板上要对菌体进行单克隆的识别和挑选、微生物及其代谢物的分析和检测 D正确故选 BC15.屠宰场废弃血污不经过处理直接排放会对环境造成污染传统的处理方法有填埋法和焚烧法等填埋法易造成地表环境、地下水资源污染焚烧法处理也会造成大气污染且废弃物中所含的蛋白资源不能得到有效利用研究人员以屠宰场血污堆积土壤为分离基质利用血平板培养基（添加了动物血液）分离出了高效降血红蛋白的菌株并初步用于降解废弃血液、生产氨基酸液态肥料下列叙述正确的是（）A. 上述菌株分离纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法B. 对分离纯化得到的菌株培养后进行计数只能采用稀释涂布平板法C. 血平板培养基上透明水解圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高D. 利用该菌株降解废弃血液可在保护环境的同时实现资源的可持续利用【答案】A, C, D【解析】解 A.分析题图可知上述菌株分离纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法 A正确B.对分离纯化得到的菌株培养后进行计数可以采用稀释涂布平板法和显微计数法等 B错误C.血平板培养基上透明水解圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高 C正确D.废弃血液被菌种降解可以制作化肥实现资源的可持续利用 D正确故选 ACD16.蓝莓富含花青素对人体有增强视力、消除眼睛疲劳、消脂减肥、解酒护肝等功效利用蓝莓可生产蓝莓果汁、蓝莓酒、蓝莓醋、蓝莓果酱等下列叙述不正确的是（）A. 蓝莓酒发酵过程中应严格控制无氧条件以保证酵母菌只进行无氧呼吸B. 发酵产生的果醋和泡菜都呈酸味但形成酸味的物质不同C. 制作蓝莓酒和蓝莓醋时所需控制的最适温度不同D. 在制作蓝莓醋时高压蒸汽灭菌后的果酒需冷却后才能接种醋酸菌【答案】A, D【解析】A、酵母菌前期需要进行有氧呼吸进行繁殖之后再进行无氧呼吸酒精发酵 A错误B、发酵产生的果醋酸味是醋酸泡菜形成酸味是乳酸 B正确C、酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃ C正确D、果酒制成后在发酵液中加入醋酸菌接着进行醋酸发酵温度应控制在30﹣35℃ D错误17.硝化细菌可将氨或铵盐氧化为易被植物吸收的硝酸盐释放的能量可用于将二氧化碳和水转化成有机物下图为从土壤中分离硝化细菌菌株的过程示意图有关说法正确的是（）A. Ⅰ号培养基在功能上属于选择培养基B. 制作该固体培养基时应先灭菌再调pHC. 要筛选硝化细菌Ⅰ号培养基的成分应不含C源、N源D. 接种后的Ⅱ号培养基在恒温箱中通常需要倒置培养【答案】A, D【解析】解 A.Ⅰ号培养基在功能上属于选择培养基可通过选择培养基增加硝化细菌的浓度 A正确B.为了防止杂菌污染配置培养基时应该先调节pH 然后灭菌 B错误C.硝化细菌可将氨或铵盐氧化为易被植物吸收的硝酸盐所以要筛选硝化细菌Ⅰ号培养基中应含N源使硝化细菌利用氧化N盐获得化学能合成有机物 C错误D.接种后的Ⅱ号培养基在恒温箱中通常需要倒置培养平板倒置的目的是防止皿盖上的水珠落入培养基对其造成污染而且可以使培养基表面的水分更好的挥发 D正确故选 AD三、解答题（本大题共计5小题每题10分共计50分）18.（1）从包装中取样准确称取10g（近似10mL）样品剪碎后加入到90mL灭菌生理盐水中充分混匀得到一个生理盐水样液待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数取4个培养基进行________灭菌处理待冷却后采用________法分别接种0．1mL样液放入恒温培养箱中培养一段时间后平板上长出的菌落数分别为31、42、36和35 那么1g口罩样品中细菌数量为________ 根据《中华人民共和国医药行业标准》对非灭菌一次性口罩的微生物指标要求（如表）该研究小组检测的口罩________（填“是”或“否”合格）18.（2）为确定检测样液中大肠杆菌数目需在培养基中加入________用于鉴别统计培养基上________（颜色）菌落的数目18.（3）若要对口罩中的金黄色葡萄球菌进行检测将样液接种到甘露醇高盐琼脂培养基上培养此培养基属于________培养基培养一段时间后该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀一部分进行静置培养另一部分进行振荡培养结果发现振荡培养的细菌比静止培养的细菌生长速度快分析其原因________【答案】（1）高压蒸汽 , 稀释涂布平板 , 3600 , 否【解析】解（1）对培养基进行灭菌应该采用高压蒸汽灭菌法计数活菌数目时采用的接种方法是稀释涂布平板法为了结果准确计数时应选取菌落数在30~300内的平板那么1g口罩样品中细菌数量为 (31+42+36+35)÷4÷0.1×10=3600 根据表格中信息合格口罩不得检测出细菌和真菌可知该研究小组检测的口罩不合格【答案】（2）伊红美蓝 , 黑色【解析】（2）为确定检测样液中大肠杆菌数目需在培养基中加入伊红美蓝用于鉴别统计培养基上（紫）黑色菌落的数目【答案】（3）选择 , 振荡培养能提高培养液中溶解氧的含量同时可以使菌体与培养液充分接触提高营养物质的利用率【解析】（3）若要对口罩中的金黄色葡萄球菌进行检测将样液接种到甘露醇高盐琼脂培养基上培养在该培养基上只有金黄色葡萄球菌可以生存因此该培养基属于选择培养基培养一段时间后该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀一部分进行静置培养另一部分进行振荡培养结果发现振荡培养的细菌比静止培养的细菌生长速度快原因是振荡培养能提高培养液中溶解氧的含量同时可以使菌体与培养液充分接触提高营养物质的利用率19.（1）若要初步确定某一菌种是否为红酵母菌将菌种接种于固体培养基上并在适宜的条件下培养一段时间观察其形成菌落的________（填2个）等特征19.（2）营养物质的种类对β-胡萝卜素的产量有着一定的影响下表是有关碳源的研究结果据表可知上述三种碳源中最佳碳源是蔗糖若要进一步从多种不同氮源中探究最佳氮源（种类不做要求）请简要写出实验设计思路 ________19.（3）在发酵产生β-胡萝卜素的过程中应将红酵母接种在________（物理性质）培养基上选择该种培养基进行发酵的优点是 ________19.（4）若要对培养一段时间后的红酵母进行计数可以选用菌落计数法也可以用显微计数法在所有操作都正确的情况下前者数值偏低原因是 ________ 为了缩小两种方法之间的差异后者在计数时可以采取什么措施？________19.（5）对发酵所得菌株经裂解、离心后根据β-胡萝卜素________的特点可以采用有机溶剂萃取法萃取产物并对萃取产物通过________法进行鉴定有科研人员尝试利用紫外线处理红酵母以获得高产菌株经定量分析后若得到高产菌株要对其进行长期保存可采用________的方法在-20℃的冷冻箱中保存【答案】（1）形状、大小、隆起程度、颜色【解析】解（1）微生物纯化的两种方法中平板划线法操作相对简单即通过平板划线法将菌种接种于固体培养基上并在适宜的条件下培养一段时间观察其形成的菌落的特征菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等【答案】（2）在用蔗糖作为碳源的前提下配置多种不同的氮源培养基分别培养红酵母一段时间后比较不同培养基培养的红酵母中β-胡萝卜素的含量【解析】（2）因为三种碳源中最佳碳源是蔗糖故在用蔗糖作为碳源的前提下配置多种不同的氮源培养基分别培养红酵母一段时间后比较不同培养基培养的红酵母中β-胡萝卜素的含量以选择最佳氮源【答案】（3）液体, 有利于微生物细胞与营养物质的充分接触和吸收有利于微生物的生长提高生产量理化条件易于控制【解析】（3）在发酵产生β-胡萝卜素的过程中应将红酵母接种在液体培养基上选择该种培养基进行发酵的优点是有利于微生物细胞与营养物质的充分接触和吸收有利于微生物的生长提高生产量理化条件易于控制【答案】（4）当两个或多个细胞连在一起时平板上只能看到一个菌落, 用台盼蓝染色（染色法）区分活菌和死菌（用一定的方法区分活菌和死菌）【解析】（4）若要对培养一段时间后的红酵母进行计数可以选用菌落计数法也可以用显微计数法在所有操作都正确的情况下前者数值偏低原因是当两个或多个细胞连在一起时平板上只能看到一个菌落为了缩小两种方法之间的差异在用显微计数时可用台盼蓝染色（染色法）区分活菌和死菌（用一定的方法区分活菌和死菌）【答案】（5）易溶于有机溶剂, 纸层析, 甘油管藏【解析】（5）对发酵所得菌株经裂解、离心后根据β-胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点可以采用有机溶剂萃取法萃取产物并对萃取产物通过纸层析法进行鉴定有科研人员尝试利用紫外线处理红酵母以获得高产菌株经定量分析后若得到高产菌株要对其进行长期保存可采用甘油管藏的方法在-20℃的冷冻箱中保存20.（1）图甲②中培养目的菌株的选择培养基中应以________为唯一碳源从功能上讲该培养基属于________（填“选择”或“鉴别”）培养基若要测定②中活细菌数量采用的接种方法是 ________________（填图乙中“A”或“B”）在显微镜下用血球计数板直接计数所得到的数目往往比实际活菌数目偏大原因是________________________________________20.（2）若要长期保存目的菌株不采用图甲中⑦的保存方法而用________的方法实验结束后使用过的培养基应该进行________处理后才能倒掉20.（3）在接种到图甲中⑥之前随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间这样做的目的是________________________ 若要比较不同菌株降解苯酚能力的大小请写出设计思路 ________________________________________________________________【答案】（1）苯酚, 选择, ［B稀释涂布平板法, 显微镜直接计数法不能区分死菌与活菌【解析】解（1）在将样品稀释涂布到能鉴别降解苯酚的细菌的培养基上之前可通过选择培养增加该细菌的浓度以确保能够从样品中分离出所需要的微生物所以图甲②中培养目的菌株的选择培养基中应以苯酚为唯一碳源若要统计活菌数目最常用的接种方法是B稀释涂布平板法显微镜直接计数法下不能区分死菌与活菌故统计的数目往往比实际活菌数目大【答案】（2）甘油管藏, 灭菌【解析】（2）采用题图甲中⑦的方法保存菌种易污染或产生变异若要长期保存目的菌株可以用甘油管藏的方法实验结束后使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉以防止污染环境【答案】（3）检测平板灭菌是否合格, 用苯酚含量相同的培养液培养不同菌株一定时间后测定培养液中苯酚含量【解析】（3）接种到图甲中⑥之前随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间观察培养基上是否有菌落产生若有则说明培养基已经被污染了应重新配制培养基进行实验若要比较不同菌株降解苯酚能力的大小可以用苯酚含量相同的培养液培养不同菌株培养一段时间后测定培养液中苯酚含量21.（1）过程①操作是________（先切块后清洗/先清洗后切块）过程④需要加入无菌水对果酒进行稀释原因是________21.（2）过程③前需要加入白砂糖主要是为酵母菌提供________ 白砂糖的添加量对酒精生成量的影响如图所示因此白砂糖的添加量为________最为合理。
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某种苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定
一、引言
近年来，环境污染问题日益突出，其中有机污染物的排放成为了一个
备受关注的话题。
苯酚作为一种有机化合物，其在工业生产和生活中
被广泛使用，但是其排放也给环境造成了不小的压力。
寻找一种能够
高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。
本文将围绕某种苯
酚降解细菌的分离、纯化、鉴定展开讨论。
二、苯酚降解细菌的分离
1. 采样地点选择
在开始分离苯酚降解细菌之前，首先需要明确采样地点的选择。
一般
来说，苯酚的排放源比较集中，因此我们可以选择一些工业废水排放口、化工厂周围土壤和水体等地点进行采样。
2. 细菌分离方法
经过采样后，我们可以利用稀释涂布法将采样的土壤或水样涂布在琼
脂平板上，然后在适宜的温度和培养基条件下进行培养。
通过分离光
圈和纯化培养，我们可以获得一系列有苯酚降解能力的细菌菌落。
三、苯酚降解细菌的纯化
1. 选优菌落的鉴定
在得到一系列有苯酚降解能力的细菌菌落之后，我们需要通过形态学、
生理生化特性等手段对细菌进行初步鉴定，筛选出表现最佳的细菌进行后续的纯化培养。
2. 纯化培养方法
对选优细菌进行纯化培养可以采用多次转接法，即将单一细菌菌落进行二次以上的转接，以获得单一细菌培养物。
四、苯酚降解细菌的鉴定
1. 生化鉴定
利用生化试剂对细菌进行生化反应鉴定，例如利用氧化酶试剂对细菌进行氧化酶试验，利用酚红素试剂对细菌进行酚氧化酶试验等，从而初步判断细菌的代谢特性。
2. 分子生物学鉴定
通过16S rRNA基因测序鉴定细菌的亲缘关系，确定其属种级别的分类位置。
五、个人观点和总结
苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项具有挑战性的工作，需要从多个角度进行综合分析和判断。
通过本文的探讨，我们不仅仅了解了苯酚降解细菌的基本分离和纯化方法，还深入了解了细菌鉴定和分类的相关技术。
希望通过这些工作，能够为环境污染治理和资源开发提供一些有益的参考和借鉴。
苯酚是一种常见的工业化合物，在工业生
产和生活中被广泛使用。
然而，苯酚的排放对环境造成了严重的污染，因此寻找一种能够高效降解苯酚的细菌成为了当下研究的热点之一。
本文将继续探讨苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定的过程，并介绍一
些新的研究进展和技术方法。
在进行苯酚降解细菌的分离过程中，除了选择适合的采样地点外，还
可以引入一些新的分离方法。
可以利用基于生物信息学的方法，针对
苯酚降解相关基因进行筛选，然后从土壤或水样中直接采集携带这些
基因的细菌。
这种方法能够快速高效地筛选出具有苯酚降解能力的细菌，极大地提高了分离效率。
在苯酚降解细菌的纯化过程中，除了传统的多次转接法外，还可以引
入一些新的分离技术。
可以利用质谱技术对细菌代谢产物进行分析，
从而快速准确地鉴定出有苯酚降解能力的细菌。
还可以利用基因工程
技术构建表达苯酚降解相关基因的细菌菌株，从而提高其降解能力和
稳定性。
在苯酚降解细菌的鉴定过程中，除了传统的生化和分子生物学鉴定方
法外，还可以引入一些新的技术手段。
可以利用代谢组学技术对细菌
的代谢产物进行全面分析，从而深入了解其降解途径和代谢特性。
还
可以利用生物信息学的方法对细菌的全基因组进行测序和分析，从而
揭示其降解相关基因的组织结构和功能。
苯酚降解细菌的分离、纯化、鉴定是一项复杂而具有挑战性的工作，需要利用多种技术手段和方法进行综合分析和判断。
随着科学技术的不断进步，相信在不久的将来，我们将能够找到更多更有效的方法和途径，为环境污染治理和资源开发提供更多有益的参考和借鉴。
希望通过这些努力，能够为保护地球环境、促进可持续发展作出更多的贡献。