马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法
马铃薯检测
马铃薯检测【导语】马铃薯检测是什么？马铃薯检测对于我们有什么作用？目前人们越来越关注马铃薯检测方面的知识和信息，因为马铃薯检测关系到我们生活的方方面面，那么今天小编就针对马铃薯检测这个话题，给大家针对性的介绍一些马铃薯检测相关的知识：马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。
然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题。
对于马铃薯产业的参与者而言，细菌、真菌及病毒的检测和识别十分重要。
本文从病毒种类及相应检测方法进行简要介绍。
1 马铃薯主要病毒种类及致病症状222.png2 马铃薯病毒主要检测方法2.1 酶联免疫吸附检测法酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA）是把抗原-抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术。
该技术是在不影响酶活性和免疫球蛋白分子的反应条件下, 使酶分子和免疫球蛋白分子共价结合成酶标记抗体。
酶标记抗体可直接或通过免疫桥与包袱在固相支持物上待测定的抗原或抗体特异性结合,来检测病毒的存在。
ELISA具有特异强、灵敏度高、操作简便、易于观察等优点, 非常适合于大规模检测, 适于脱毒苗的检测。
方法经济简便，快速直观，但其也存在一定的缺点:（1）抗体的制备所需时间长，费时费力；（2）一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度降低；（3）对于蚜虫传播的病；有一些在植物上第一年不表现症状,病毒繁殖量少,无法用ELISA方法检测；（4）检测病毒时还经常存在假阳性反应，给脱毒种薯(苗)的检测带来困难。
2.2 PCR检测法近来，由于PCR检测的特异性和灵敏性，被广泛运用于许多细菌、真菌、病毒和类病毒的检测。
但是，运用普通的PCR分析仪检测多种病原菌时，不仅十分耗时，而且对实验室条件要求严格且需要很长的反应设置时间，易造成人为误差。
马铃薯主要病毒
• 三、影响马铃薯侵染和症状发生的因素
• （一）寄主基因型（Host genetype）
• 马铃薯普通栽培种亚种（tuberosum）和马铃薯安第斯亚 种（andigena）上的马铃薯卷叶病毒（PRLV）的表现。
• 在某一特殊的病毒侵染的栽培品种没表现出症状，可能是 受寄主基因型控制。受侵染而无症状的植株，对其产量无 显著的影响，这种情况称为耐病性（toletance），受侵染 的植株称之为无症状带毒者（asymptomatic carrier）。
• 常见的马铃薯病毒病症状类型（俗称马铃薯退化类型）有 花叶、卷叶、束顶、矮生四个。花叶类型中有各式各样花 叶症状，其致病毒原复杂。而另三个类型（卷叶、束顶、 矮生）的病原虽较单纯，但常与花叶型的病毒复合侵染， 呈综合症状。其中矮生型病株，除某种病原的特定症状外， 有时一些抗病性弱的马铃薯品种，如果被多种病原侵染， 发病严重，导致植株生育停滞，从而造成植株矮缩现象。
• 其他原因也能引起类似病毒病症状，如遗传异常、非虫害 和病原引起的生理异常以及由其他虫害或致病因子引起的 异常。
• 大多数情况下，病毒通过受感染植物所表现的症状而表达。
• 马铃薯受病毒侵染后会产生各种不同的症状，这些症状的 发生取决于受病毒及其株系侵染的植物基因型，病毒与寄 主发生反应时所处的环境条件。环境因素很多，包括自然 条件，有机体之间的相互作用及生物因素。
• （六）形状、质地等的畸形
• （Deviations of shape，texture，etc）
• 1．纺锤形块茎（Spindle tuber） • 2．过长（Elongation） • 3．气生薯（Aerial tubers） • 4．过度生长（Overgrowths） • 5．开裂（Cracking） • 6．软化（Flaccidity） • 7．对数量和大小的影响（Effect on number and size）
浅析马铃薯病毒检测技术
马铃薯是我国重要的粮食作物和经济作物,马铃薯在定西市种植也有200多年的历史,在保障全市粮食有效供给和繁荣城乡经济中发挥了十分重要的作用,已由过去的“救命粮”变成了现在的“致富薯”,是定西最具生产潜力、市场优势和开发前景的特色农产品,也是农业增效、农民增收的第一大优势产业。
近年来,定西市委、市政府对马铃薯产业高度重视,作为全市农业和农村经济发展的战略性主导产业来扶持,制定了“全市马铃薯产业发展规划”,省上也制定下发了“关于进一步加快发展马铃薯产业的意见”,提出了工作思路和具体目标,促进了本市马铃薯产业的快速发展。
2013年全市种植面积达到319.84万亩,总产量506万t,是全国三大马铃薯集中产区之一。
但是由于定西经济条件落后,全市的马铃薯种薯的病毒检测并未随着种植面积的扩大而提高和普及,以至于马铃薯各种病每年在生长期发生,严重影响了全市马铃薯的产量和质量。
马铃薯病毒已成为马铃薯生产中的重要制约因素,急需大力提高马铃薯种薯的病毒检测,为马铃薯产业的持续快速发展把好第一增长关。
马铃薯病毒检测包括：基础试管苗、马铃薯原原种、大田种薯的检测。
严格的检测大大提高了种薯合格率,而种植合格的种薯,每亩可以提高产量500kg 以上。
马铃薯的病毒有6种,分别是马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）。
目前最常用的马铃薯病毒检测是用双抗体夹心酶免疫吸附测定法（DAS-ELISA）检测,是用于快速、灵敏、准确的血清学技术,是国际通用的检测方法之一。
下面就本市引进的“马铃薯病毒DAS-ELISA检测”全套生产技术进行浅述。
1马铃薯病毒的概况1.1马铃薯X病毒（PVX）也称普通花叶病毒,是一种长520～550nm的线状病毒,有时在电镜下能看到病毒颗粒的中心孔。
在病毒外壳由亚基形成时,可看到它的横纹,这一点是与马铃薯重花叶病毒在形态结构上的主要区别。
马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立
马铃薯六种主要病毒通用RT-PCR检测体系的建立张威;白艳菊;景芝;范国权;高艳玲;申宇;张抒;孟宪欣;王军【摘要】马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯A病毒（PVA）是马铃薯生产田中发生率较高、危害较严重的病毒，因此，建立特异性强、灵敏度高、检测速度快的RT-PCR分子检测体系对保障马铃薯种薯质量具有非常重要的意义。
试验筛选了6种病毒的特异引物、优化了PCR部分的试剂以及确定了退火温度。
结果表明，当Mg2+浓度为2.6 mmol/L、dNTPs浓度为0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶浓度为0.03 U/μL，以及退火温度为55.5℃时反应体系最稳定。
最终，建立了一套通用RT-PCR检测体系，只需要变换每种病毒的引物，就可以实现对PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR检测。
每种病毒检测灵敏度均能达到pg以上。
%The higher incidence and more serious viruses in potato fields are potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), potato virus S (PVS), potato leafroll virus (PLRV), potato virus M (PVM), and potato virus A (PVA), so it is very important to guarantee the quality of seed potato by establishment of RT-PCR molecular detection system with specificity, high sensitivity and fast detection speed for these viruses. In this research, the primer for each virus was screened, PCR reagents were optimized, and annealing temperature was determined. The results indicated that when the concentration of Mg2 + was 2.6 mmol/L, dNTPs was 0.1 mmol/L, Taq DNA polymerase was 0.03 U/μL, and annealing temperature was 55.5℃, the reaction system was the most stable. Finally, a universal RT-PCR detection system was established, which only need tochange primer for each virus when the RT-PCR detection for PVX, PVY, PVS, PLRV, PVM and PVA was needed. The detection sensitivity of each virus could reach the level of pg.【期刊名称】《中国马铃薯》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】6页(P222-227)【关键词】马铃薯;PVX;PVY;PVS;PLRV;PVM;PVA【作者】张威;白艳菊;景芝;范国权;高艳玲;申宇;张抒;孟宪欣;王军【作者单位】黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086;东北农业大学农学院，黑龙江哈尔滨 150030;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨 150086;黑龙江省农业科学院作物育种研究所，黑龙江哈尔滨 150086;北大荒垦丰种业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150090【正文语种】中文【中图分类】S532马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一，具有分布范围广、适应性强、产量高、用途广等特点。
马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法
马铃薯病毒种类及主姜病毒检测方法•农学论文马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法罗燕娜,刘江娜,王航（兵团第六师农业科学研究所,新疆五家渠831300 ）收稿日期：2 015—01—20摘要：本文对：Ibli地区马铃薯主要病莓的特性和致病症状逬行了描述”并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。
关键词：马铃薯；病莓；检测方法马铃薯在我国广泛种植,已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。
由于光照强、昼夜遍差大、气候冷凉等优势，新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯，现种植面积已达2310hm2［l］.然而在当前的马铃薯生产中，病壽病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题［2］。
目前，已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病壽1种，其中，侵染乌鲁木齐地区马铃書的主要病原病莓有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病莓为PSTVd。
主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒（PVX X马铃薯Y病量PVY 1马铃S S病頡PVS \马铃薯M病毒（PVM \马铃薯卷叶病毒（PLRV ）及马铃薯纺锤块茎类病莓（PSTVd ）⑴。
1马铃薯主要病莓种类及致病症状1.1马铃薯X病毒（PVX）X病莓又称普通花叶病莓,病莓粒子为长杆状,大小为515nmxl3nm ,基因组全长6.4kb［3］。
该病莓可通过叶片汁液摩擦传播，也可通过蜗虫以非持久性方式传播,还可通过种暮传播［1］。
感病植株症状多种多样,因栽培品种的敏感性不同和病莓株系的不同而存在差异，多数表现为轻花叶或潜隐症状，症状严重的则表现为严更的花叶或皱缩,产量损失可达50%。
1.2马铃薯Y病毒（PVY）Y病莓又称为重花叶病莓，病莓粒子形状为弯曲的线形,大小为750nmxllnm ,多数通过桃妈和大戟长管妈传播。
PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO X马铃薯点条斑株系（PVYC ）和马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN L前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳，后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲；第3个株系组初期表现为不同程度的花叶, 后期为花叶和斑驳,当溫度低于10°C或高于25°C时，花叶症状消失。
马铃薯土豆十大病害高效防治方案
引言概述：马铃薯是一种重要的经济作物，但由于其种植密度高、气候变化等原因，容易受到各种病害的侵袭，严重影响产量和质量。
为了高效防治马铃薯病害，本文将针对十种常见的马铃薯病害，提供相应的防治方案，包括预防措施、病害检测和治疗方法等。
正文：1.马铃薯早疫病种植抗早疫病品种合理灌溉和施肥，保持土壤水分和养分平衡定期巡视、病害监测和早期预警系统引入保护性病害防治技术，如草铵盐喷雾等如发现病害，立即采取防治措施，如喷洒杀菌剂2.马铃薯晚疫病选择抗晚疫病品种进行种植加强病害监测，及时发现病害症状采用适当的灌溉方法，避免病害传播注意病害传播途径，如果实等，采取相应防治措施如出现病情严重的情况，可以考虑实施土壤消毒等措施3.马铃薯黑斑病剪除黑斑病患部，及时清除病叶保持适宜的湿度和通风，避免病害扩散使用酒精、氯化钠等消毒工具，减少病害传播使用高效杀菌剂进行防治，如丁硫菌灵、多菌灵等加强农田管理，清除受病菌污染的残茬4.马铃薯炭疽病选择抗炭疽病品种进行种植加强炭疽病病害监测和防控预警控制湿度和通风，避免病害扩散定期剪枝和除草，保持农田整洁如发现病害，及时喷洒炭疽病防治剂，如金龙菌可湿性粉剂等5.马铃薯病毒病选择病毒抗性强的品种进行种植加强病毒检测和防控预警设置隔离区和有效隔离措施，避免病毒传播定期清除病叶和病株，减少病毒源如发现病毒病害，采用病毒防治剂，如多玛立匹特等总结：马铃薯是重要的经济作物，但容易受到多种病害的侵袭。
为了高效防治马铃薯病害，在种植阶段选择抗病品种，并加强病害监测和预警。
合理的灌溉和施肥、定期巡视、隔离区设置以及合理使用防治剂等措施也是高效防治马铃薯病害的重要步骤。
通过采取综合防治措施，能够有效提高产量和质量，保障马铃薯种植的顺利进行。
马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究
马铃薯三种主要病毒的ELISA和RT-PCR检测技术的研究马铃薯是世界上重要的食物作物之一，也是我国主要的经济作物之一。
然而，马铃薯生产中常常受到病毒的威胁。
病毒感染会导致马铃薯产量下降、品质降低甚至全面减产。
因此，准确快速地检测病毒感染对于指导马铃薯的种植和防控病害具有重要意义，可以提供科学依据、减少经济损失和保证农作物的质量安全。
马铃薯主要受到三种病毒的感染，分别是马铃薯病毒Y (Potato Virus Y, PVY)、马铃薯块茎坏死病毒 (PotatoVirus X, PVX)和马铃薯花叶病毒 (Potato Leafroll Virus, PLRV)。
传统的病毒检测方法包括生物学观察法、传统PCR等。
然而，这些方法存在耗时、复杂、低灵敏度等问题。
因此，研究人员对使用ELISA和RT-PCR等技术进行马铃薯病毒检测进行了深入研究。
ELISA法是一种高效的酶联免疫吸附法，利用抗原与特异抗体结合，通过比色反应检测样品中是否存在目标病毒。
ELISA方法具有高度敏感性和特异性，且结果易于观察和分析。
针对马铃薯病毒检测，研究人员首先制备了目标病毒的抗原，并将其与马铃薯样品中的病毒结合，然后添加酶标记的二抗，形成抗原-抗体-酶标记-底物复合物。
最后，通过添加酶底物，观察是否有颜色反应产生。
ELISA法不仅操作简便、检测速度快，而且可以批量检测多个样品。
但是，ELISA法的敏感性对样品前处理和样品质量要求较高。
与ELISA法相比，RT-PCR法可以在基因水平上对目标病毒进行检测。
RT-PCR法首先需要提取马铃薯样品中的总RNA，然后通过反转录将RNA转化为cDNA，再进行聚合酶链反应扩增。
PCR反应中使用特异引物，使得目标病毒的RNA序列扩增得到特异性产物，经过电泳分析可以确定是否存在目标病毒。
RT-PCR法具有快速、准确、高灵敏度和高特异性等优点，可以在较短的时间内对多个样品进行检测。
但是，RT-PCR法技术门槛较高，操作复杂，需要专业的实验室和设备。
马铃薯主要病毒及检测研究进展
马铃薯主要病毒及检测研究进展作者：陈晓艳齐恩芳贾小霞张武来源：《南方农业·下旬》2015年第09期摘要马铃薯是无性繁殖作物，常因病毒侵染而造成病毒在植株体内累积，造成种性退化，品质和产量下降。
基于此，讲述了马铃薯的几种常见病毒病，并对常用的病毒检测方法进行评价。
为保证马铃薯种薯质量，促进马铃薯主粮化、优化农业结构提供技术指导。
关键词马铃薯;病毒检测中图分类号：S435.72 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2015）27--04马铃薯具有分布范围广、适应性强、产量高和用途广泛等特点，是全球公认的全营养食物。
随着我国马铃薯主粮化战略的启动，对保障国家粮食安全、顺应国人营养需求、缓解资源环境压力，有着其他作物不可替代的作用。
但马铃薯在生长期间易受多种病毒病侵染造成病毒性退化，使马铃薯的品质和产量受到影响，造成的损失巨大。
现已研究出的侵染马铃薯的病毒有40多种[1]，危害我国马铃薯产区的主要病毒有马铃薯PVX、PVS、PVY、PVA、PVM、PLRV和PSTV[2，3]。
这些病毒严重影响马铃薯的产量及品质。
因此，马铃薯病毒的研究也成为各国研究的重点，马铃薯病毒的检测成为马铃薯种薯繁育中的重大难题。
1 影响马铃薯的主要病毒类型1.1 马铃薯X病毒（Potato Virus X，PVX）马铃薯X病毒为害症状因品种、病毒株系以及环境条件的不同，有些株系在冷凉条件下，叶片出现轻微花叶，继而发展成为褪绿斑、坏死性条斑，有的上部叶畸形，叶缘呈锯齿等症状;晴朗天气，明脉、轻微花叶症状可减轻，甚至完全消失;有些株系，在高温条件下不表现症状，呈隐症现象。
PVX是由一条正链RNA组成的线性病毒，RNA 3，末端是多聚腺嘌呤核苷酸，5，末端有m7GppG“帽子”结构[4]。
PVX单独侵染马铃薯可减产15%左右，PVX可与多种病毒复合侵染，严重时造成马铃薯绝收。
1.2 马铃薯Y病毒（Potato Virus Y，PVY）马铃薯Y病毒病（PVY）的田间症状复杂多变，不同的病毒株系引致的症状差异较大，初期出现明脉症状，后形成系统斑驳，叶脉两侧组织呈绿色带状斑，叶片基部症状较为明显，病叶侧脉呈灰褐色坏死，表现脉和茎的变褐坏死。
马铃薯种薯病毒检测方法2016-6-27
马铃薯种薯病毒检测现已发现，造成马铃薯退化的病毒有30余种，严重为害马铃薯的病毒有七种：马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯A病毒（PV A）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯S病毒（PVS）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。
在马铃薯栽培过程中，出现叶片皱缩卷曲，叶色浓淡不均，茎秆矮小细弱，块茎变形龟裂，产量逐年下降等现象，就表明马铃薯已经发生“退化”。
种薯“退化”是病毒的侵染及其在薯块内积累造成的，也是引起产量降低和商品性状变差的主要原因。
采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的“退化”，使之达到育种家培育品种本身的商品性状和产量。
这就是种薯需要脱毒和采用脱毒种薯能够大幅度提高产量的重要原因。
1.种薯分类复合国家标准（GB18133-2012 表1）规定的相应质量要求的种薯为原原种、原种、一级种薯和二级种薯。
表1 各级别种薯田间检查植株质量要求1.1原原种（G1）用脱毒组培苗或试管薯在防虫网、温室等隔离条件下生产，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于原种生产的种薯。
1.2原种（G2）用原原种作种薯，在良好隔离环境条件下生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产一级种的种薯。
1.3一级种薯（G3）在良好隔离环境中，用原种作种薯生产的，经过质量检测达到国家标准（表1）要求的，用于生产二级种的种薯。
1.4二级种薯（G4）在相对隔离环境中，用一级种作种薯生产，经过质量检测后达到国家标准（表1）要求的，用于生产商品薯的种薯。
1.5种薯批来源相同、同一块地、同一品种、同一级别以及同一时期收获、质量基本一致的马铃薯植株或块茎作为一批。
2.主要检测病毒2.1马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）2.2马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）2.3马铃薯A病毒（Potato virus A,PV A）2.4马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）2.5马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）2.6马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）2.7马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）3.检测方法3.1病毒检测采用酶联免疫（ELISA）或反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测马铃薯病毒病是马铃薯重要的病害之一，能够造成严重的经济损失。
为了及时有效地监测和检测马铃薯病毒病，保障马铃薯生产的安全和质量，内蒙古自治区采取了一系列的检测措施和方法。
一、马铃薯病毒病的病原学特性马铃薯病毒病主要由病毒引起，包括普通马铃薯病毒（PVY）、Y病毒（PVY）、X病毒（PVX）、丝状管现状病毒（PLRV）等。
这些病毒会严重影响马铃薯的生长发育，导致产量下降，品质变差，影响经济效益。
二、马铃薯病毒病的检测方法1. 田间检测田间检测是指在马铃薯种植地实地检测病毒病害情况。
通过观察马铃薯叶片的病症特征，如黄化、马铃薯瘟病叶片可以检测出病毒病害的存在。
这是一种简单直观的检测方法，但不能确定具体的病毒种类，只能初步判断是否存在病毒病害。
2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA是一种常用的快速检测方法，可以用于检测马铃薯病毒病。
它通过特定的抗体与病毒蛋白结合来检测病毒的存在，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短等优点。
这种方法适合于大批量样品的检测，可以用于种薯、商品薯的检测和筛选。
3. PCR检测PCR（聚合酶链式反应）是一种高效特异的分子生物学检测方法，可以扩增特定的病毒DNA序列，可以检测出病毒的存在并确定其种类。
PCR检测方法需要使用特定的引物和探针来扩增和检测病毒，因此具有高度的特异性和准确性。
这种方法需要实验室条件和专业技术支持，适合于科研机构和专业实验室使用。
三、内蒙古自治区马铃薯病毒病的监测与检测措施1. 马铃薯病毒病害调查在马铃薯种植地开展病毒病害的调查和监测工作，及时发现和报告病毒病害的情况。
采取样品调查、实地观察等方式，掌握病毒病害的分布和危害程度，为病毒病害的防控提供科学依据。
2. 种薯病毒病检测对于种植马铃薯的种薯进行病毒病害的检测，筛选出健康的种薯进行种植，减少病毒病害的传播和危害。
采用ELISA、PCR等方法对种薯进行检测，确保种薯的质量和病毒病害的防控。
应用三重RT-PCR技术检测三种马铃薯病毒
对 田间 １ ５ ０ 份马铃薯毒源样品进 行检 测 ，两种 方法检 测结果 吻合 ，三 重Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ体 系的灵敏度 更高、特 异性 更强 ，
可 以用 于 马铃 薯 田 间样 品检 测 。 关键 词 ：三 重 Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ；马铃 薯 ；Ｐ Ｖ Ｘ；Ｐ Ｖ Ｍ；Ｐ Ｖ Ａ；检 测
ｏ ｆ Ｍｇ ， ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ｓ ａ ｎ ｄ Ｔ ａ ｑ ＤＮ Ａ ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｅ ｒ ａ ｓ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｅ ￣ｅ ｄ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ｏ ｆ ７ １ １ ｂ ｐ（ Ｐ Ｖ Ｘ） ， ５ ２ ０ ｂ ｐ（ Ｐ ＶＭ） ａ ｎ ｄ ２ ７ ３ ｂ ｐ（ Ｐ Ｖ Ａ） ｗｅ ｅ ｒ
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我国马铃薯病毒的种类及脱毒种薯生产过程中病毒的检测
我 国马铃薯病毒 的种类及脱毒种薯生产过程 中病毒 的检测——吴兴泉 ，时 妍 ，杨庆东
・６ ・ ３３
中 图分 类 号 ：￥ ３ ５２
文献 标 识 码 ：Ｂ
பைடு நூலகம்
文 章 编 号 ： １７ — ６ ５ ２ １） ６ ０ ６ — ４ ６ ２ ３ ３ （０ １０ — ３ ３ ０
我 国马铃薯病毒 的种 类及脱毒种薯生产 过程 中病毒 的检 测
因此 ，１ ％噻虫 嗪种 衣剂 在 ８ ３ｇ 种 薯剂 量 下 ． ２ ３ ／
汤 富彬 ， 陈宗懋 ， 罗逢 健． Ｐ Ｃ法测定 黄瓜 和土壤 中噻虫嗪 ＨＬ
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２ Ｇ ｅ ｔ ｏｔｅｎ ｌ ｒｅ ｓＰ ｔｔ Ｉ ｕ ｔ ｒｕ ｏ ， ｔ， ｉ ａ ｒｎ ｈ Ｎ ￣ａ ｇ Ｈ Ｕ ｎ ｊ ｎ ６ ４ １ Ｃ ｉ ． ｒａ Ｎ ｒ ｒ ｄ ｎ ｓ ｏ ｏ ｎ ｓ ｙ ｏ ｐＣ 。Ｌ Ｊ ｓ ｎＢ ａ ｃ ， ｅ ｉ ， ｅｏ ｇ ａ ｇ １ １ ４ ， ｈ ａ） ｈ Ｗｉ ｅ ａ ｄ ｒＧ ｄ ｕ ｎ ｉ ｎ
马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测
马铃薯病毒PVY,PVS和PLRV多重RT-PCR检测黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【摘要】病毒是马铃薯生产过程中危害较大的一类病原,为快速检测出云南省马铃薯主要病毒种类,依据病毒外壳蛋白基因序列设计合成了马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的特异性引物,从退火温度、最低检测浓度、热反应循环条件、病毒间的模板及引物间的最佳组合浓度进行优化,建立了三重RT-PCR反应体系.结果表明:该优化体系可同步扩增出上述3种病毒,分别得到480 bp (PVY)、187 bp (PVS)、336 bp (PLRV)大小的扩增片段.优化的三重RT-PCR反应体系可快速、灵敏、简便的检测到单一或复合侵染的马铃薯病毒,有利于马铃薯病毒病的早期检测和防治,将为云南省马铃薯种苗脱毒、继代、田间植株的高产栽培等有重要实践作用.【期刊名称】《云南农业大学学报》【年(卷),期】2015(030)004【总页数】6页(P535-540)【关键词】马铃薯;病毒;多重RT-PCR检测【作者】黄丹;余琨;陈建斌;蔡红;朱有勇【作者单位】云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南省建水县农业技术推广所,云南建水654399;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201;云南农业大学植物病理重点实验室,云南昆明650201【正文语种】中文【中图分类】S435.32马铃薯病毒病是马铃薯非常重要的一类病害，病毒的侵染可引起马铃薯种质退化，导致产量急剧下降[1]。
我国各马铃薯主产区均有马铃薯病毒病发生[2]。
主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus，PLRV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、马铃薯A病毒(Potato virus A，PVA)和马铃薯S病毒(Potato virus S，PVS)[3-4]。
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
马铃薯病毒病是一种由病毒引起的病害。
该病会导致马铃薯产量降低和质量下降，对
马铃薯生产造成严重影响。
因此，为了保障马铃薯的生产质量，必须对其进行检测。
一、检测方法
1、实时荧光定量PCR检测法
该方法利用荧光探针来检测植物中的病毒，具有高灵敏度和高特异性。
2、反转录PCR检测法
该方法通过反转录将RNA转化为cDNA，再进行PCR检测，适用于检测多种病毒。
3、酶联免疫吸附检测法
二、检测步骤
1、样品采集
将疑似受感染的马铃薯叶片、茎、块茎等样品收集，避免样品受到污染。
2、样品处理
对样品进行处理，包括提取RNA或cDNA，并转换成PCR反应体系所需的模板。
3、PCR反应
将样品加入PCR体系中进行扩增，根据PCR反应条件调整PCR仪设置，进行PCR反应。
4、结果分析
将PCR产物进行分离、凝胶电泳或实时荧光检测，并分析出PCR产物，确定是否存在
病毒。
三、注意事项
1、选取合适的检测方法进行检测，根据检测条件调整检测方案。
2、在实验室操作时，要遵守实验室安全规定，防止样品污染和交叉污染。
3、在样品处理和PCR反应过程中，要对实验室设备和试剂进行无菌处理，以确保实
验结果的准确性。
四、结论
马铃薯病毒病的检测是保障马铃薯生产质量的重要手段，需要选取合适的检测方法进行检测。
实时荧光定量PCR检测法、反转录PCR检测法和酶联免疫吸附检测法是常用的检测方法，具有高灵敏度和高特异性。
在检测过程中要遵守实验室安全规定，确保实验结果的准确性。
马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立
马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立在农作物种植过程中，病毒病是造成作物严重减产和经济损失的主要原因之一。
马铃薯是一种重要的经济作物，其种植面积广泛分布于全球各地。
然而，马铃薯病毒病的流行给作物品质和产量带来了巨大的威胁。
因此，建立一种高效的检测手段来及时发现和监测马铃薯病毒病成为迫切的需求。
近年来，分子生物学技术的进展为病毒的检测提供了有效的手段。
PCR（聚合酶链式反应）技术作为一种常用的分子生物学方法，已被广泛应用于病毒的检测和鉴定。
本文旨在建立一种马铃薯四种病毒多重PCR检测体系，以提高病毒检测的效率和准确性。
首先，为了确定合适的引物和探针，我们参考了已有的相关文献，并进行了初步实验。
我们选择了马铃薯四种常见病毒的关键基因作为目标序列，设计了一系列引物和探针。
然后，通过实验室内外鉴定的病毒感染马铃薯样品进行测试，筛选出具有特异性和敏感性的引物和探针。
其次，为了优化PCR反应的条件，我们对PCR反应液中的成分进行了调整。
我们优化了引物和探针的浓度，调整了缓冲液的pH值，并测试了不同温度下的扩增效果。
在优化后的条件下，我们得到了稳定和可重复的PCR扩增结果。
然后，我们对该多重PCR检测体系进行了验证。
我们收集了马铃薯样品来自不同地区、具有不同病毒感染程度的样本。
通过与传统的病毒检测方法进行比较，结果表明，该多重PCR检测体系能够准确、快速地鉴定出不同病毒感染的马铃薯样品。
此外，我们还利用该体系对种植地区的马铃薯进行了病毒调查，为农民提供了及时的病毒病预警。
最后，为了保证PCR反应的准确性，我们采取了一系列控制措施。
我们制备了阴性对照和阳性对照，并在每次实验中添加对照来验证PCR反应的可靠性。
同时，我们还进行了重复性和稳定性实验，结果表明，该多重PCR检测体系具有良好的重复性和稳定性。
总的来说，本研究成功地建立了一种马铃薯四种病毒多重PCR检测体系。
该体系具有高度的特异性和敏感性，能够快速、准确地鉴定出各种马铃薯病毒病。
马铃薯种薯生产中的病毒检测
１１ 采 ． 样
免疫吸附测定法 的要求配 制，包被缓冲液在 ４ ℃下保存 １ ８ 周 ， 品提取 液在 ４ ℃下可保存 ２ 样 个月 ， Ｂ Ｔ洗涤缓冲液 ＰＳ
在 ４ ℃下可保存 ６个月 ，底物缓冲液在 ４℃下可保存 １ 个 ８
月 ，底 物 现 用 现 配 。
２ 种薯生产中病毒 检测 的种类
薯
主要检测种类为 Ｐ ＶＸ、 ＶＹ、Ｐ Ｓ Ｌ Ｐ Ｖ 和Ｐ ＲＶ四种病毒 。
３ 马铃薯病毒病分布调查
１０ｍ ０ 为单位， 分划 ５ 每片随机取 ４ 片， 个样 ， 共取 ２ 份样品。 ０ 凡用于继代繁殖 的组培 苗 ， 瓶必检。将组培苗分成单 每
株 ，剪下带生 长点的 １ １ ，扦插 在 ＭＳ培养基上继繁一 叶 心 代 ，编号记录 ；植株的其余部分送去 检测。
引 起 品种 退 化 。 目前 通 过微 茎尖 组 织 培 养 技 术 能从 马 铃 薯体
每个酶联 孔使 用的包被血清、 品提取液 、 血清 、 样 酶标 洗
涤 缓 冲 液 用 量 统 一 ， 用 ＭＫ一 全 自动 洗 板 机 （ 兰 产 ） 采 ２ 芬 洗
板 ，每次洗板 ４ ，每遍 ５ ｍｉ。设有阳性 、阴性和 空白对 遍 ｎ 照各 ２ ， 个 每板可测 ９ 个样 品， 温箱 ３ ℃下温育 ２ ０ 在 ７ ～４ ｈ， 或在 冰箱 内４ ～６ ℃下过 夜。
上海农业科技
２ １— ０２ ２
马铃 薯种薯生产中的病毒检测
王清福 居 玉玲 （ 农友种苗 （ 中国 ） 有限公 司上海分公 司，上海青浦 ２１０ ） ０７ ８
摘 要 ：病毒 检测 是马 铃薯 种 薯生 产 中不可 或缺 的一环 ，双 抗体酶 联免 疫 吸附测 定法 （ ＤＡＳ Ｌ Ｓ ）是一 —Ｅ Ｉ Ａ 种简 单 、灵敏 度 高 、特 异性 强 ，安 全 、快速 、结 果容 易观 察 、适于 商业 化大 量 样 品的检 测 方法 。 介绍 了此 方法 的 操作 程序及 其相 配 套的 采样 方法 ，并对多 年实 践 中马铃 薯组培 苗和 种瞽 生产 中的 检测 数据 进行 了简 要的统 计分析 。 关键 词 ：马 铃 薯 ，种 薯 ；病 毒 ；双 抗 体 酶联 免 疫 吸 附 测 定 法 检 测程 序 ；检 测分 析
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测内蒙古自治区地处中国北部，是一个重要的农业生产区。
马铃薯作为内蒙古的主要经济作物之一，在当地具有重要的地位。
近年来，马铃薯病毒病在内蒙古自治区的马铃薯种植中造成了严重的危害。
为了保障马铃薯的生产和质量，需要对马铃薯病毒病进行及时而准确的检测。
内蒙古自治区马铃薯病毒病主要包括马铃薯斑点花叶病毒、马铃薯卷叶病毒和马铃薯曲叶病毒等多种类型的病毒，它们会给马铃薯的生长和产量带来严重的损害。
进行马铃薯病毒病的检测至关重要。
一、马铃薯病毒病的检测方法目前，对于马铃薯病毒病的检测主要有田间调查和实验室检测两种方法。
田间调查是最为直观和简单的一种方法，通过观察马铃薯植株的生长状况和叶片的病症表现来初步判断是否感染了病毒。
田间调查存在一定的局限性，因为有些病毒感染后植株并不会表现出明显的病征，容易被忽略或误判。
实验室检测是一种更加准确和科学的方法，主要包括病毒抗体检测、聚合酶链式反应（PCR）检测和病毒分离鉴定等技术。
PCR技术是目前应用最广泛的一种检测方法，它能够对马铃薯植株中的病毒基因进行扩增和检测，具有高灵敏度和特异性。
病毒分离鉴定技术则是通过将感染的植株分离出病毒，并通过一系列的鉴定试验来确认病毒的类型和种类。
内蒙古自治区种植马铃薯的地区辽阔，由于地理位置和气候条件的差异，不同地区对马铃薯病毒病的检测情况也存在一定的差异。
一些先进的大规模种植基地和科研机构较为重视对病毒的检测工作，采用了PCR技术等先进手段进行检测，能够及时发现和控制病毒病的传播。
而一些偏远地区和小农户则由于技术设备和资金等方面的限制，对病毒病的检测工作较为薄弱，存在一定的滞后性。
当前，内蒙古自治区农业部门和科研机构正在加大对马铃薯病毒病检测技术的研究和推广力度，以提高相关工作人员的技术水平和检测手段的先进性，促进病毒病的早期发现和有效防控。
为了更好地保护内蒙古自治区马铃薯种植业的健康发展，有必要加强对马铃薯病毒病的检测工作。
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测内蒙古自治区位于中国北部，地处东经97°37′～126°03′，北纬37°21′～53°23′之间。
内蒙古自治区境内气候寒冷干燥，适宜种植马铃薯。
马铃薯是内蒙古自治区重要的经济作物之一，由于病毒病的危害，给马铃薯的种植和产量带来了严重的影响。
对马铃薯病毒病进行及时、准确的检测成为保障马铃薯生产的重要环节。
马铃薯病毒病是由一系列不同类型的病毒引起的，这些病毒会影响马铃薯植株的生长和结果，导致产量降低和质量下降。
常见的马铃薯病毒病有马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒等。
这些病毒通过昆虫传播、种薯传播、植物残体传播等方式进行传播，一旦发生病毒病，往往难以根治，及时进行病毒病的检测至关重要。
内蒙古自治区对马铃薯病毒病的检测工作十分重视，通过不断提升检测技术和加强管理措施，已经取得了一定的成效。
下面我们将从马铃薯病毒病的检测方法、检测流程和检测技术等方面对内蒙古自治区的马铃薯病毒病检测工作进行介绍。
一、马铃薯病毒病的检测方法内蒙古自治区对马铃薯病毒病的检测主要采用的方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、免疫荧光法、生物学检测等。
这些方法各有优势，可以根据实际情况和需求进行选择和应用。
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种比较常用的病毒检测方法，它主要通过病毒蛋白与抗体的特异性结合来实现病毒的检测，具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，适用于大批量样品的检测。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种基因扩增技术，可以在样品中特异性地检测出马铃薯病毒病的病毒基因序列，具有高灵敏度、高特异性和快速、准确等优点，适用于病毒的早期诊断和鉴定。
3. 免疫荧光法：免疫荧光法主要通过荧光标记的抗体与病毒蛋白发生特异性结合，再通过荧光显微镜观察病毒的存在和分布，具有高灵敏度、高特异性和快速等优点，适用于病毒的直接检测和观察。
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测
内蒙古自治区马铃薯病毒病的检测马铃薯病毒病是一种严重危害马铃薯生产的病害，由于其易传播、难治愈的特点，极大地威胁了马铃薯产业的发展。
因此，对马铃薯病毒病及时、精准、快速的检测，对预防和控制该病害具有重要意义。
马铃薯病毒病的症状与检测方法：马铃薯病毒病是由多种病毒引起的病害。
常见的病毒有马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯病毒S、马铃薯镰刀病毒等。
根据不同的病毒，马铃薯病毒病的症状也会有所不同。
在马铃薯生长期间，易出现黄化、疮斑、变形、裂缝、枯死等症状，严重影响着马铃薯的产量和质量。
因此，对病株进行检测，及早发现病毒，有利于采取相应的防治措施，保障马铃薯产业的健康发展。
传统的马铃薯病毒病检测方法采用ELISA、PCR等分子生物学方法。
其中，ELISA检测方法依靠抗体和抗原的结合反应，通过检测样品中的病毒抗原，来判断样品是否感染马铃薯病毒。
而PCR检测方法，则是通过扩增样品中的特定DNA序列，利用特异性杂交探针等手段来诊断样品是否感染马铃薯病毒。
优势与不足ELISA检测方法准确性高、速度快、操作简单等优点广受研究人员的青睐。
但ELISA检测法也存在缺点：1）过程繁琐，操作技能要求高；2）ELISA试剂的价格相对较高，总成本较PCR较高；3）ELISA技术难以对感染病毒抗原含量极低的样品进行检测，且检测结果受到环境干扰较大。
PCR检测方法则具有灵敏度高、特异性好、快速且可靠、可以批量同时检测样品等优点。
同时，PCR技术已经逐渐发展成一种可视化的方法，如荧光PCR、喷墨PCR、金纳米探针PCR等，进一步提高了PCR检测的准确性和便利性。
但PCR检测方法也存在一些问题，比如通过PCR检测无法判断样品中所含病毒是否具有致病性，而且PCR扩增反应容易受到样品质量和环境因素的干扰，会导致假阳性或假阴性结果的产生。
综上所述，不同的检测方法各有优缺点，应根据实际情况，选用适合的方法开展病毒检测。
未来发展趋势传统的检测方法虽然已经取得了一定的进展，但还存在一些问题，比如针对新发现的病毒进行检测的问题。
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马铃薯病毒种类及主要病毒检测方法作者：罗燕娜，刘江娜，王航来源：《新疆农垦科技》 2015年第3期罗燕娜，刘江娜，王航（兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠831300）收稿日期：２０15—01—20摘要：本文对北疆地区马铃薯主要病毒的特性和致病症状进行了描述，并简要介绍了马铃薯主要病毒的检测技术。
关键词：马铃薯；病毒；检测方法马铃薯在我国广泛种植，已成为仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。
由于光照强、昼夜温差大、气候冷凉等优势，新疆北疆沿天山一带的昌吉州、乌鲁木齐、昭苏、新源等地都非常适宜种植马铃薯，现种植面积已达2310hm2[1]。
然而在当前的马铃薯生产中，病毒病发生普遍而严重，成为制约马铃薯产业发展的主要障碍，是生产上亟待解决的突出问题[2]。
目前，已报道的马铃薯病毒种类超过25种、类病毒1种，其中，侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。
主要检测的马铃薯病毒有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）[1]。
1马铃薯主要病毒种类及致病症状1.1马铃薯X病毒（PVX）X病毒又称普通花叶病毒，病毒粒子为长杆状，大小为515nm×13nm，基因组全长6.4kb[3]。
该病毒可通过叶片汁液摩擦传播，也可通过蚜虫以非持久性方式传播，还可通过种薯传播[1]。
感病植株症状多种多样，因栽培品种的敏感性不同和病毒株系的不同而存在差异，多数表现为轻花叶或潜隐症状，症状严重的则表现为严重的花叶或皱缩，产量损失可达50%。
1.2马铃薯Y病毒（PVY）Y病毒又称为重花叶病毒，病毒粒子形状为弯曲的线形，大小为750nm×11nm，多数通过桃蚜和大戟长管蚜传播。
PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYC）和马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）。
前2个株系组引起的主要初期症状是叶片坏死、斑驳，后期则表现为矮化、皱缩、斑驳和卷曲；第3个株系组初期表现为不同程度的花叶，后期为花叶和斑驳，当温度低于10℃或高于25℃时，花叶症状消失。
产量损失最高可达80%。
通常该病毒不会引起块茎发病，但近年来欧洲出现的一个新株系PVYNTN，则可在块茎上导致坏死环斑[4]。
1.3马铃薯A病毒（PVA）A病毒又称为轻花叶病毒，病毒粒体为弯曲的线形，大小为730nm×15nm，基因组全长9.7kb。
该病毒可通过汁液摩擦传播或由蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯传播。
感病植株的症状表现为脉间花叶、叶片有光泽、叶脉深陷和叶边缘粗缩，产量损失可达40%。
1.4马铃薯S病毒（PVS）S病毒又称为潜隐性花叶病毒，病毒粒子形状为线形，大小为650nm×12nm，病毒基因组全长7.4kb。
可通过汁液摩擦传播，也可通过蚜虫传播。
感病植株初期症状不明显，严重危害时，叶片呈青铜色，叶脉轻微下陷，植株的开张度较大。
一些品种上会出现坏死斑和条纹。
在田间常与其他病毒混合侵染，当与PVX或PVM病毒混合侵染时，可减产20%~30%[5]。
1.5马铃薯M病毒（PVM）M病毒也属于香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）。
病毒粒子为线形，大小为650nm×12nm，该属病毒基因组全长8.5kb。
可通过机械传播，或者通过蚜虫以非持久性方式传播，也可通过种薯的调运远距离传播。
感病植株叶上表面的叶脉深陷，有的出现粗缩，叶片轻微下垂，顶部叶片呈开散状。
1.6马铃薯卷叶病毒（PLRV）PLRV属于马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus），病毒粒子为六边形等轴对称，直径24nm~26nm，基因组全长5.9kb。
主要由蚜虫传播，也可通过种薯传播。
感病植株发病较轻时表现为幼叶褪绿、卷曲，叶基常有紫红色边缘。
发病较重时，植株矮化，叶片上卷并革质化，产量损失可达70%[1]。
2马铃薯病毒检测方法因马铃薯茎尖脱毒培养过程中各环节都会有误差，所以在茎尖苗扩繁之前必须对马铃薯苗进行严格的病毒学检测，确定不带病毒后才能进一步扩繁。
除此之外，还必须抽样检查以下几种情况：瓶苗下地之前、组培苗扦插结束、试管薯出苗后30~40d、现蕾期至盛花期、收获前30d左右、收获后和种薯出库前。
因此，在马铃薯脱毒种薯培育过程中，准确可靠的病毒检测方法与高效的脱毒方法同等重要[6]。
目前，北疆地区常用的马铃薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法（双抗体夹心法（DAS-ELISA））。
该检测方法的主要操作过程有以下几步。
2.1准备工作实验前，在设计图表上注明各反应孔的位置，以避免出错。
在密封塑料盒底部铺1张吸水纸，倒入适量蒸馏水使之刚好润湿，即为恒湿箱，孵育用。
微孔板为可拆卸，根据用量取出所需数量的微孔，未使用完的微孔密封好，4℃下保存。
2.2样品的提取及稀释尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验。
使用通用样品提取缓冲液来碾磨稀释样品。
若用研钵提取样品，在每份样品提取后彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染。
将样品与通用样品提取缓冲液以1∶10（样品重量（g）∶提取缓冲液体积（mL）的比例研磨样品。
每个反应孔需要100μL的样品提取稀释液。
多制备一些样品提取稀释液以利于吸取。
2.3点样根据实验设计，取100μL样品提取稀释液到各样品孔中，取100μL阴性质控物溶液到阴性对照孔中，取100μL阳性质控物溶液到阳性对照孔中。
2.4准备酶标结合物检测抗体和酶标抗体均为浓缩液体，应根据标签上的稀释倍数用ECM缓冲液稀释。
根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物和检测抗体（瓶A和瓶B）加到1倍的ECM缓冲液中，混合均匀。
1μL的检测抗体稀释液可供8个反应孔使用，10μL的酶标记物稀释液可供96个反应孔使用。
2.5洗板孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出，加入250μL的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复7次，将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。
2.6加酶标结合物在各反应孔中加入100μL配置好的酶标结合物溶液。
2.7孵育室温下（25℃）在恒湿箱中孵育2h。
2.8PNP底物的制备孵育结束前15min制备PNP底物溶液。
在室温下用5mLPNP缓冲液溶解1片PNP底物片。
每片PNP底物片可溶解成5mL的底物溶液，溶解比例为1mg/mL，可供40个反应孔使用。
在室温下用5mLPNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。
2.9洗板、加PNP底物溶液洗板步骤同2.5，重复8次。
在各反应孔中加入100μLPNP底物溶液。
2.10孵育在恒湿箱中孵育60min，避免阳光直射或强光照射。
2.11结果分析直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果。
阳性结果：微孔中有明显颜色变化；阴性结果：微孔中没有明显颜色变化。
只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。
结果可保持1h左右（只要阴性质控孔不发生颜色变化）。
3结语建议种薯加工企业在3个环节上进行质量检验：（1）核心种苗必须进行病毒检测，检测方法可采用DAS-ELlSA。
（2）田间检验。
全部植株目测检查3次，目测不能确诊的非正常植株采集样本进行实验室检验，种薯每批次至少随机抽检5~10点，每点100株，各指标可参照GB18133-2012标准[7]。
（3）块茎检验包括收获后检测和库房检验，原原种每个品种每100万粒检测200粒，大田每批种薯根据生产面积确定检测样品数量，种薯出库前应进行库房检查，抽样及检验样品数量参照GB18133-2012标准，并采用目测法检测窖藏病害及混杂等情况。
目前，应用于马铃薯病毒的免疫学检测技术以ELISA技术最成熟，应用最广泛。
多年来，这项技术被不断改进和创新，现已形成直接酶联检测法、间接酶联检测法（I-ELISA）、双抗体夹心法（DAS-ELISA）、三抗体夹心法（TAS-ELISA）等多种检测方法[8]。
双抗体夹心法（DAS-ELISA）与其他检测方法相比较，有突出的优点：一是灵敏度高，检测浓度可达l~10ng/mL；二是快速，几个小时内即可出结果；三是专化性强，重复性好；四是检测对象广，粗汁液或提纯液都可检测，一般不受抗原形态的影响，无论是完整的还是降解的病毒粒体都可检测；五是可处理大批样品，适合种薯生产中大量样品的多种马铃薯病毒的快速检测。
但也存在一些缺点：检测病毒时会出现假阳性反应，准确性降低；病毒浓度低，当年不显症时无法检测；无法检测类病毒。
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