腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究

腹泻儿童及灵长类动物肠道病毒宏基因组学研究腹泻是全球重要的公共卫生问题,是感染性疾病中引发死亡的第三位病因。急性腹泻在儿童群体内属于常见病和多发病之一,在发展中国家急性腹泻是导致婴幼儿死亡的主要主要病因之一,其致病因素主要为寄生虫、细菌和病毒感染。

随着抗生素的发现和有效使用,加上水源供应和公共卫生条件的改善,寄生虫和细菌感染所导致的腹泻类疾病得到了有效控制,而病毒性腹泻大多没有有效控制和治疗方法,引起人们越来越多的关注。人类及动物消化道中存在庞大的病毒群落,这些病毒绝大多数是未知的。

目前,人类对于新型病毒性腹泻仍然没有特殊的有效防治措施。因此,人类想要真正克服新型病毒导致的传染性疾病,只有通过有效的方法提前发现潜在的致病性新型病毒,在此础上对新型病毒进行基因组结构、流行病学、疫苗研究和治疗性抗体开发等方面进行深入研究,从而为病毒性腹泻防控、临床诊疗等提供理论基础和技术支持。

病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)是一种新型的病毒分子生物学检测技术,该技术的创立和发展是基于宏基因组学(metagenomics)理论,结合现有的分子病毒学检测方法开创的一个新的宏基因组学分支。该研究技术突破了传统方法的局限,直接以临床样本中的所有病毒核酸为研究对象,有效地避开了病毒细胞培养、血清病毒抗原／抗体检测和基于病毒已知序列的PCR扩增；病毒宏基因组学方法不仅能够开速检测出样品中存在的已知病毒,更为重要的是该方法还能够有效的检测出新型及未知病毒；从而可以在获得病毒基因序列的基础上解析临床标本中的病毒群落的组成甚至是病毒滴度,实时监控特定病毒动态变化及分布,揭示新型或未知致病性病毒与特定疾病之间的关联性,对于临床诊治新型或未知

病毒所致疾病具有重要的理论和现实意义。

灵长类动物与人类不仅体质特征很相似,而且社会行为也很相近,灵长类动物体内可能携带诸多人畜共患病病原体。因此,本研究采用病毒宏基因组学方法分析比较腹泻儿童及灵长类动物群体粪便中病毒群落的差异并挖掘潜在的新型腹泻相关病毒,研究结果对于病毒性腹泻的诊断、治疗及疾病暴发的防控具有重要的实际意义。

本研究主要内容和结果如下：(一)腹泻儿童肠道病毒群落的组成构建儿童腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。结果显示儿童肠道病毒群落的组成包括：杯状病毒科(Caliciviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),呼肠孤病毒科(Reoviridae),噬菌体,细小病毒科(Parvoviridae),指环病毒科(Anelloviridae)及未分科病毒和少量的其他病毒。

病毒群落分析提示：(1)尽管健康对照组儿童粪便样品中病毒多样性与腹泻组无明显差别,但病毒滴度显著低于腹泻组样品。(2)腹泻组和健康对照组所有文库均为杯状病毒阳性,但腹泻组病毒滴度显著高于健康对照组。

(3)星状病毒不是本研究腹泻群体的主要病因。(二)腹泻灵长类动物肠道病毒群落的组成构建灵长类动物腹泻及健康对照组肠道病毒组基因文库,通过Miseq高通量测序结合生物信息学调取文库中所有可能的病毒基因,分析病毒群落的组成。

结果显示灵长类动物肠道病毒群落的组成包括细小病毒科(Parvoviridae),帚状病毒科(Virgaviridae),腺病毒科(Adenoviridae),微小RNA病毒科(Picornaviridae),噬菌体,双生病毒科(Geminiviridae)病毒,圆环病毒科

(Circoviridae),修道院病毒科(Closteroviridae),二顺反子病毒科(Dicistroviridae),传染性软腐病病毒科(Iflaviridae),星状病毒科(Astroviridae),番茄丛矮病毒科(Tombusviridae), 杯状病毒科(Caliciviridae)及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示：(1)腹泻组病毒群落的组成和病毒滴度与健康对照组无明显区别。

(2)灵长类动物腹泻粪便中可以感染哺乳动物的病毒主要为细小病毒和圆环病毒,但病毒滴度在两组之间无明显差异。(3)最近发现的picobirnaviridae病毒在灵长类动物肠道中广泛存在。

(4)星状病毒不是本次研究的灵长类动物腹泻的主要病因。(5)灵长类动物肠道内植物病毒种类多且病毒滴度高。

(三)儿童与灵长类动物肠道病毒群落的比较本研究比较儿童与灵长类动物肠道病毒群落的组成,结果提示：(1)灵长类动物肠道病毒组成的多样性高于儿童肠道病毒群落,灵长类动物肠道内病毒群落可以分为15个主要病毒科或者病毒种类,而儿童肠道病毒群落主要为9个病毒科或病毒种类组成。(2)灵长类动物肠道病毒群落中植物病毒占多数,而儿童肠道病毒群落内感染哺乳动物的病毒占多数。

原因可能是由儿童和灵长类动物的食物谱不同造成的。(3)总体上灵长类动物肠道内的病毒滴度高于儿童肠道内病毒。

(四)儿童及灵长类动物肠道内新型病毒及腹泻相关病毒的鉴定(1)腹泻相关的新型星状病毒本研究在儿童肠道病毒群落中发现了2种不同的新型星状病毒(HAstV-JS1和HAstV-JS2),而在灵长类动物中发现了1种新型星状病毒(MAstV-JS)。序列比对及系统进化分析表明本研究中3株星状病毒与GenBank

中星状病毒毒株没有近源毒株,说明该3株星状病毒毒株为新型星状病毒。

基于该3株毒株的特异性引物进行PCR检测表明HAstV-JS1在腹泻儿童群体的阳性率为12.20%,健康对照组样品均为阴性。HAstV-JS2在腹泻群体内的阳性率为10%(9/90),健康对照组样品均为阴性。

MAstV-JS在腹泻灵长类动物群体的阳性率为3。5%(2/58),健康对照组均为阴性。

提示本研究发现的3株新型星状病毒与腹泻有一定的相关性。(2)腹泻相关的诺如病毒本研究在腹泻儿童及灵长类动物群体的粪便样品中检测除了多个诺如病毒毒株。

通过Geneious软件de novo组装成4个完整的基因组(NoV-JS1、NoV-JS2、NoV-JS3和NoV-JS4)。4株诺如毒株与GenBank之前发现的毒株在核苷酸水平相似度大于95%,系统进化分析显示NoV-JS1与广州地区分离NoV毒株(KC894943)聚类,NoV-JS2与NoV-JS1所在的聚类群同处在同一个聚类群；NoV-JS3与另外1株广州分离的NoV毒株(KF989075)紧密聚类；NoV-JS4与我国荆州地区的

NoV(KF306214)紧密聚类。

提示江苏地区腹泻儿童群体内有3种不同的NoV在儿童群体流行。利用Geneious软件在灵长类动物肠道病毒群落中拼接l株诺如病毒全基因组序列。

序列比对显示该株诺如毒株与GenBank中提交的唯一1株灵长类动物的calicivirus序列相似度为85%；PCR检测发现腹泻灵长类动物粪便标本该病毒阳性率为10%,说明该杯状病毒可能与灵长类动物的腹泻有相关性。(3) Picornaviridae与Picobirnaviridae本研究显示,在儿童腹泻病毒群落

中,picornaviridae与儿童腹泻有一定的相关性。