《生物制药工程》实验指导书

实验一甲壳质、壳聚糖的制备

【实验目的】

了解制备甲壳质、壳聚糖的工艺流程；

掌握甲壳质的提取、制备原理及壳聚糖的检测方法。

【实验原理】

甲壳质存在于甲壳类动物(如虾、蟹)的外壳，昆虫表皮，软体动物(如贝类、乌贼)的器官、菌类(如菇类、霉菌)的细胞壁。自然界每年合成量高达100亿吨，仅次于植物纤维素。甲壳质是1823年法国科学家Odier首次从蟹壳中提取出来的，由于甲壳质的性质非常稳定，溶解性很差，限制了它的应用。经一个多世纪世界各地科学家对它在结构上进行改良、修饰，并开发应用研究，它的衍生物壳聚糖在工业、农业、畜产、渔业、食品、化妆品及医药行业上得到广泛应用，尤其是近十多年来，壳聚糖的动物试验及临床观察得到科学家们的肯定，誉为人类第六生活要素(蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和壳聚糖)。是一种功能性食品。

从虾壳提取甲壳质，工艺主要是将虾壳的成份分离，虾壳中含有无机盐(主要为碳酸钙)蛋白质和甲壳质。利用碳酸钙能溶于盐酸的机理，将其离析。蛋白质在碱性条件下能被水解生成短肽及氨基酸，它们能溶于水，与甲壳质分离。本实验首先采用盐酸浸泡虾壳除去钙质，接着利用氢氧化钠煮沸除去蛋白，之后水洗；用高锰酸钾与硝酸氧化脱色干燥得白色制品为甲壳质。

甲壳质在碱性条件下脱去乙酰基，生成聚胺糖。工业上很难100％脱去乙酰基，所以工业制得的实际上是甲壳质和聚葡胺糖两个结构单元的结合，称为壳聚糖。壳聚糖结构中有胺基(－NH2)，具碱性，因此，它能溶于很多酸，如硫酸、盐酸、胃酸等，可以用游离氨基含量的来检测乙酰基的脱去程度。

【仪器、材料与试剂】

1实验材料与试剂

虾壳；

3％~4%的氢氧化钠；50％的氢氧化钠；5％~6%的盐酸；5%的高锰酸钾；1%的硝酸；1mol/L 的盐酸；0.1mol/L的氢氧化钠；溴酚兰指示剂。

2仪器设备

烧杯1000mL；三角瓶500mL；三角瓶100mL；大试管夹；水浴锅；烘箱；碱式滴定管；铁架台；磁力搅拌器；电炉等。

【实验步骤】

1虾壳处理：将虾壳洗净，粉碎，称重。

2甲壳质制备：

用5％~6%的盐酸于室温（20℃）浸泡虾壳24小时，不断搅拌。盐酸体积（ml）与虾

克重量（g）比为10（V/W=10）；

取沉淀水洗3次后加入3％~4%的氢氧化钠（V/W=10）煮沸1~2小时，取沉淀水洗；

加0.5%的高锰酸钾搅拌反应约1小时，沉淀水洗;

再加入1%的硝酸于60℃~70℃反应30~40分钟，产物水洗、干燥、称重。

3壳聚糖的制备：

于烧瓶中加入上述甲壳质10克再加入90-100ml的浓度为10％的NaOH，沸水浴反应30-40分钟后，停止反应干燥称重。

4 游离氨基含量的测定：

方法1：精确称取壳聚糖0.30克，置于20ml的锥瓶中，移取30ml0.1mol/L的盐酸溶液，室温下溶解（若粘度太大可加少许蒸馏水）。加入2滴溴酚兰指示剂，以0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定至紫色，平行滴定三份，按下式计算游离氨基含量：

方法2：采用分光光度法检测壳聚糖的含量，检测壳聚糖的含量/纯度（选做）。【结果与分析】

计算甲壳质的提取率和游离氨基含量并分析与理论值之间的差异。

【思考题】

甲壳质的提取过程中用了哪些试剂，各起到了什么作用？

实验二液体发酵法生产链霉素（选做）

【实验目的】

1、学习液体发酵的方法；

2、学习链霉素的发酵方法及抗生素的检测和鉴定方法。

【实验原理】

瓦克斯曼（Selman A. Waksman）于1943年分离到一株灰色链霉菌（Streptomyces griseus），能产生对革蓝氏阳性细菌和蓝氏阴性细菌都有抗菌作用的一种新的抗生素－链霉素。链霉素和其它抗生素一样氏微生物的次级代谢产物。链霉素属于氨基糖苷类抗生素。

灰色链霉菌在下述条件下产生链霉素。对细胞足够的供氧；存在低浓度无机磷酸盐；足够的葡萄糖和足够高浓度的含氮物质。

在发酵培养基上，链霉素的发酵分3个阶段：生长阶段，菌丝形成，需氧量极大，在两天内形成链霉素不多；成熟阶段，菌丝及重量保持稳定，葡萄糖及其他碳源在培养基中消失，形成链霉素；老化阶段，有许多链霉素形成，然后链霉素产生停止，浓度下降，pH 上升，菌丝自溶，需氧量减少，此时停止发酵。

在中性溶液中，链霉素成为3价阳离子故可用阳离子交换树脂吸附，然后进行洗脱和收集。二次洗脱液要通过高交联度的氢型树脂，以除去阳离子、无机杂质和小分子的有机杂质。精制液用硫酸或氢氧化钡调至pH4.5～5.0，再加入适量的活性碳，常温下脱色，可得到链霉素精制液。

纸层析是鉴别抗生素的方法之一，常用8个溶剂系统进行纸层析，层析后进行生物显色并绘制层析图谱，根据层析图谱对未知抗生素进行鉴定。本实验采用其中一个溶剂系统，并用标准链霉素溶液作为对照对发酵液进行鉴定。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1、5L发酵罐

2、恒温摇床

3、冷冻离心机

4、高压灭菌锅等

（二）材料

1、灰色链霉菌Streptomyces griseus AS 4.1095（链霉素产生菌，中国菌种保藏中心）

2、大肠杆菌E.coli K12S（用于生物显色）

3、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,用于生物显色）

4、豌豆

5、正丁醇

6、三角瓶（50Ml）

7、新华3号滤纸

8、层析缸（30cm×10cm）

9、搪瓷盘（25cm×15cm×5cm）

10、毛细管

11、培养皿

（三）试剂

1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.4～7.6，121℃高压蒸汽灭菌30min

2、豌豆培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，豌豆提取液1L（以NH2计，100mL含12～14mg），pH7.0～7.2。高压蒸汽灭菌（105℃，30min）

3、查氏培养基

4、链霉素标准溶液（10mg/mL）：将链霉素溶于去离子水中，无菌滤膜过滤后备用

5、展层溶剂系统：水饱和的正丁醇

【实验步骤】

1、斜面孢子的制备

用接种环挑取冰箱中保藏的菌种接种于豌豆培养基斜面培养基上，于27℃恒温培养箱中培养6～7d，即可得到斜面孢子。

2、母瓶培养液的制备

用接种环挑取斜面培养基表面上的孢子接种于灭菌的含有50mL豌豆培养基的三角瓶中，于27℃摇瓶200r/min培养72h即成母瓶培养液。

3、种子培养液的制备

无菌操作取2mL母瓶培养液接种于含有100mL豌豆培养基的三角瓶中，于27℃恒温摇床200r/min培养3～4d。

4、发酵培养

（1）三角瓶发酵培养：

取4mL种子培养液接种于含有200mL豌豆培养基的500mL大三角瓶中，于28℃恒温摇床200r/min培养12～15d进行链霉素发酵。

（2）发酵罐发酵培养：

在5L发酵罐中装入3L豌豆培养基，灭菌后接入60mL种子培养液，在控制条件下进行链霉素发酵。

5、发酵液预处理

发酵结束后，将发酵液在低温条件下12000r/min离心，上清即为含有链霉素的样品，如果不进行链霉素的分离纯化，可直接对发酵液进行抗生素抑菌实验和纸层析生物显色分析鉴定。