放线菌新种分类鉴定

III IV
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菌体的收集制备
待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏
水洗涤两次，菌体于-80℃冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌 体，冻干菌体4℃干燥器保存备用。 醌的提取及纯化
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D. 脂肪酸测定
放线菌细胞中脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团具 有分类学意义，是一项重要的分类特征。 脂肪酸组份一般较为复杂，分别归属3种类型： 直链饱和与不饱和、分枝和复杂形式的脂肪酸。
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实验流程：
点样 （距离底边2*2cm，点样10μl，溶剂前沿1cm）
展层 （展层液：第一层： 氯仿:甲醇:水=65:25:4 第二层: 氯仿:甲醇:乙酸:水=80:12:15:4 ）
显色 （6种显色剂）
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C. 甲基萘醌测定
大多数细菌含有甲基萘醌或泛醌，或两者均有。包
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2.3.2 化学分类
A B C D
细胞壁化学组分 磷酸类脂测定 甲基萘醌测定 脂肪酸测定
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A.细胞壁化学组分
放线菌的细胞壁主要成分为肽聚糖，根据肽聚糖 分子中肽链第3位氨基酸的种类，种间肽桥和邻近的 四肽交联的位置来决定放线菌细胞壁型的划分。 Lechevalier等（1976）根据放线菌细胞壁的化学组 分和全细胞水解液糖型，将放线菌归为9个主要类群
表观特征
2.3 鉴定方法
化学分类
基因型分类
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2.1 分离方法
近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用 于稀有放线菌选择性分离的方法。
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2.2 16SrRNA基因序列测定
放线菌基因组的提取
放线菌新种分离鉴定
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实验目的 实验方法
3
4
实验结果
总结
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1、实验目的
本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、 生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴 定，证明其是以前从未发现的新种。
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2、实验方法
2.1 分离方法
2.2 16SrRNA基因序列测定
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a. pH、盐浓度和温度耐受性
pH耐受实验
在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28℃ 培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
温度耐受实验
将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4℃、10 ℃ 、16 ℃ 、20 ℃ 、
28℃、37℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
e. 牛奶凝固与胨化
将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。 若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解
成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。
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f. 硝酸盐还原试验
将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、 3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。 培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、
阳性。
如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。 若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。
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c. 淀粉水解
将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时， 在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。
滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色，
或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色， 表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明 产生淀粉酶水解淀粉。
代表属
Sterptomyces Micromonospora Actinomadura Nocardia Actinomyces Oerskovia Agromyces Bifidobacterium Mycoplana
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放线菌全细胞的主要糖类型（Lechevalier，1976）
磷脂酰甲基乙醇胺（phosphatidyl methyl ethanolamine,PME）
磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline, PC） 磷脂酰甘油（phosphatidyl glycerol ,PG） 含葡萄糖胺的未知结构磷酸类脂（phospholipids of unknown structure containing glucosamine, GluNu）
盐耐受实验
高氏一号培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，
15%，20%)28℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
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b. 明胶液化
取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白
对照。于28°C培养箱中培养。 培养2、7、10、14和30天的试管，放入4°C冰箱或置于 冷水中30min，然后进行观察。 如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解
个，常常作为属的分类鉴定标准之一。
ห้องสมุดไป่ตู้
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HPLC实验：
实验条件：1.0ml/min 37°C 柱子：C18反相柱 溶剂：12%甲醇 20mM磷酸三乙胺（pH5.1）
括放线菌在内的革兰氏阳性细菌只含甲基萘醌。 放线菌及有冠军的甲基萘醌异戊烯侧链长度和氢饱 和度变化相当大，多为部分饱和，含有7-12个异戊烯 单位。
放线菌目中不同菌属的甲基萘醌类型如下表所示。
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放线菌目中甲基萘醌类型
类型
Eubacteria （异戊烯单位无氢化）
Mycobacterium （主要是8或9个异戊烯 单位上被2或4个氢化） Saccharomonospora （4氢化的多烯萘醌） Streptomyces （具有同一链长，但氢 饱和度不同的萘醌）
糖类型
A B C D E
主要成分
阿拉伯糖，半乳糖 马杜拉糖 无特征性糖 木糖，阿拉伯糖 半乳糖
代表属、种
Nocardia Actinomadura Streptomyces Micromonospora Kutzneria viridogriseum
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全细胞TLC分析实验流程： 全细胞糖分析
14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的
生长情况及可溶性色素。
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C. 生理生化实验
生理生化特性的测定主要包括: pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶 的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑 色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。
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萘醌种类
I
II
aMK-7 Bmk-9
aMK-8(H2) bMK-8(H4) cMK-9(H2) dMK-9(H4) aMK-8(H4), MK-9(H4) bMK-9(H4),MK-10(H4) aMK-9(H2), MK-9(H4),MK-9(H6) bMK-9(H4), MK-9(H6),MK-9(H8) cMK-10(H4),MK-9(H6)
Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB3型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。
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B. 培养特征
参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述 所采用的标准培养基进行培养特征测定。 所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、 马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28℃培养7，
层析 显色 （0.4%茚三酮试剂）
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B. 磷酸类脂测定
磷酸类脂位于放线菌细胞膜上，属于极性脂。不同属菌的磷酸类脂 组份是不同的，它是鉴别属的重要特征之一，是化学分类项目中不可
缺少的分类指征。磷酸类脂的种类繁多，但用于分类的指征并不多。
用于分类指征的磷酸类脂只有五种： 磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine,PE）
16SrRNA基因扩增
胶回收 连接 转化 测序研究
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2.3.1 表观特征
A B C
电镜观察 培养特征 生理生化特征
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A. 电镜
取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。 酒精梯度脱水，在30%、50％、70％、80%、100％依次脱 水，其中100％酒精2次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。
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A. G+C%含量分析
DNA 碱基组成比例（G+C mol%）是十分典型的基因指征之一， 一般认为 G+C mol%在种内相差不会超过 3%，在属内不会超过 10%。
大量分析结果表明：放线菌属于高 GC 含量的微生物，并且
G+C%变化范围小，最多不会超过 30%。由于 G+C%在不同物 种中均是比较恒定的，因此可作为诸多分类指征中不可或缺的一
和4个糖型。
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放线菌细胞壁的主要构成（Lechevalier，1976）
胞壁类型
I II III IV V VI VII VIII IX
主要组成
L,L-DAP，甘氨酸 Meso-DAP，甘氨酸 Meso-DAP Meso-DAP，阿拉伯糖，半乳糖 赖氨酸，鸟氨酸 赖氨酸（天冬氨酸，半乳糖） DAB，甘氨酸 鸟氨酸 Meso-DAP， 多种氨基酸
氮源: KNO3，NaNO2，尿素， (NH4)2SO4，丝氨酸，烟酰胺，酪氨 酸， DL-天冬氨酸，L-甲硫氨酸，DL-丙氨酸，L-精氨酸，L(+)-谷氨
酸，甘氨酸，L-苯丙氨酸，腺嘌呤。
不同氮源按0.5%的浓度加入，培15天后，将各种氮源上的生长状况 与不加氮源的基础培养基上的生长状况作比较。
h. 黑色素的产生
将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观 察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。
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i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）
碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖， I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。 不加碳源的基础培养基作为阴性对照。
玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1，
2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在， 硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐 都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。
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g. H2S的产生
某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢
气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用 生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。
脂肪酸分析应在标准化的条件下进行，因为不同组分的相对
含量因菌龄和培养条件的不同而异。 脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分 析可为种和亚种分类提供有用的基本资料。
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2.2.3 基因型分类
A
G+C%含量分析
B
DNA-DNA分子杂交
C 16srRNA基因序列分析及进化树的构建
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细胞磷脂的提取
称取1g湿菌体于带螺口的40 ml离心管中。
加入15ml甲醇。
100℃水浴10 min，自然冷却。 加入10 ml氯仿和6 ml 0.5%NaCl。 用力摇匀10 min，静止可看到分层。 8000 rpm，离心10 min。 到入分液漏斗静止分层，取下层。 30-40℃旋转蒸干。 分两次各加入200μl氯仿/甲醇（2:1）冲洗器壁。 液体移入EP管（约100-200μl）,8000 rpm，离心10 min，去沉淀。 4℃保存备用。
菌体培养与收集 细胞水解 （0.1ml 0.5mol/L HCl） 点样 （0.6-0.8μl水解液和1% 的标准糖液） 层析 显色 （苯胺邻苯二甲酸试剂）
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氨基酸分析
菌体培养与收集 细胞水解 （0.1ml 6mol/L HCl） 点样
（氨基酸水解样品0.4μl 和0.01mol/L标准氨基酸 混合液0.2μl）
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d. 脲酶的产生
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变 为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存 在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，
培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红 色为阳性。