如何解析蛋白质的空间结构？

二、蛋白质纯度的鉴定
• 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法： • （1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛细 管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下 进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳 图谱只呈现一个条带(或峰)。 • （2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单 一的沉降速度移动
3. Lowry法(Folin-酚法)
• Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。 • 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及 酒石酸钾钠组成。 • 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴 等组成。 • 机理：蛋白质中的肽键在碱性条件下， 与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫 红色络合物（组成不清楚）。
Lowry法
的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。
（四）蛋白质的紫外吸收
由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸
和色氨酸，因此在 280nm 波长处有特征性吸收
峰。蛋白质的 OD280与其浓度呈正比关系，因此
可作蛋白质定量测定。
（五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction)
蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚
通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白
质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。
电泳的类型
目前电泳的类型 很多， 最常见的 是区带电泳，由 于在支持物上电 泳时蛋白质混合 物被分离成若干 区带而得名。
• 区带电泳按其支持物的物理性状不同可 以分成几类： • ① 滤纸电泳和薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜 电泳和聚酰胺薄膜电泳)；
4. 紫外吸收法
• 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的 苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收 紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。 在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (A280)与其含量呈正比关系，可用作定量测 定。
紫外吸收法的优缺点：
• 优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰 测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中 ( 特 别是在柱层析分离中)广泛应用。 • 缺点： • (1) 对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色 氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差， • (2) 若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的 物质，会出现较大的干扰。
总蛋白质含量测定有两类方法： 1、利用蛋白质的物理性质，如折射率、比重、 紫外吸收等测定。 2、利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯 氏定氮、双缩脲反应、 Folin- 酚试剂法 ( 又名 Lowry法)。 这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定 蛋白质含量，可根据实验要求及实验室条件进 行选择。原理都是利用蛋白质的成色反应或紫 外吸收的性质，通过分光光度法来测定。
• ② 粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素 粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和， 铺设成平板；
• ③ 凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙 烯酰胺和琼脂糖凝胶，前者适于分离蛋 白质和多核苷酸，后者适于分离核酸， 这两种凝胶电泳的分辨率都很高，
—
-
+
+
双向电泳 (twodimensional electrophoresis)
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可达
100 万之巨，其分子的直径可达 1 ～ 100nm ，为
胶粒范围之内。
* 蛋白质胶体稳定的因素： • 颗粒表面电荷(电荷层）
• 水化膜
水化膜 + + + +
在等电点的蛋白质 脱水作用
+
+ +
酸 碱
碱 酸
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
带正电荷的蛋白质 脱水作用
物活性的丧失。
• 变性的本质 —— 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋 白质的一级结构。 • 造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、 重金属离子及生物碱试剂等 。
• 应用举例
临床医学上，变性因素常被应用来消毒及
灭菌。
此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白
质制剂（如疫苗等）的必要条件。
6. 胶体金测定法
• 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体，呈洋 红色，遇蛋白质转变为蓝色，颜色改变与 蛋白质有定量关系，是几种方法中灵敏度 最高的，检测量是ng水平。
7. 某一特定蛋白质的含量测定
• 通常要用具有高度特异性的生物学方法。 • 具有酶或激素性质的蛋白质可以利用它们 的酶活性或激素活性来测定含量。 • 有些蛋白质虽然没有酶或激素那样特异的 生物学活性，但是大多数蛋白质当注入适 当的动物血液中时，会产生抗体。因此， 利用抗体—抗原反应，也可以测定某一特 定蛋白质的含量。
1. 凯氏定氮法
• 是经典的标准方法，用浓硫酸消化蛋白 质分解出氨，测定氨的含量，除以16%， 就得出蛋白质的含量。
2. 双缩脲法
• 蛋白质在碱性溶液 中，能与Cu2+形 成紫红色络合物， 颜色深浅与蛋白质 浓度成正比，故可 以用来测定蛋白质 的浓度。 • 凡含有双缩脲相似 结构的物质均能参 与反应，常用于需 要快速但并不需要 十分精确的测定。
COOH pr NH2
COOH
pr
NH3 +
+OH +H +
pr
COO
+OH +H + pr
COO
-
+ NH3 pH=pI
NH2 pH>pI
pH<pI
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负 离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零， 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点
（二）蛋白质的胶体性质
coefficient, S) 表 示 , 沉
降系数与蛋白质的密度和 形状相关 。
蛋白质纯化方法总结：
• 根据蛋白质在溶液中的性质分离 纯化蛋白质的方法： • • • • • ①分子大小； ②溶解度； ③电荷； ④吸附性质； ⑤对配体分子的生物学亲和力等。 透析 离心 沉淀 电泳 层析
§7
蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质含量测定
如何解析蛋白质的空间结构？
问题的提出：
• 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先 需要得到纯的蛋白质样品。
§6
蛋白质的性质及其分离纯化
一、理化性质
（一）蛋白质的两性电离
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH条
件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点 ( isoelectric point, pI)
• 变性蛋白质的性质改变：
① 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降 率升高，粘度升高，光吸收度增加等； ② 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶 水解。 ③ 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性 改变。
• 变性蛋白质的复性：
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素 后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能，称为复性(renaturation) 。
• （3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度 的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图 谱上呈现出单一的对称峰。 • （4）溶解度分析：
• （5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因 为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只 可能有一种氨基酸。
（6）酶的纯度鉴定 • 纯化程度：通常用这一特定成分的含量 (一般用活力单位)与总蛋白量（重量单位） 之比来表示。 • 对酶来说常以每毫克蛋白所含活力单位 数表示，称为酶比活或比活力。纯化工 作一直要进行到这个比活不再增加为止 • 酶活性单位定义为在标准实验条件下催 化产生1mol产物/min所需的酶量。
体与底物等），建立起来的一种有效的纯化方法。
它经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白 质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。
亲和层析
（五）超速离心
ultracentrifugation
* 既可以用来分离纯化蛋
白质也可以用作测定蛋
白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用 沉 降 系 数 (sedimentation
5. 考马斯亮蓝染色法
• 蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变 化，从而改变这些染料的光吸收。在此基础上，发展蛋白 质染色测定方法。 • 涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚 紫，目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 • 考马斯亮蓝R-250和蛋白质通过范德瓦尔键结合，呈蓝色， 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质的染色符合比尔定律。 2—5min即呈现最大光吸收，至少稳定1h。 • 本方法可允许的测定范围是2—20ug蛋白质。受蛋白质的特 异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质的染色 强度差别不大。
脱水作用 酸
+ + + + + +
+ +
碱
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
带正电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
溶液中蛋白质的聚沉
（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固
* 蛋白质的变性(denaturation)
在某些物理和化学因素作用下，其特定的
空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无
序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生
天然状态， 有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇
尿素、 β-巯基乙醇
非折叠状态，无活性
* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽 链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。
变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉
淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固
并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质
的目的 。
蛋白质分离常用的层析方法
* 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同
进行分离。
• 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用
各蛋白质分子大小不同分离。 • 亲和层析(affinity chromatography) 是利用蛋白 质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学 亲和力（底物和酶，抗原与抗体，酶与抑制剂，受
表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋
白质沉淀。
* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物
可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗
体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体
复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分 离获得抗原蛋白。
（三）电泳
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电
的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种
* 超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液
透过有一定截留分子量的超滤膜，
达到浓缩蛋白质溶液的目的。
（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
* 使用丙酮沉淀时，必须在 0 ～ 4℃低温下进行，
丙酮用量一般 10 倍于蛋白质溶液体积。蛋白
质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以 外，也可用乙醇沉淀。 * 盐析 (salt precipitation) 是将硫酸铵、硫 酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质
• 目前实验室多用Folin-酚法测定蛋白质含量。 • 此法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器 设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10—20 倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min 内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足 之处是此反应受多种因素干扰。在测试时应排 除干扰因素或做空白试验消除。
记住这几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分
子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而 分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶ห้องสมุดไป่ตู้泳是蛋白质组学研究的重要技术。
（四）层析
层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个 固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离 的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等， 使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，
三酮反应。
⒉双缩脲反应(biuret reaction)
蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与 硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双 缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解 程度。
二、蛋白质的分离和纯化
（一）透析及超滤法 * 透析(dialysis)
利用透析袋把大分子蛋白质与
小分子化合物分开的方法。