第七章 体内药物分析法
体内药物分析方法介绍
体内药物分析体内药物分析是通过分析的手段了解药物在体内（包括实验动物等机体）数量与质量的变化，获得各种药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的方式、途径等信息。
从而有助于药物生产、实验、研究、临床等各个方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的改进和发展作出贡献。
体内药物分析任务和对象的特点：1、被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；2、样品中存在各种直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；3、样品量少，尤其是连续测定时，很难再度获得完全相同的样品；4、工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数增加；5、往往要求很快地提供结果，尤其在毒物检测工作中；6、实验室应有多种检测手段，可进行多项分析工作；7、测定数据的处理和阐明有时不太容易。
样品的种类、采集和储存一、样品的种类和选取原则：（一）血样：血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析最常采用的样本，其中选用最多的是血浆。
因血浆中的药浓可反映药物在体内（靶器管）的状况。
而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。
血浆是全血(whole blood)在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。
血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，引起析出血块，离心取得。
血块凝结时往往易造成药物吸附损失。
全血也应加入抗凝剂混匀，以防凝血。
对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆与血清麻烦，尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。
但是一些可与红血球结合或药物在血浆和血球的分配比率因不同病人而异的情况下，则宜采用全血。
血样采取量会受到一定的限制，血样取样时间间隔问题也常随测定目的不同而异。
目前大都是测定原型药物总量。
当药物与血清蛋白结合率稳定时，血药总浓度可以有效表示游离药物的浓度。
但对低蛋白症或尿毒症患者，药物结合率降低，则在通常安全有效的血药总浓度中，游离型药物浓度可显著增加。
习题第七章 体内药物分析法【执业药师 药物分析】
一、A1、可作为体内药物浓度可靠指标的是A、尿药浓度B、血清药物浓度C、血浆药物浓度D、唾液药物浓度E、肌肉药物浓度【正确答案】 C【答案解析】当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度能够反映药物在靶器官的状况，因而，血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。
【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】2、在体内药物分析中最为常用的样本是A、尿液B、血液C、唾液D、脏器E、组织【正确答案】 B【答案解析】体内样品包括各种体液和组织。
但是，在体内药物分析中最为常用的样本是血液，它能够较为准确地反映药物在体内的状况。
【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】3、一般成人每天分泌唾液约A、1～2LB、1.5～2LC、2～3LD、1～1.5LE、0.5～1.5L【正确答案】 D【答案解析】一般成人每天分泌约1～1.5L。
【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】14、健康成人一日排尿量为：A、2～5LB、1～5.5LC、1～6LD、2～7LE、1～5L【正确答案】 E【答案解析】尿液包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。
健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。
【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】5、尿液的PH值：A、4.8～9.5B、4.8～8.0C、4.8～9.0D、5.0～8.0E、5.5～8.0【正确答案】 B【答案解析】健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。
【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】6、体内药物分析中去除蛋白质的方法为A、加入强酸法B、缀合物水解法C、液-液萃取法D、固相萃取法E、化学衍生化法【正确答案】 A【答案解析】去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。
其中蛋白沉淀法常用的方法包括：加入有机溶剂、强酸和无机盐。
【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】7、丙酮沉淀蛋白时，上清液pH值为2。
体内药物分析
学科介绍基本概念体内药物浓度，尤其是血浆（或血清）药物浓度直接与药效相关，并受多种因素影响。
例如，不同给药途径（如口服、吸人、静脉注射、肌肉注射、透皮等）可直接影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响体内药物的浓度以及经时行为，并最终影响疗效。
患者的生理因素（性别、年龄等），病理状态（疾病的类型和程度），基因类型，吸收、代谢及分泌排泄功能，都影响药物在体内的经时行为。
许多药物需经肝脏代谢或经肾脏排泄，所以对于肝或肾病患者，由于他们的肝脏生物转化及代谢功能降低、或肾脏的分泌排泄功能降低，往往会造成药物在体内蓄积，进而发生药物毒性反应。
随着现代医学的不断进步，人们对医疗质量也提出了更高的要求。
治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）就是以灵敏可靠的方法，检测病人在给药后的血液或其他体液中的药物浓度，并应用药物代谢动力学理论，指导最适个体化用药方案的制定和调整，以避免用药剂量过大及可能产生的毒性反应，保证药物治疗的有效性和安全性。
学科特点体内药物分析的特点是样品成分复杂，被测组分含量低。
学科关联体内药物分析学科发展的最大推动力来自于生物医学及新药药物动力学研究领域巨大的要求和分析技术上的飞跃性进步。
与药代动力学、临床药理学和生物药剂学等学科互相关联、密不可分。
分析方法光谱分析法包括比色法(colorimetry)、紫外分光光度法（UV ）和荧光分析法（Fluor ）。
光谱法虽然仪器简单、测定快速，但选择性和灵敏度都较低，本法不具备分离功能，受结构相近的其他药物、代谢产物和内源性杂质的干扰，因此用光谱法分析体液样品时，除少数样品外，一般都需经过组分分离、纯化等预处理过程。
光谱法的灵敏度低，不适用于测定药物浓度低的生物样品。
色谱分析法包括高效液相色谱法（HPLC ）、气相色谱法（GC ）及其与质谱（Ms ）联用（HPLC 一MS , GC 一MS ）的方法，以及毛细管电泳色谱法( HPCE ）。
体内药物分析方法及方法的设计与评价
（四）毛细管电泳法
• 毛细管电泳法(CE)，又称高效毛细管电泳法 (HPCE)，是20世纪末发展起来的一种高效、 快速的分析技术。HPCE是以高电压电场为驱 动力，以毛细管为分离通道，依据样品各组分 之间淌度和分配系数的不同而实现分离的一类 液相分离技术。
• 近年来HPCE发展十分迅速，已在化学、生命 科学和药学等领域得到广泛的应用。
(三)明确测定的目的、要求
• 应了解拟建立的方法是用于测定药代动力学参 数，还是用于临床药浓监测。前者要求具有一 定的灵敏度和准确度，不强调简便、快速，设 计方法时应考虑到不同时间获得的样品中药物 浓度变化较大这一因素。而用于临床药浓监 测，则要求方法简便、快速。另外，是否要求 同时测定母体药物和代谢物，若需同时测定两 者，则应选择具有分离能力或专属的测定方 法。
• 由于该法具有高效、快速、灵敏、进样少、信 息量大、运行成本低、易于自动化等优点。因 此使其在体内药物分析及其代谢的检测中得到 广泛的应用。
• 根据HPCE法的分离模式的不同。HPCE又分 为：毛细管区带电泳、胶束电动毛细管色谱、 毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等 速电泳和毛细管电色谱法。上述这些方法近几 年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。
方法的评价
• 对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可 靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察 与评价。这是研究和建立一个新的分析方法时 必须着重抓住的几个环节。
• 评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下 几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性 或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及 对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：
• 由于光谱法不具备分离功能，选择性较差，因 此对样品的预处理要求较高。选用专属的方法 或试剂与之反应，测定衍生物的荧光或对光吸 收强度，也可借助数学的方法消除干扰。
07体内药物检测与药品检验方法-药物分析
在杂质可获得的情况下，对于含量 测定，试样中可加入杂质或辅料，考察 测定结果是否受干扰，将含有杂质或降 解产物的试样进行测定，与另一个经验 证了的或药典方法比较结果。
检验方法验证>>
四、检测限 检测限系指试样中被测物能被检测出的
最低量。常用的方法如下。 1．目视法 用已知浓度的被测物，试验出能被可靠
解产物、辅料等)可能存在下，采用的 方法能准确测定出被测物的特性。
检验方法验证>>
1．鉴别反应 应能与可能共存的物质或结构相似化
合物区分。不含被测成分的样品，以及 结构相似或组分中的有关化合物，均应 呈负反应。
检验方法验证>>
2．含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离方法，应附代表性
图谱，以说明专属性。图中应标明诸成 分的位置，色谱法中的分离度应符合要 求。
（1）血浆的制备
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、草 酸盐、枸橼酸盐、EDTA、氟化钠等）的试管中， 混合后，以2500～3000rpm离心5~10min使与血 细胞分离，分取淡黄色的上清液即为血浆。
药物分析>>体内药物分析
（2）血清的制备 P？
贮藏采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立
即进行检测。如不能立即测定时，应根据药物在血样 中的稳定性及时处置止于具塞玻璃试管或EP管中密塞 保存。短期保存时置冰箱（4℃）中，长期保存时要在 冷冻橱（库）（－20℃）中冷冻保存。 。
放射免疫的灵敏度最高，是在生物样品中加 入理化性质、免疫学特性和待测物相同的经放射 性性同位素标记的待测物，将该待测物与特异性 的抗体结合，用测量放射性的方法测量并计算结 合部分与游离部分的比值，从而确定待测物的量。
体内药物分析
缀合物：缀合物类型：①葡萄糖醛酸苷：含-OH、-COOH、-NH2、–SH等功能团的成分可与葡萄糖醛酸形成葡萄糖醛酸苷缀合物②硫酸酯：芳胺、酚类及醇类成分可与硫酸形成硫酸酯缀合物血浆蛋白结合率：反映了药物与血浆蛋白的亲和程度。
一般指在治疗量时药物结合的百分率，作为药代动力学的重要参数之一，影响了药物在体内的分布、代谢、排泄，与药物的药理作用强度密切相关。
一相代谢：氧化、还原、水解反应。
在药物结构中引入羟基、羧基、氨基等官能团，为二相代谢做准备二相代谢：结合反应。
具有羟基、羧基、氨基等官能团的药物与糖、硫酸盐、氨基酸等结合，极性增大，利于排肝内代谢反应类型：以氧化为主，其次为还原、水解结合肠内菌的生物转化：利用肠内菌微生物中特定酶将中药成分(或天然化合物)进行生物转化，属单酶或双酶的高密度转化。
具有高度选择性(尤其是立体选择性)和反应条件温和的特点。
以水解反应为主，其次为氧化还原反应。
·蛋白质的去除：沉淀法（有机溶剂沉淀法、盐析法、酸性试剂沉淀法、加热沉淀法）；酶消化法；超滤法、透析法、微孔滤膜过滤法。
·影响液相提取的因素：提取溶剂；水相PH值（根据待测成分PKa；为保证提取率的重现性，常使用缓冲溶液）；离子强度（越大提取率越高）·影响固相提取的因素：合适的洗涤剂和洗脱剂；流速（不宜过快）；上样量（样品突破性实验可判断上样量是否超载）·固相提取的操作步骤：固相柱选择、处理→样品上样→分离纯化→洗脱待测成分→浓缩处理或直接进样分析·检测限和定量限LOD&LOQ的确定和要求：LOQ【能从背景信号中区分出药物时所需样品中药物的最低浓度】可于空白生物基质加入定量的药物标准品混匀，配制成药浓在标准曲线末端并逐渐降低的一组药品，然后对每种浓度测定3~5次，以测定结果的精密度达到≤20％和准确度达到≤+20％时的样品中药物的最低浓度。
LOD【保证具有一定可靠性前提下，分析方法能测定出样品中药物最低浓度】-测定时记录各浓度样品每次测定得到的药物信号强度S与噪音/背景信号强度N，然后取均值S、N，以能达到S/N=3时样品药浓为LOD。
体内药物分析方法介绍
体内药物分析体内药物分析是通过分析的手段了解药物在体内（包括实验动物等机体）数量与质量的变化，获得各种药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的方式、途径等信息。
从而有助于药物生产、实验、研究、临床等各个方面对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的改进和发展作出贡献。
体内药物分析任务和对象的特点：1、被测定的药物和代谢物的浓度或活性极低；2、样品中存在各种直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；3、样品量少，尤其是连续测定时，很难再度获得完全相同的样品；4、工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数增加；5、往往要求很快地提供结果，尤其在毒物检测工作中；6、实验室应有多种检测手段，可进行多项分析工作；7、测定数据的处理和阐明有时不太容易。
样品的种类、采集和储存一、样品的种类和选取原则：（一）血样：血浆(plasma)和血清(serum)是体内药物分析最常采用的样本，其中选用最多的是血浆。
因血浆中的药浓可反映药物在体内（靶器管）的状况。
而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。
血浆是全血(whole blood)在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取，量约为全血的一半。
血清则是在血液中纤维蛋白元等影响下，引起析出血块，离心取得。
血块凝结时往往易造成药物吸附损失。
全血也应加入抗凝剂混匀，以防凝血。
对大多数药物来说血浆浓度与红细胞中的浓度成正比，所以测定全血也不能提供更多的数据，而全血的净化较血浆与血清麻烦，尤其是溶血后，血色素等可能会给测定带来影响。
但是一些可与红血球结合或药物在血浆和血球的分配比率因不同病人而异的情况下，则宜采用全血。
血样采取量会受到一定的限制，血样取样时间间隔问题也常随测定目的不同而异。
目前大都是测定原型药物总量。
当药物与血清蛋白结合率稳定时，血药总浓度可以有效表示游离药物的浓度。
但对低蛋白症或尿毒症患者，药物结合率降低，则在通常安全有效的血药总浓度中，游离型药物浓度可显著增加。
体内药物分析
一 体内样品的种类 二 体内样品的采集与制备 三 体内样品的贮存与处理
一 体内样品的种类
血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、 脑脊液、泪液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等 尿液——主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生
物利用度等研究，以及测定代谢物类型等
脑脊液——怀疑药物损血脑屏障
二 体内样品的采集与制备
（一）冷藏与冷冻
取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷
藏(4℃)，长期冰冻(-20℃或-80～70℃) 。
全血未经分离，不宜直接冷冻保持。 尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的 样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、 过饱和氯仿等）保存。 注意：避免将样品反复解冻-冷冻-解冻 ——冷冻前分装成若干小份贮存
采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。
药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中
排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。
（三）唾液：
优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。
缺点：药物浓度变化大
采取：漱口15分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出
的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。
制备：采取后，立即测量除去泡沫部分的体积。
分层→离心→取上清液
（四）组织：
药物动物实验、服用药物过量中毒死亡时使用组织
常用的脏器组织有：胃、肝、肾、心、、肺、脑等 制备：组织样品在测定之前，需先加入一定量水或缓冲液匀浆 均匀化。 处理：沉淀蛋白、酸水解或碱水解 、酶水解（枯草菌溶素）
三、体内样品的贮存
（三）分离与浓集
目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分 方法：
体内药物分析
治疗药物监测（TDM）是通过测定血液或其他体液中的药物浓度，在临床药代动力学原理的指导下，使临床给药方案个体化，以提高疗效、避免或减少毒副反应应用:1）药物有效血药浓度范围狭窄——代表药物地高辛、奎尼丁等2）药物剂量小、毒性大——代表性药物有利多卡因、地高辛等3）药物体内过程个体差异大，具有非线性药代动力学特性——代表性药物有苯妥英钠、茶碱、水杨酸等4）处于某些病理状况（如胃肠道、肝脏、肾脏疾病），应用上述药物治疗时5）合并用药有相互作用而影响疗效或有中毒危险时6）某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时——代表性药物如地高辛、速尿等7）长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性；或诱导和抑制肝药酶的活性；以及原因不明的药效变化时8）常规剂量下出现严重毒性反应时；诊断和处理药物过量中毒；为药物引起的医疗事故提供法律依据时药物非临床药代动力学研究受试动物1首选动物：尽可能与药效学和毒理学研究一致。
2尽量在清醒状态下实验，动力学研究最好从同一动物多次采样。
3创新药应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物；另一种为非啮齿类动物。
其他类型的药物，可选用一种动物（建议首选非啮齿类动物，如犬或猴等）。
4口服用药不宜选用兔等食草类动物。
5受试动物数：以药时曲线的每个时间点有不少于5个数据为限计算所需动物数。
最好从同一动物多次取样，尽量避免用多只动物合并样本。
多只动物合并样本应相应增加动物数，以减少个体差异对试验结果的影响。
建议受试动物采用雌雄各半，如发现药动学存在明显的性别差异，应增加动物数以便了解药物在雌雄动物体内的药动学的差异情况。
对于单一性别用药，可选择与临床用药一致的性别。
药代动力学研究采样点的确定1采样点的确定：采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的血药浓度-时间曲线可能与药物在体内的真实情况产生较大差异，由此计算的药代动力学参数也就失去了意义。
体内药物分析方法(精)
1. 标准曲线的建立 (1) 系列标准溶液: n≥6(不包括0点); 等比系列(2~3);
通常为100~1000倍
(2) 内标溶液: 浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度 (二 ) (3) 系列标准样品 : 空白生物介质, 加入系列标准溶液 (4) 标准曲线的绘制: 药物浓度, 以单位体积(如血浆)或
①辅助试剂的使用 乙醚(1.2%水): 氯化钠 ②混合溶剂的使用
溶剂 正己烷 环己烷
紫外截止波长 (nm) 210 210
沸点(℃) 69 81
甲苯
↓ 极 性 增 加 ↓ 异丙醚* 乙醚* 醋酸戊酯
285
220 220 285
111
68 35 149
三氯甲烷
甲基异丁基酮 醋酸乙酯 正丁醇
245
230 260 215
(4) 自动化固相萃取法
对于单个样品处理, SPE操作省时 对于大量样品的处理 半自动SPE: 萃取过程机械化
全自动化仪器: 通过柱切换技术
实现固相萃取与HPLC联用
(5) 自动化固相萃取法 柱切换: 固相萃取-LC/MS/MS
3. 超滤法 ultrafiltration是一种膜分离技术
体液
血液; 唾液
脑脊液;胃液; 胆汁;乳汁;精 液;泪液
排泄物
尿液
粪便; 汗液
组织
胃;肠;肝;肾;肺, 脑;肌肉;头发
二、体内样品的采集与制备
1. 血样的采集
静脉, 1-5ml ≤1/10 TDM测定S代替P 进行临床监测
50-60％ 2. 血浆的制备
抗凝剂, 1000g离心 5-10min 淡黄色上清液
提取1次
若提取回收率较低(低于50%), 提取2~3次 脂溶性干扰物, 可进行小体积水溶液反提取
体内药物分析
一、名解：1、体内药物分析（Biopharmaceutical analysis）:【狭义】利用现代分析仪器和分离手段对人和动物的血液、尿、组织等样品进行定性定量的分析。
【广义】通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产，临床应用作出评价。
2、散射光：光通过物质时，有小部分在侧向散射开来，这种现象叫做光的散射，若散射光的频率与入射光的频率相同，则称为溶剂的瑞利散射光。
3、拉曼光：若散射光的频率与入射光的频率不同，则称为溶剂的拉曼光。
4、紫外双波长分光光度法：吸收光谱重叠的a、b两组混合物中，从b的吸收光谱上选择两个吸收度相等的波长λ1和λ2，测定混合物在两个波长处吸收度的差值，即可消除b的干扰以测定a，这种方法叫做双波长分光光度法。
5、高效液相色谱（HPLC）：以经典液相色谱为基础，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器并引入气相色谱理论而发展起来的分离技术。
6、微径液相色谱法：是采用高效毛细管柱的液相色谱法，即采用细管细粒度、短柱子实现高效快速的分离。
7、抗原：凡能刺激机体产生免疫反应的物质称为抗原。
8、半抗原：只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质。
9、人工抗原：药物本身不具有免疫原性，只有当他们与某些大分子载体物质结合后所形成的全抗原。
人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
10、标准抗原：指在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品。
11、特异抗体（Specific Antibody）：指抗原（免疫原）作用于机体产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白（lgG约占70%）。
二、体内药物分析与其他学科的关系（一）药物动力学及生物药剂学定量测量药物浓度可：1、求出动力学参数和药物制剂的生物利用度参数；2、评价药物与制剂的内在质量；3、确保临床用药的安全性和有效性。
（二）与临床药理学的关系临床药理学的研究内容：1、研究药物进入人体内对人体生理与生化机能影响和临床效应，以及药物的作用原理。
体内药物分析教程
第一部分概述体内药物分析是对体内样本（包括生物体液、器官或组织）中的药物、代谢物或内源性物质的定量分析。
体内药物分析是药代动力学研究和治疗药物监测（TDM）的重要手段。
药物在临床前研究阶段，首先在试验动物体内进行药代动力学和毒代动力学研究；在临床研究阶段，要对药物作用于人体的安全性与有效性作出评价。
这些研究中，建立有效的体内药物分析方法是首要任务。
随着现代医学的不断进步，精准医疗和个体化治疗成为新的理念。
TDM 就是采用灵敏可靠的方法，检测患者体内的药物浓度，指导个体化用药方案的制定，保证用药的有效性与安全性。
另外，监测和研究体内内源性物质的浓度变化，对于某些疾病的诊断及治疗具有重要意义；对于麻醉药品和精神药品滥用的检测和运动员体内违禁药物的监测，也必须依据体内药物分析手段和技术才能完成。
药物产生药理作用的强度与其在体内作用部位（受体组织）的浓度直接相关，而药物在体内主要依靠血液输送至作用部位，因此血药浓度可作为药物在作用部位浓度的表观指标，即血液是体内药物分析的主要样品。
另外，尿液、唾液、头发和脏器组织等也可作为体内样品。
药物在体内的某些代谢产物常具有一定的生理活性，它们在体内的变化规律对母体药物的药理学与毒理学评价极为重要；机体内源性生物活性物质往往参与机体重要的生理过程，其变化规律的异常改变也与某些疾病的发病机制密切相关。
所以，体内特定药物代谢物和机体内源性生物活性物质也是体内药物分析的目标。
在测定体内药物及其特定代谢物或内源性生物活性物质时，除少数情况将体液作简单处理后可直接测定外，通常在测定之前要对体内样品进行分离净化与浓集等样品前处理，从而为体内样品中药物的测定提供良好的环境与条件。
体内样品大都具有以下性质特点：①采样量少，采样量一般为数毫升至数十微升，且在特定条件下采集，不易重新获得。
②待测物浓度低，通常在10-9~10-6g/ml级，甚至低至10-12g/ml。
③干扰物质多，血样中含有蛋白质、脂肪、尿素等有机物和Na+、K+等大量内源性物质通常对测定构成干扰；且体内的内源性物质可与药物结合，也能干扰测定。
体内药物分析
学科介绍
学科特点
基本概念
学科关联
体内药物浓度，尤其是血浆（或血清）药物浓度直接与药效相关，并受多种因素影响。例如，不同给药途径 （如口服、吸人、静脉注射、肌肉注射、透皮等）可直接影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响体内药 物的浓度以及经时行为，并最终影响疗效。患者的生理因素（性别、年龄等），病理状态（疾病的类型和程度）， 基因类型，吸收、代谢及分泌排泄功能，都影响药物在体内的经时行为。许多药物需经肝脏代谢或经肾脏排泄， 所以对于肝或肾病患者，由于他们的肝脏生物转化及代谢功能降低、或肾脏的分泌排泄功能降低，往往会造成药 物在体内蓄积，进而发生药物毒性反应。
2.血浆的制备
将采集的全血置含有抗凝剂的试管中，混匀后，以约1000×g力离心5～10分钟，促进血红细胞沉降分离，分 取上清液即为血浆。
3.血清的制备
将采集的全血在室温下放置至少0.
尿液样品尿液包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH 值在4.8～8.0之间。尿液的主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及盐类。
药物它们主要应用于放射免疫分析法（RIA）、同位素逆稀释分析，或作为GC - MS分析中的内标，以及在药 物分离中作示踪应用等。
利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较样品与药物标准品两者对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小， 借以测定样品内抗生素的浓度。
样品种类
采集时间 血样
尿液 唾液
体内样品的采集时间对测定结果的临床价值影响很大，是开展临床治疗药物监测必须考虑的基本问题。采集 时间应在药代动力学理论的指导下，根据临床治疗药物监测的不同目的确定。
体内药物清除主要是通过肾脏排泄，经尿液排出。采集的尿液应该是自然排尿。尿液在放置时可因细菌繁殖 而变混浊，因此，尿液采集后应立即测定。若不能立即测定（如需收集24小时的尿液），必须采集后立即处置、 或低温保存、或加入防腐剂后冷藏保存。常用的防腐剂有二甲苯、三氯甲烷、醋酸或盐酸等。二甲苯等有机溶剂 可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改变尿液的酸碱性，以抑制细菌的繁殖。保存时间在36小时以内，可置 冰箱冷藏；若需长时间保存，则应冰冻贮藏。
体内药物分析：免疫分析法
④琥珀酸酐法 该法是利用琥珀酸酐在无水吡 啶中与半抗原分子中的羟基反应，首先生成带 有羧基的半抗原琥珀酸衍生物，然后再与蛋白 质的氨基结合，形成肽键。
⑤重氮化的对氨基苯甲酸法 该法是利用重氮 化的对氨基苯甲酸（重氮化合物）先与带酚羟 基的半抗原反应，生成带有羧基的半抗原，然 后再与蛋白质结合
3. 人工抗原的鉴定
三种试剂的作用分别是： 1. 抗体是作为标记药物和非标记药物竞争结合 的蛋白； 2. 标记药物提供可检测的信号（响应值）； 3. 非标记药物在标准曲线制备时是药物标准品， 在样品中则为被测药物。它用于建立被测药物 量（浓度）与响应值之间的函数关系，是样品 中药物浓度计算的依据。
Ag Ab K1 Ag Ab
从图中可见，抗血清A的滴度及它和标记抗 原的亲和力较小，质量最差；B的滴度虽高， 但亲和力不够高；C质量最佳，选其结合率 50%稀释度，建立放射免疫分析方法最适宜。
（2）活度（Avidity）
活度是指抗体与相应抗原的亲和力 （Affinity)。它可反映出抗原与抗体结合的牢 固程度。活度高，表明形成抗原-抗体结合物的 速度快而解离小。抗体活度高低与免疫分析方 法的灵敏度密切相关，它主要表现在剂量反应 曲线的斜率上，斜率越陡，表明活度越高，测 定效果越好。
4. 标准抗原（Standard antigen）
标准抗原是指在免疫测定中用来 制作标准曲线或制备标记抗原用的药 物标准品。标准抗原是免疫分析法的 定量依据。
（二）特异抗体的制备及鉴定
1. 特异抗体（Specific Antibody）
特异抗体是指抗原（免疫原）作用于机体 产生免疫反应，在血清中产生的能与该抗原特 异性结合的免疫球蛋白。抗体具有高度的特异 性，一般只能与相应的抗原起专一的反应。在 免疫球蛋白中，免疫球蛋白G（IgG）含量最高 （约占70％），是免疫分析中最常用的抗体。
体内药物分析分析方法在滥用药物检测中的应用
质谱法
质谱联用技术
如液相色谱-质谱联用（LC-MS）、气 相色谱-质谱联用（GC-MS）等，可 提供化合物的结构信息，适用于未知 药物及其代谢产物的鉴定。
高分辨质谱法
具有高质量精度和高分辨率，可准确 测定化合物的分子量，适用于蛋白质 、多肽等大分子药物的分析。
免疫学方法
01
酶联免疫吸附法 （ELISA）
核磁共振法
利用原子核在磁场中的共振现象 进行测定，可提供化合物的结构 和构象信息，适用于复杂药物分 子的研究。
光谱法
如红外光谱、紫外光谱等，利用 物质对光的吸收或发射现象进行 测定，适用于药物的结构鉴定和 定量分析。
03 滥用药物检测中的体内药 物分析应用
样本采集与处理
血液样本采集
通过静脉采血或指尖采血等方式，收集被测者 的血液样本。
体内药物分析分析方法在滥用药物 检测中的应用
目录
• 引言 • 体内药物分析方法概述 • 滥用药物检测中的体内药物分析应用 • 体内药物分析在滥用药物检测中的挑战与
解决方案 • 案例分析：体内药物分析在滥用药物检测
中的实际应用 • 结论与展望
01 引言
背景与意义
01
随着社会发展和科技进步，药物滥用问题日益严重，对个体健 康和社会稳定造成极大威胁。
02 体内药物分析方法概述
色谱法
01
高效液相色谱法（HPLC）
适用于大多数药物及其代谢产物的分离和定量分析，具有高灵敏度、高
分辨率和高通量的特点。
02
气相色谱法（GC）
适用于挥发性药物及其代谢产物的分析，如麻醉药、有机溶剂等。
03
薄层色谱法（TLC）
操作简便、设备要求低，适用于快速筛选和半定量分析。
体内药物分析药学
体内药物分析药学体内药物分析分析方法建立后需进行包括准确度、精密度等一系列的评价项目进行验证，请问：对所建立的药物的体外及体内分析方法，其验证要求有何不同，为什么？试举两例文献说明。
药物的分析方法均需验证：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、专属性、线性、范围、耐用性药物分析是测定原料药、制剂及有关杂质的含量，控制药物生产至临床应用前药物的质量；体内药物分析则是药物体内研究和临床用药期间测定生物样品中药物的含量。
由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素，因此体内药分比药物分析在灵敏度和专属性上的要求更高，自然两者的方法验证要求也不同。
药物分析方法的验证1、准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。
数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。
2、精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。
（1）重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。
（3）重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。
3、检测限（limit of detection，LOD）检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。
4、定量限（1imit of quantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。
5、专属性（specificity ）（选择性）：指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。
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第七章体内药物分析法打印大中小一、A1、可作为体内药物浓度可靠指标的是A、尿药浓度B、血清药物浓度C、血浆药物浓度D、唾液药物浓度E、肌肉药物浓度【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145734,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 C【答案解析】当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物的浓度能够反映药物在靶器官的状况，因而，血浆药物浓度可作为体内药物浓度的可靠指标。
【您的答案】 C【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】2、在体内药物分析中最为常用的样本是A、尿液B、血液C、唾液D、脏器E、组织【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145733,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】体内样品包括各种体液和组织。
但是，在体内药物分析中最为常用的样本是血液，它能够较为准确地反映药物在体内的状况。
【您的答案】 B【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】3、一般成人每天分泌唾液约A、1～2LB、1.5～2LC、2～3LD、1～1.5LE、0.5～1.5L【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145624,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 D【答案解析】一般成人每天分泌约1～1.5L。
【您的答案】 D【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】4、健康成人一日排尿量为A、2～5LB、1～5.5LC、1～6LD、2～7LE、1～5L【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145623,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 E【答案解析】尿液包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。
健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。
【您的答案】 E【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】5、尿液的PH值：A、4.8～9.5B、4.8～8.0C、4.8～9.0D、5.0～8.0E、5.5～8.0【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145622,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】健康成人一日排尿量为1～5L，尿液的pH值在4.8～8.0之间。
【您的答案】 B【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品种类,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】6、体内药物分析中去除蛋白质的方法为A、加入强酸法B、缀合物水解法C、液-液萃取法D、固相萃取法E、化学衍生化法【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145732,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 A【答案解析】去除蛋白质常用的方法包括蛋白沉淀法和蛋白分解法。
其中蛋白沉淀法常用的方法包括：加入有机溶剂、强酸和无机盐。
【您的答案】 A【答案正确，得分：1.0】【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】7、丙酮沉淀蛋白时，上清液pH值为A、9～10B、8.5～9C、8～8.5D、7.5～8E、7～7.5【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145625,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 A【答案解析】使用乙腈或甲醇时，上清液的pH值为8.5～9.5；丙酮沉淀蛋白时，上清液pH 值为9～10。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品处理,体内药物分析法-单元测试”知识点进行考核】8、在体内样品测定中，分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力被称为A、精密度B、特异性C、准确度D、定量限E、检测限【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100270124,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】考查重点为体内样品定量分析方法验证中特异性的概念。
特异性：必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰样品的测定。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】9、体内样品测定方法要求，建立标准曲线所用浓度至少应为A、1个B、2个C、3个D、4个E、6个【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145731,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 E【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】10、下列色谱法中不用于体内样品测定的是A、气相色谱法B、高效液相色谱法C、气相色谱-质谱联用D、薄层色谱法E、液相色谱-质谱联用【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100427521,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 D【答案解析】色谱分析包括：气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和色谱-质谱联用(GC-MS、LC-MS)等，这些方法适用于复杂样品中微量药物的专属准确定量，多用于药代动力学研究。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】11、关于体内样品处理的液-液萃取法叙述错误的是A、多数药物是亲脂性的B、所选溶剂应当与水不相混溶C、一般有机相与水相(体液样品)的容积比为1：5～1：1D、体内样品中内源性物质多数为强极性的水溶性物质E、体内样品中内源性物质多数为酸性【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100427513,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 C【答案解析】多数药物具有亲脂性，在弱极性的有机溶剂中的溶解度大于在水相中的溶解度，而血样或尿样中所含的大多数内源性物质是强极性的水溶性物质；体内样品中内源性物质多数为酸性；萃取时所用的有机溶剂要适量。
一般有机相与水相(体液样品)的容积比为1：1～5：1。
有机溶剂的最佳用量一般根据被测药物的性质、分析方法和萃取回收率来优化确定。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】12、乙腈沉淀蛋白时，上清液pH值为A、9～10B、8.5～9.5C、8～8.5D、7.5～8E、7～7.5【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100427512,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】使用乙腈或甲醇时，上清液的pH值为8.5～9.5；丙酮沉淀蛋白时，上清液pH 值为9～10。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】二、B1、A.<15％B.85％～115％C.80％～120％D.<20％E.100％【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】<1> 、在体内药物分析中，定量下限其准确度应在真实浓度的A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100145736,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 C【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】<2> 、体内药物分析中的准确度一般应在A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100145737,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】<3> 、在体内药物分析中，质控样品测定结果的偏差一般应A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100145738,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 A【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】<4> 、在体内药物分析中，质控样品测定结果的低浓度点偏差应A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100145739,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 D【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品测定”知识点进行考核】2、A.五氟碘乙烷B.三甲基氯硅烷C.乙酸酐D.重氮甲烷E.邻苯二醛（体内样品分析，化学衍生化法）【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】<1> 、硅烷化试剂A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100427516,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 B【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】<2> 、酰化试剂A B C D E【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【答疑编号100427517,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 C【答案解析】GC分析中常对待测物进行硅烷化、酰化、烷基化或酯化等。
硅烷化应用最广泛。
硅烷化试剂有：三甲基氯硅烷(TMCS)、双-三甲基硅烷乙酰胺(BSA)、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基硅烷咪唑(TMTS)等。
酰化试剂有：乙酸酐、丙酸酐、五氟苯甲酸酐等。
烷基化及酯化试剂有：五氟碘乙烷、重氮甲烷、对溴苄基溴、三氟化硼-甲醇等。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品处理”知识点进行考核】三、X1、尿药浓度A、与血药浓度直接相关B、与血药浓度相关性差C、通常变化较大D、线性相关E、与血药浓度相关性好【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145745,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 BC【答案解析】尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性差。
受试者的肾功能正常与否直接影响其对药物的排泄能力，因而，尿液样品的采集和测定应当与肾功能指标进行关联分析。
【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】2、常用的血液样品抗凝剂包括A、肝素B、EDTAC、草酸盐D、枸橼酸盐E、纤维蛋白原【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145744,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 ABCD【答案解析】抗凝剂如：肝素、EDTA、草酸盐、枸橼酸盐等【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】3、体内药物分析常用的样品A、血液B、尿液C、唾液D、注射剂E、片剂【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145743,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 ABC【答案解析】【您的答案】您未答题【该题针对“体内样品种类”知识点进行考核】4、尿液包括A、时间尿B、随时尿C、晨尿D、夜间尿E、白天尿【本题 1.0 分，建议 1.0 分钟内完成本题】【加入我的收藏夹】【加入打印收藏夹】【答疑编号100145740,点击提问】【隐藏答案】【正确答案】 ABCDE【答案解析】尿液包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。