微阵列的应用

评价
的合成
合成多肽 固相化 表为分析，折叠研 （10~80aa）学合成 究，诊断
重组蛋白 细胞表
（100~400 0aa）
达或体
外生产
蛋白组分析：蛋白 相互作用，蛋白药 物结合等
易于制造纯化， 能化学修饰，可 之谱分析
研究蛋白质功 能最佳方法
单抗
杂交瘤 基于血清抗原的检 稳定性、特异
技术 测
性好；昂贵
2.蛋白质间的相互作用：
在蛋白质微阵列上点有数量巨大的靶组件，可以检测标 记蛋白或待研究蛋白的结合活性，一步就可确定结合对象 并获得相关定量数据。
3.药物：
寻找新药物、寻找靶位点；确定已有药物的靶位点；优化 药物配伍。
4.诊断：
可做成抗原微阵列或抗体微阵列，在病原体诊断、癌症标 记物检测、过敏原检测方面广泛快捷的应用。
蛋白质/多肽微阵列及其 在过敏原分析中的应用
石松传 北京博肽健诺威生物科技有限公司
PART Ⅰ蛋白质/多肽微阵列
protein/pepyide microarray一类生物芯 片。是根据蛋白质-蛋白质相互作用规律，将各 种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等 各种载体上而形成的高通量蛋白质检测技术
hyloxycarbon TFA（acid）
yl芴甲氧羰基
BOC
tert-
Hidrogenfl
butyloxycarb uoride（HF）
only叔丁氧羟基
TFA
Temporary protection of Side-chain
这是对氨基酸侧链活性官能团的保护，称为半永久性保护， 一般在肽合成末期去保护。
Temporary protection of α-amino
由于化学合成肽段过程需要向反应体系中加入很多化学物质，发生很多化学反应，合成是从C-端开始，氨基必须得到保护。
根据所用N-末端保护试剂的不同可以分为两种合成策略：
策略 保护试剂
去保护试剂 示意图
Fmoc 9-
Piperidine
fluorenylmet （base）
它是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用 于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相 互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的 相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。
微阵列示例
蛋白质/多肽微阵列试验流程
生物学问题？
实验设计 数据分析与建模
标本处理
检测
生化反应
蛋白质/多肽微阵列模式分类
靶组件 靶组件 主要用途
受保护基团 保护策略
去保护策略
Arg胍基
芳基磺酰基（如Pbf） HF酸解或钠/液氨还原
Lsyω-氨基
BOC策略中用Z(2-Cl) 盐酸酸解 氯苄氧羰基
Fmoc策略中用BOC 亲核试剂
Asp、Gluω- BOC策略中β -环己基 酸解
羧基
酯Ocy
半胱氨酸巯基 叔丁基/二硫化物
TMSFA/2-巯基乙醇
His咪唑基
2.点样法（spotting sample method ）： 将合成和纯化好的蛋白质/多肽用特殊的仪 器点加到膜载体上，可以分为顺序点样法 和并行点样法。重组蛋白、单抗、多抗等 靶组件用此方法做成微阵列。
微阵列的应用
1.表达谱分析：
用于蛋白质谱的研究，能在混合物中很好的区分不同的 蛋白质并提供丰富的数据。
Schematic of SPOT
Membranes
膜必须是疏松多空但平坦的，纤维素膜 （cellulose）是其很好的选择，性能优异，易于获
得，价格便宜。以下几种是常用的规格： Whatman chr Whatman 50 Whatman 540 其他膜介质还有：多聚高分子膜、醋酸纤维膜、 PDF膜。 此外还有的用玻璃板，或CD圆盘。
Membrane Functionalization
纤维膜是多聚糖，表面含有羟基自由基， 它们会降低AA的结合，因此需要对其进行 修饰： 1.酯化反应：ß-alanine 与 DIC等 2.共价结合二胺：二氨基丙烷、烷化的PEG 等。 （聚乙二醇） 功能化修饰在合成完成后要去除这些修饰基 团。
纤维素膜类型及功能化修饰
Fmoc策略中用NimBOC
HBr/HOAc、TFA、HF 酸解
Activition of free amino group
要使游离的氨基酸添加到肽链上，氨基酸的羧基必须活化。
活化方法 所用试剂 优点
缺点
In situ
DIC and
activation HOBt
试剂用量少 试剂必须是 新鲜的现配 先用
三 百种之多,常用的体外检测,方法比如RAST 、EL ISA等,具 有操作步骤繁杂,耗时费力且价格昂贵、所需血清样本量大
等 缺点,不适合同时对多种过敏原的检测。
近年来,渐趋成熟的蛋白质芯片技术因其高通量、微型化、 平行性检测等优点，可用于过敏原的筛选、检测。典型的例 子是过敏原特异性IgE检测微阵列的研制。
微阵列的应用
蛋白质微阵列应用示意图
PARTⅡ 原位合成微阵列
原位合成是直接在固体基质上用21种氨基 酸合成所需的蛋白质/多肽片段的技术。
下面介绍以下基于SPOT技术的膜结合多 肽微阵列的原位合成方法。
SPOT -tecnology
SPOT ( )是Ronald the parallel synthesis of oligpeptide arrays on cellulose supports 等于1990年发明的以膜为载体可以并行合成检测多 种多肽的固相肽合成技术，成为多肽微阵列合成中 重要的方法。
Using pre- OPfp ester 试剂可预先
activated ODNP
配制
amino ODhbt acids
制备麻烦； 只有一部Hale Waihona Puke Baidu 可直接购买
所有基团脱保护
PART IIIA 微阵列在过敏原抗体谱 系分析中的应用
I型变态反应性疾病是一种常见病,大约有1 /4的人受该 疾病得困扰。治疗与预防I型变态反应性疾病的一项重要前 提是检测致敏原的种类,而目前临床可供检测的过敏原有二
多抗
免疫动 基于血清抗原的检 稳定，亲和好
物分离 测
有交叉反应
微阵列的介质
1.玻璃片 2.醋酸纤维膜、多聚高分子膜、PVDF膜 3.光盘
微阵列的样品
1.纯化蛋白 2.重组蛋白 3.单抗、多抗 4.氨基酸
微阵列生产方法
1.原位合成（in-situ synthesis ）：在载体 膜或玻片上连续添加目的氨基酸化学合成 短肽。