实验五 用大肠杆菌生长曲线的测定

优点：活菌计数，适用于特殊细菌。 优点：活菌计数，适用于特殊细菌。 缺点：计数结果为概值。 缺点：计数结果为概值。
光电比浊法
光电比浊法是利用在一定的范围内， 光电比浊法是利用在一定的范围内，微生物细 胞浓度与透光度成反比的原理。 胞浓度与透光度成反比的原理。当细菌细胞在 溶液中数量越多，浊度越大，在光电比色计中 溶液中数量越多，浊度越大， 测定时所吸收的光线越多。 测定时所吸收的光线越多。 优点：简便快速，适合于自动控制。 优点：简便快速，适合于自动控制。 缺点：测定结果受培养液成分影响； 缺点：测定结果受培养液成分影响；某些样品 样品不适合用此法。 样品不适合用此法。
实验67 实验67 水、环境中微生物的测定 一、实验目的
比较不同场所和不同条件下细菌的数量和 类型。 类型。 观察不同类群微生物的菌落形态特征。 观察不同类群微生物的菌落形态特征。 体会无菌操作的重要性。 体会无菌操作的重要性。 掌握水和环境中微生物的测定方法。 掌握水和环境中微生物的测定方法。 检测污染水域微生物的类型和数量。 检测污染水域微生物的类型和数量。
大肠杆菌生长曲线的测定 水、环境中微生物的测定
林亲雄 阎春兰 李晓华
实验31 实验31 大肠杆菌生长曲线的测定 一、实验目的
了解光电比浊计数法的原理。 了解光电比浊计数法的原理。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。 学习、掌握光电比浊计数的操作方法。 通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物 特征和规律，绘制生长曲线。 特征和规律，绘制生长曲线。
最大概率法
例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下： 例如：某细菌在稀释培养法中生长情况如下： 稀释度： 稀释度： 重复数： 重复数： 有菌生长管数： 有菌生长管数： 10-3 5 5 10-4 5 5 10-5 5 5 10-6 5 4 10-7 5 1 10-8 5 0
根据上述结果，数量指标为“541” 查表得近似值为17， 根据上述结果，数量指标为“541”，查表得近似值为17，乘 17 以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17×105个 以第一位数的稀释倍数，得出原始培养物的活菌数=17×
在 600 nm 波长下 ， 用未接种的 LB 液体培 nm波长下 用未接种的LB 波长下， LB液体培 养基作空白对照，分别对培养了0 12、 养基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、 16和 的大肠杆菌培养液， 16 和 20 h 的大肠杆菌培养液 ， 进行光电比浊 测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液, 测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未 接 种 的 LB 培 养 基 进 行 稀 释 ， 使 其 吸 光 值 在 65范围内 范围内。 0.1-0.65范围内。 比色皿经蒸馏水清洗后， 比色皿经蒸馏水清洗后 ， 必须经待测样 品润洗。 比色皿的毛面用吸水纸擦干， 品润洗 。 比色皿的毛面用吸水纸擦干 ， 而光 面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。 比色皿之间吸光度进行比较。 比色皿之间吸光度进行比较。
二、实验原理
生长曲线
将少量纯种单细胞微生物接种到定量的 液体培养基中，定时取样测定细胞数量， 液体培养基中，定时取样测定细胞数量， 以培养时间为横坐标， 以培养时间为横坐标，以菌数为纵坐标作 图，得到一条反映单细胞微生物在整个培 养期间菌数变化规律的曲线。 养期间菌数变化规律的曲线。 一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、 一个典型的生长曲线分为延缓期、对数期、 稳定期和衰亡期四个时期
四、实验结果
记录不同大肠杆菌培养液 大肠杆菌培养液的 记录不同大肠杆菌培养液的OD600值， 并绘制大肠杆菌的生长曲线。 并绘制大肠杆菌的生长曲线。
培养时间 （h） 光密度值 OD600
4
8
12
16
20
24
五、思考题
光电比浊计数的原理是什么？ 光电比浊计数的原理是什么？这种计数法有何 优缺点？ 优缺点？ 如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有 如果用活菌计数法制作生长曲线， 什么不同？两者各有什么优缺点？ 什么不同？两者各有什么优缺点？
本次实验完
二、实验原理
应用平板菌落计数技术测定污染水的细菌 总数。由于细菌种类繁多， 总数。由于细菌种类繁多，不可能找到一 种培养基在一种条件下， 种培养基在一种条件下，使所有的细菌均 能生长繁殖。因此， 能生长繁殖。因此，计算出来的细菌总数 仅是一种近似值。 仅是一种近似值。 利用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基可以大 致测定不同环境中存在的微生物。 致测定不同环境中存在的微生物。
本次实验安排
每组6 每组6人
比浊法测定大肠杆菌生长曲线。 比浊法测定大肠杆菌生长曲线。 倒牛肉Hale Waihona Puke Baidu蛋白胨平板12 12个 倒牛肉膏蛋白胨平板12个。 南湖水稀释分离涂布( 南湖水稀释分离涂布(6皿)。 口腔、 人民币、 门把手、 空气（ 10， 20， 口腔 、 人民币 、 门把手 、 空气 （ 10 ， 20 ， 30， 40， 50， min） 30 ， 40 ， 50 ， 60 min ） 、 自来水和橙汁 微生物的测定。 微生物的测定。（1种/人）
4.自来水、橙汁中微生物的测定
ml涂布牛肉膏蛋白胨平板 自来水用无菌 涂布牛肉膏蛋白胨平板。 取 1 ml 涂布牛肉膏蛋白胨平板 。 自来水 用无菌 三角瓶收集。 三角瓶收集。
四、实验结果
观测实验结果时间？ 观测实验结果时间？
计算每ml南湖水中含有微生物的数量。 计算每ml南湖水中含有微生物的数量。 ml南湖水中含有微生物的数量 你所测定的环境中微生物的数量和种类； 你所测定的环境中微生物的数量和种类 ； 并试着分别记录每种细菌的大小、 形态、 并试着分别记录每种细菌的大小 、 形态 、 干湿、透明度、颜色以及边缘等特征。 干湿、透明度、颜色以及边缘等特征。
实验室空气中微生物的测定 3.实验室空气中微生物的测定
将牛肉膏蛋白胨平板盖揭开，分别置实验台10 10， 将牛肉膏蛋白胨平板盖揭开 ， 分别置实验台 10 ， 20，30，40，50， min后 盖上皿盖，倒置培养。 20 ， 30， 40 ， 50， 60 min后 ， 盖上皿盖 ， 倒置培养 。
每个培养皿 加0.1ml 稀 释液
口腔、人民币和门把手微生物的测定 2.口腔、人民币和门把手微生物的测定
用棉签分别从牙周、 用棉签分别从牙周、人民币纸币和门把手表 面挑取微生物，然后放入装有0.5 ml无菌水的 无菌水的EP 面挑取微生物，然后放入装有0.5 ml无菌水的EP 管中，颠倒均匀后， 管中，颠倒均匀后，用移液器全部吸入牛肉膏蛋 (LTA) 白胨平板中，涂布均匀。 白胨平板中，涂布均匀。
最大概率法
待测菌液经十倍系列稀释， 每稀释度做3 待测菌液经十倍系列稀释 ， 每稀释度做 3-5 个重复， 经培养后， 检查细菌的生长， 个重复 ， 经培养后 ， 检查细菌的生长 ， 以有细 菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标， 菌生长的最后三个稀释度的管数作数量指标 ， 由数理统计表查出近似值， 由数理统计表查出近似值 ， 再乘以数量指标第 一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。 一位的稀释倍数，即为原菌液中的菌数。
三、实验器材
样品的采取
自来水 取自自来水管道。 取自自来水管道。 购于超市。 橙汁 购于超市。 口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。 口腔、人民币、门把手和实验环境中的微生物。 距水面10 10- cm的深层水样 的深层水样。 南湖水 距水面10-15 cm的深层水样。
培养基
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 。
三、实验器材
菌种 培养不同时段的大肠杆菌。 培养不同时段的大肠杆菌。 仪器或其他用具 分光光度计，比色皿等。 分光光度计，比色皿等。
四、实验步骤
1.样品测试前的调试 1.样品测试前的调试
开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 开电源，仪器预热20 min，将波长调至600 nm处 nm处。 打开样品室， 将挡光体插入比色皿架， 打开样品室 ， 将挡光体插入比色皿架 ， 将 其推或拉入光路。 其推或拉入光路。 盖好样品室盖， MODE下 盖好样品室盖，在T MODE下，按0%T键调零 透射比。 透射比。 取出挡光体， 100%T/OA键调 100% 透射比。 键调100 取出挡光体 ， 按 100%T/OA 键调 100% 透射比 。
名 南 湖 水 称 10-1 10-2 数 量 形 态 10-3 总数 自来水 口 腔 人民币 门把手 空 气 分钟） （分钟） （个 （个 （个 （个 /mL） /cm2） /cm2） /cm2） （个） mL）
五、思考题
你所测定的南湖水的污染程度如何？ 你所测定的南湖水的污染程度如何？ 通过本次实验， 通过本次实验，在防止培养物的污染与防 止细菌的扩散方面，你学到了什么？ 止细菌的扩散方面，你学到了什么？有什 么体会？ 么体会？
2.样品测定 2.样品测定
将参比溶液（未接种的LB液体培养基） LB液体培养基 将参比溶液（未接种的LB液体培养基）以及 被测溶液倒入比色皿中。 被测溶液倒入比色皿中。 打开样品室盖， 打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。 将参比溶液推入光路， 100%T/OA键调满度 键调满度。 将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满度。 MODE， 将测试方式调至吸光度方式（ 按 MODE ， 将测试方式调至吸光度方式 （ A ） 。 此时,显示器显示“ 000”。 此时,显示器显示“0.000 。 将被测溶液推入光路， 将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样 品的吸光值。 品的吸光值。
微生物数量的测定方法
稀释平板计数法 显微镜直接计数法 最大概率法 光电比浊法
稀释平板计数法
对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：活菌计数方法，对设备要求不高。 优点：活菌计数方法，对设备要求不高。 缺点：操作复杂。 缺点：操作复杂。
显微镜直接计数法
使用血球计数板在显微镜下直接计数。 使用血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。 优点：操作简便，计数直观。 缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。 缺点：计数结果为活细菌和死菌体的总和。
仪器或其他用具
灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。 灭菌培养皿，无菌枪头，涂棒等。
四、实验步骤
1.南湖水中微生物的测定 1.南湖水中微生物的测定
N-乙酰葡糖胺
无菌操作采用10 无菌操作采用10-1， 10-2 ， 10-3稀释液涂布牛肉膏 蛋白胨平板;每个稀释度2个重复。 蛋白胨平板;每个稀释度2个重复。