D-二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用

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中国医药生物技术 2012 年 6 月第 7 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2012, Vol. 7, No. 3
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.013
·技术与方法·
D-二聚体单克隆抗体制备
及其在免疫荧光快速定量检测中的应用
康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华
D-二聚体（r，D-D）是纤维蛋白单体经活化因 子 XIII 作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解 所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特 异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能[1]。与纤维 蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成（DVT）、肺栓塞 （PE）和弥漫性血管内凝血（DIC）等，均可导致体内 D-D 水平升高[2-6]。近年来 D-D 的临床应用范围越来越广，除 了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病、脓 毒血症的诊断以及溶栓治疗监测方面均具有重要的参考价 值[7-9]。
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1.2.3 mAb 特异性鉴定 1.2.3.1 抗体交叉反应性研究 用间接 ELISA 法测定。 将 D-D、纤维蛋白原、纤维蛋白原降解物、D 片段、E 片 段包被于 ELISA 微孔板，加入抗体，再加入二抗 HRP 标 记的羊抗鼠-IgG，进行显色反应。 1.2.3.2 免疫印迹法测定单抗特异性 天然状态的 D-D 为二聚体，且与纤维蛋白原有同源性，故采用非还原蛋白、 还原蛋白、纤维蛋白原及其降解片段进行检测。D-D 分子 量约为 200 kD，纤维蛋白原分子量约为 340 kD，降解后片 段约 47 ~ 150 kD 不等。因此，为确保纤维蛋白原各片段均 转移到硝酸纤维素膜上，经预实验，选取 5% 浓缩胶，8% 分离胶进行 SDS-PAGE 电泳，上样量 1 μg，并以预染 marker 作示踪。待 50 kD 条带达到分离胶下缘约 3 cm 左 右处，停止电泳，进行湿转印。转印条件为 300 mA，4 ℃， 恒流转印 2 h，于转印后用丽春红 S 染色，确认转印效果。 以 3% BSA 封闭，放置 4 ℃ 封闭过夜。室温下加一抗孵 育 1 h，一抗浓度为 1 μg/ml，用 PBST 洗涤 4 次，每次 10 min；室温下加二抗，二抗稀释比例为 1:20 000，用 PBST 洗涤 4 次，每次 10 min，以增强型化学发光（ECL）为底 物，进行显影。 1.2.3.3 mAb 亲和力测定 采用非竞争酶免疫试验，参照 David Beatty 方法[13]，按公式 Ka = (n-1)/2(n[Ab′]t － [Ab]t) 计算亲和常数 Ka 值。分别以每孔 0.5、0.25、0.125 μg/ml 的 D-D 蛋白包被 ELISA 板，加入倍比稀释的 mAb，37 ℃ 作用 30 min 后，加入 1:20 000 稀释的 HRP 标记羊抗 鼠-IgG，37 ℃ 反应 30 min，TMB 显色，测 450 nm OD 值。 以 mAb 浓度对数为横坐标，以 OD 值为纵坐标，得到 OD 值对抗体浓度的对数作图，以每条曲线上部平坦段的 OD 值作为 100%，在曲线上查出 50% 的 OD 值所对应的 mAb 浓度，然后按公式计算出亲和常数。n = [Ag′]t/[Ag]t， [Ag′]t 和 [Ag]t 为不同包被抗原的浓度；[Ab′]t、[Ab]t 是 对应不同包被抗原的浓度条件下，将抗体梯度稀释得到最大 吸光度一半处的抗体浓度。 1.2.4 免疫荧光定量方法的建立及临床应用 1.2.4.1 标准曲线建立 将 D-D 蛋白稀释到 10、5、1、 0.5、0.2 和 0.1 μg/ml 浓度，以血凝仪检测各定标点得到实 际浓度，使用定值后的系列梯度蛋白溶液作为实验标准品。 根据检测标准品的定标浓度及测得的荧光值确定数据处理 方法，绘制标准曲线，得到方程。 1.2.4.2 临床初步应用 使用筛选到的抗 D-D 配对抗体 建立双抗体夹心法，利用“飞测”免疫荧光定量检测仪检测 临床样本荧光信号，将测得的荧光值代入方程，反求出样本 实际浓度，并将样本测得的浓度与医院检测浓度对比，计算 相关系数。 1.3 统计学处理
采用直线相关与统计学方法进行分析。以 Pearson 乘 积矩相关系数定量表述线性相关的程度。P < 0.05 为差异 显著。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 经过 4 次细胞融合，采用间接 ELISA 法进行反复筛
选，3 ~ 5 次亚克隆，最终获得 7 株稳定分泌特异性抗 D-D 抗体的细胞株，对其进行亚克隆建株保存。后经 ELISA 抗 体配对实验，筛选出 2 株配对效果好的抗体，命名为 2-6D、 4-4C，进行以下抗体鉴定分析及临床应用评价。 2.2 抗 D-二聚体单抗的鉴定 2.2.1 效价测定 mAb 的效价采用间接 ELISA 法测定。 结果显示，2 株抗体 2-6D 和 4-4C 的效价分别为 0.321 × 10-6 和 0.372 × 10-6。效价均大于 1:105。 2.2.2 Ig 类和亚类的鉴定 经小鼠 mAb 分型试剂盒测 定，所获得的两株抗 D-D mAb 为 IgG2a 亚类。 2.2.3 mAb 特异性鉴定 2.2.3.1 抗体交叉反应性研究 结果显示，两株单克隆抗 体与纤维蛋白原及其降解物，D 片段和 E 片段不发生反 应，与 D 单体有反应。 2.2.3.2 免疫印迹法测定单抗特异性。如图 1A、图 1B 所 示，两株 mAb 与非还原的 D-D 蛋白呈阳性反应，与其他 蛋白包括还原 D-D 均不反应。
基金项目：“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX09506-001） 作者单位：510640 广州，华南理工大学生物科学与工程学院（康可人、 卢艳华）；510663 广州万孚生物技术有限公司国家地方联合自检型快速 检测工程实验室（康可人、吴培钿、张健、唐时幸、王继华） 通讯作者：康可人，Email：keren_kang@ 收稿日期：2012-02-16
目前 D-D 蛋白检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸 附法（ELISA）和第二代胶乳凝集法（免疫比浊法）[10]。胶 体金法快速简单，但无法实现定量检测；ELISA 法可精确 定量，但操作步骤繁琐；免疫比浊法敏感性高，检测结果准 确，但试剂以进口为主[11]。荧光免疫定量检测技术，属于即 时检测（point-of-care testing，POCT）[12]领域的新兴技术， 能快速、灵敏、简便地实现指标的定量检测，免疫荧光定量 检测技术经过一定阶段的发展，目前主要在感染性指标（如 C 反应蛋白）和心脏标志物指标的应用上较为多见，厂家 以欧美、韩为主。本研究利用杂交瘤技术制备筛选能稳定分 泌特异性抗 D-D 抗体的细胞株，初步应用于免疫荧光定量 检测平台，实现对 D-D 快速定量检测，为临床相关疾病的 诊断、治疗、监测提供有效工具与手段。
1234
1 2 3 4 M kD
118 90
50
A
B
M：Marker；1：纤维蛋白原降解物；2：纤维蛋白原；3：D-D 还原蛋
白；4：D-D 非还原蛋白
图 1 4-4C（A）与 2-6D（B）抗体免疫印迹分析
2.2.4 mAb 亲和力测定 采用非竞争酶免疫试验，参照 David Beatty 方法测定。两株单抗与 3 个不同包被浓度的 D-D 蛋白均特异性结合，经 Beatty 推导公式，计算亲和常 数，结果显示单克隆抗体 2-6D 和 4-4C 的亲和常数分别为 9.84 × 10-7 和 1.46 × 10-6。结果见图 2。 2.3 免疫荧光定量方法的建立及临床样本检测结果 2.3.1 标准曲线建立 将 D-D 蛋白稀释到 10、5、1、0.5、 0.2、0.1 μg/ml 浓度，血凝仪检测各定标点，得到实际浓度 分别为 10、5.03、1.03、0.53、0.32、0.11 μg/ml。以此系列 梯度蛋白溶液作为实验标准品，D-D 浓度值为横坐标，荧 光检测值为纵坐标，绘制标准曲线。由标准曲线可以得出， 检测浓度的线性范围在 0. 1 ~ 10 μg/ml，荧光信号强度与浓 度之间的线性关系表达式是 y = 0.0016x3 － 0.0367x2 + 0.5177x + 0.7892（y 表示荧光信号强度，x 表示 D-D 浓 度）。根据公式计算 r² = 0.9996。结果见图 3。
箱为美国 Thermo 公司产品；SDS-PAGE 电泳仪购自北京 六一公司；飞测免疫荧光定量检测仪由广州万孚生物技术有 限公司研制；高速冷冻离心机为日本 Hitachi 公司产品； ACL TOP 血凝分析仪为美国 Beckman 公司仪器，D-D 检 测试剂为西班牙 Werfen Group 产品。 1.1.3 临床样品来源 自 2011 年 1 月至 6 月期间，收 集江门市五邑中医院门诊病人血浆（枸橼酸钠抗凝血，离心 收集血浆），共 106 例。D-二聚体含量均经血凝仪定值。 1.2 方法 1.2.1 杂交瘤细胞株的建立 取 6 ~ 8 周龄的 BALB/c 小鼠，首次免疫将福氏完全佐剂与等体积的 D-D 蛋白乳化 后于小鼠皮下、足垫处注射，50 μg/只，经 3 次加强免疫后， 尾静脉采血，间接 ELISA 法检测小鼠血清效价，效价大于 104 的小鼠，腹腔冲击免疫 1 次，3 d 后取其脾细胞制备杂 交瘤。细胞融合按照常规半固体法进行。将离心好的融合细 胞，依次加入 FBS、饲养细胞、HAT 溶液、半固体培养基， 定容至 40 ml，置于混匀仪上混匀 30 min 后，分别倒入 30 个培养皿中，确保半固体均匀贴皿底，装入湿盒，37 ℃， 5% CO2 培养箱中培养。5 ~ 7 d 后，挑选大小适中的单集 落克隆，转入 96 孔板培养，细胞长至培养孔面积 50% 后， 用间接法检测细胞上清，筛选高效价的细胞株进行多次亚克 隆，确保细胞株在体外连续传代 3 个月和多次冻存后再复 苏仍能稳定分泌抗体。经定株后常规制备腹水，采用小鼠体 内诱生法制备腹水，经正辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化， 制备单克隆抗体。 1.2.2 单克隆抗体的鉴定 1.2.2.1 效价测定 单克隆抗体的效价采用间接 ELISA 法测定。用 D-二聚体蛋白（1 μg/ml）包被 ELISA 板，将 抗体稀释到 1 mg/ml 后，从 1:1000 浓度开始做 10 倍稀 释，加入板中，37 ℃ 孵育 1 h，洗涤后加二抗 HRP 标记 的羊抗鼠-IgG 反应，洗涤后加入 TMB 底物显色，设阴性 （N）、阳性（P）对照。效价以 P/N > 2.1 为阳性标准。 1.2.2.2 Ig 类和亚类的鉴定 采用小鼠 mAb 分型试剂 盒测定抗 D-D 单抗的 Ig 亚类。依照试剂盒说明书操作。