质粒提取和酶切分析
质粒DNA的提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀 内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变 性并形成交联的网状结构
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环
试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)，
25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml
冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；
5×TBE缓冲液：0.45mol/L Tris－硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10×Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50％的甘油； 无水乙醇；70％乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10× buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。
质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放 置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤 一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干， 然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓 冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)， 存于－20℃或直接用于酶切。
质粒提取及双酶切鉴定内切酶内切重组质粒
纯化质粒
通过吸附、洗涤等步骤进一步 纯化质粒DNA。
02 双酶切鉴定
双酶切鉴定的原理
酶切原理
双酶切鉴定基于限制性内切酶对DNA的特异性切割，通过两种不同的限制性内 切酶对质粒进行切割，产生特定的DNA片段。
产物分析
通过电泳分析切割后的DNA片段，判断是否出现预期的酶切产物，从而确定重 组质粒是否正确。
酶切效率计算
通过比较酶切前后的质粒浓度，可以计算出酶切效率。
重组质粒鉴定
通过对比酶切后的质粒片段和预期的重组质粒片段， 可以初步判断重组质粒是否被成功构建。
序列分析
对重组质粒进行序列分析，可以进一步确认重组质粒 的准确性。
实验结果分析注意事项
确保电泳结果的可信度
01
在分析电泳结果时，应排除假阳性或假阴性的可能，确保结果
筛选与鉴定
通过特定的筛选和鉴定方法，如菌落PCR、酶切分析和电泳检测 等，对重组质粒进行筛选和鉴定。
内切酶内切重组质粒的步骤
酶切反应
将重组质粒与适量的内切酶混合，进行酶切 反应。
胶回收
通过凝胶电泳分离酶切产物，并使用胶回收 试剂盒回收目的片段。
连接反应
将两个不同的DNA片段进行连接，形成新的 重组分子。
质粒提取及双酶切鉴定 内切酶内切重组质粒
目录
CONTENTS
• 质粒提取 • 双酶切鉴定 • 内切酶内切重组质粒 • 实验结果分析
01 质粒提取
质粒提取方法
01
02
03
碱裂解法
利用高pH值环境下质粒 DNA与细胞基因组DNA 的变性差异，将二者分离。
煮沸法
通过加热使细胞破裂，释 放质粒DNA，再通过离心 将质粒DNA与其他细胞成 分分离。
质粒提取定量与酶切鉴定
三、质粒DNA的酶切分析
• 质粒 DNA: ～3 kb
载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb
质粒提取定量与酶切鉴定
限制性内切酶
• 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。
• 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为 4～6个核苷酸的反向重复序列。
质粒提取定量与酶切鉴定
琼脂糖凝胶电泳上样
-
1234
+
每组上2个样品
1：DNA Marker（ 5 l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 l ）
质粒提取定量与酶切鉴定
DNA Marker (ladder)
质粒提取定量与酶切鉴定
组成
Loading Buffer 上样缓冲液
实验流程图
一、碱裂解法提取质粒
二、质粒定量
最后做
三、质粒酶切
四、酶切产物的琼脂糖电泳检测
质粒提取定量与酶切鉴定
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术
质粒提取定量与酶切鉴定
实验材料
• 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒
• EDTA • 甘油 ……………增大溶液密度 • 溴酚蓝…………指示剂 • 二甲苯胺蓝……指示剂
0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，
迁移率
溴酚蓝=300bp
二甲苯胺蓝=4kbp 质粒提取定量与酶切鉴定
➢染色
✓溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB) :3,8-二 氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA 分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射 下呈现红橙荧光,
基础生物化学实验实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶切分析)
(2) 挑选单菌落，在无菌条件下放入5 ml LB液体培养基中 （100 g /ml氨苄青霉素），200-300 rpm，37℃过夜培养。 (3) 取1.5 ml菌液（其余菌液加入25%的灭菌甘油，放入对 应编号的1.5 ml离心管中，-70℃ 下作菌种保存），5000 g离心5 min。 (4) 弃上清夜，加入100 l预冷的溶液I，悬浮沉淀，室温 放 置5 min。 (5) 加入200 l 新鲜的溶液II，边加边震荡，但不能剧烈， 冰上放置5 min。 (6) 加入75 l溶液III，震荡混匀，冰上放置5 min。 (7) 12000 g 离心5 min。 (8) 取上清液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，12000 g离 心10 min。 (9) 用1 ml 70%的乙醇洗涤沉淀，空气中放置3-5 min。 (10) 用30-50 l TE溶解，用紫外分光光度计进行DNA含量 测定，EB琼脂糖(1.4%)凝胶电泳分析。
实验六 质粒DNA的提取(碱裂解法)及酶分析
(1) 溶液配制： 溶液 I 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 溶液 II 0.2 mol/L NaOH 0.5% SDS 溶液 III 3 mol/L KAc (用冰醋酸调 pH值至5.0)
质粒DNA的酶切分析参照相关酶的说明书 操作步骤进行
质粒DNA提取与酶切方法的比较研究
结论总的来说，各种质粒DNA提取方法和酶切方法都有其优缺点。在选择方 法时，应根据具体的研究需求和实验条件进行选择。常规提取方法虽然操作繁琐， 但成本低廉且产量高；快速提取方法和生物素法则具有快速、简便和高纯度的优 点，但成本较高。对于酶切方法，单一酶切操作简便但适用范围有限；双酶切和 全酶切则能实现复杂切割，但操作较复杂且成本较高。
（2）双酶切
双酶切是使用两种不同的限制性内切核酸酶对DNA进行切割。该方法可实现 对复杂基因组或多个位点的精确切割，适用范围更广。但是，双酶切操作相对复 杂，需要更多时间进行优化和调整。
（3）全酶切
全酶切是使用一种或多种限制性内切核酸酶以及修饰酶等对DNA进行切割。 该方法可根据实验需求对DNA进行的优点是高度灵活，适用范围广泛。然而，全酶切需要更多的实验设计和操 作技巧，且成本较高。
比较研究
1、操作难易程度及成本
在操作难易程度方面，快速提取方法和生物素法相对简单，而常规提取方法 较为繁琐。在成本方面，生物素法和快速提取方法所需试剂和设备成本较高，而 常规提取方法成本较低。
2、纯度和产量
在纯度方面，生物素法和快速提取方法纯度较高，而常规提取方法纯度相对 较低。在产量方面，常规提取方法和快速提取方法产量较高，而生物素法产量较 低。
质粒DNA提取方法
1、常规提取方法
常规提取方法是一种经典的分步提取方法，包括裂解细胞、分离质粒DNA、 洗涤和纯化等步骤。该方法的主要优点是适用范围广，可从各种细胞中提取质粒 DNA。但是，该方法操作繁琐，提取周期较长，需要使用大量试剂和设备。
2、快速提取方法
快速提取方法是通过优化常规提取方法中的某些步骤，实现快速、简单的质 粒DNA提取。该方法主要优点是操作简便、快速，可减少试剂和设备的使用。但 快速提取方法可能会牺牲一些纯度或产量。
质粒的提取酶切 实验报告
实验一质粒的提取酶切实验目的掌握质粒小量快速提取法。
用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度。
实验原理质粒是一种染色体外的稳定遗传因子。
大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞的某些表型。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。
用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。
在细胞内，共价闭环DNA（cccDNA）常以超螺旋形式存在。
若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（ocDNA）。
在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。
EcoR I和Bgl II的识别序列和切口是： EcoR I：G↓AATTCBgl II: A↓GATCTG，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。
限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。
实验步骤（一）质粒的提取ɑ的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青（二）1.培养细菌将带有质粒DH5霉素的1×LB中，37℃培养过夜。
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
质粒DNA的提取酶切及检测
加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性
12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管
上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管
（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）
12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管
醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条 件会打断DNA。
▪ 平衡酚：氯仿（1：1）
作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚 的比重略比水重，不利于含质粒的水相的 回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得 酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。
▪ 乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀
▪ TE缓冲液：溶解DNA
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
四、实验结果与讨论
根据观察结果，绘图。 分析自提质粒的情况以及酶切情况。
相关知识
基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内， 使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻 译、表达的操作
包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细 胞内的保持、转录、翻译表达等全过程
基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、 受体细胞
常用到的工具酶
限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 DNA酶和RNA酶
平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置 上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT’|ATC …… 3’
3’…… CTA’|TAG …… 5’
切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同 样可以通过DNA连接酶连接起来。
实验二-质粒DNA的提取及酶切
实验二质粒DNA的提取及酶切（8学时，6小时）一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。
二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。
环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA，内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。
三、仪器、材料、试剂(一)仪器：1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器(二)材料：1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶15、氨苄青霉素16、离心管(三)试剂：1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)5、0.5mol/LEDTA6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)8、70%乙醇9、胰RNA酶10、ECOR I酶四、实验步骤（一）质粒DNA的提取1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培养过夜。
2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中，4000r/min，倒出培养液，将所有菌体细胞收集在一个离心管中。
3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。
4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置)，轻轻混匀内容物，溶液逐渐变清亮后加入溶液Ш(千万不可用旋涡震荡器，裂解时间不超过5min)。
5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。
质粒提取及酶切实验的注意事项
质粒提取及酶切实验的注意事项一、前言质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的实验技术。
在执行实验时，需要遵守一些注意事项，以确保实验能够成功并得出可靠的结果。
本文将重点介绍质粒提取和酶切实验中应注意的事项。
二、质粒提取实验的注意事项1.使用高质量的DNA提取试剂：DNA提取试剂的质量对提取的DNA质量和纯度有很大的影响，因此选择高质量的试剂非常重要。
2.应用适当的细胞培养技术：细胞培养技术对于细胞表达和提取相应DNA质量至关重要，因此选择合适的培养条件非常重要。
3.注意DNA的浓度：在质粒提取过程中，需要注意DNA的浓度，因为浓度过低或过高都会影响后续的实验结果。
4.遵守标准协议：在进行质粒提取实验时，必须严格遵守标准协议，包括使用正确的试剂、设备和方法。
5.注意杂质的干扰：在提取质粒的过程中，可能会出现杂质，如蛋白质或RNA。
这些杂质可能会干扰后续实验的结果，因此必须尽可能去除。
三、酶切实验的注意事项1.使用高质量的酶：选择适当的酶是酶切实验成功的关键。
不同的酶适用于不同的DNA序列，因此必须选择合适的酶。
2.注意酶的浓度和反应时间：酶切实验中，酶的浓度和反应时间都对结果有很大的影响，因此必须严格控制这些参数。
3.遵循标准协议：遵循酶切实验的标准协议非常重要，包括所需的材料、浓度、反应时间严格按照说明书进行。
4.注意反应体系的条件：酶切反应过程需要在适当的缓冲液中进行。
必须确保缓冲液的pH、离子浓度、反应温度等条件是合适的。
5.注意合适的质控实验：在酶切反应中，应该与相应的对照样品一起进行，以确保实验的准确性和精确性。
四、总结在分子生物学中进行质粒提取和酶切实验是很常见的实验技术，这些实验的成功非常重要，因为它们是分子生物学实验的基础。
在进行实验前，必须了解每个步骤的重要性和所需的操作技能。
在实验的过程中必须严格按照规定的方法和协议进行。
通过遵守上述注意事项和规程，可以获得高质量的实验结果。
质粒酶切实验报告讨论
一、实验背景质粒是细菌染色体外的DNA分子，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中。
质粒DNA在分子生物学研究中具有重要意义，如基因克隆、基因表达、基因编辑等。
质粒酶切实验是分子生物学实验中的一项基础技术，通过限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒DNA，得到特定的DNA片段，从而实现基因克隆、基因表达等目的。
本实验旨在通过质粒酶切实验，对提取的质粒DNA进行酶切，并利用琼脂糖凝胶电泳技术检测酶切结果，以验证实验的准确性。
二、实验方法1. 质粒DNA提取（1）采用碱裂解法提取质粒DNA，具体操作如下：① 将含有质粒的细菌培养至对数生长期，收集菌液。
② 向菌液中加入溶菌酶，37℃水浴30分钟，使细胞壁破裂。
③ 加入等体积的碱液（NaOH），混匀，室温放置5分钟。
④ 加入等体积的冰乙酸，混匀，室温放置5分钟。
⑤ 12,000 r/min离心5分钟，取上清液。
⑥ 加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
⑦ 12,000 r/min离心10分钟，弃上清液。
⑧ 加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，12,000 r/min离心5分钟。
⑨ 弃上清液，将沉淀溶于50μl TE缓冲液中。
（2）检测质粒DNA浓度和纯度，具体操作如下：① 使用紫外分光光度计测定质粒DNA在260nm和280nm处的吸光度值。
② 根据公式计算质粒DNA浓度和纯度。
2. 质粒DNA酶切（1）选择合适的限制酶，根据质粒DNA序列设计酶切位点。
（2）配制酶切反应体系，包括质粒DNA、限制酶、缓冲液等。
（3）将反应体系置于37℃水浴中酶切反应4小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳检测（1）配制琼脂糖凝胶，加入适量的溴化乙锭（EB）。
（2）将酶切后的质粒DNA样品和DNA分子量标准样品加入琼脂糖凝胶孔中。
（3）100V电压电泳1小时。
（4）紫外灯下观察并拍照记录电泳结果。
三、实验结果与分析1. 质粒DNA提取结果通过紫外分光光度计检测，质粒DNA浓度为100ng/μl，纯度为1.8（A260/A280），符合实验要求。
质粒DNA的提取与酶切
生物化学实验报告质粒DNA的提取与酶切质粒DNA的提取与酶切一实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；（临用前混合）溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用：对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用：SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
质粒的提取与酶切实验报告
质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的方法，用于提取和分离特定的DNA 分子或者蛋白质分子。
这些分子通常用于进一步的分析和研究，比如测序、克隆、表达、结构分析等。
质粒提取是指从细胞或组织中提取DNA 的过程。
这通常包括将细胞破碎或消化，然后使用不同的化学方法去除蛋白质、脂质和其他污染物，最后得到纯的DNA。
常用的质粒提取方法有沉淀法、超声法、溶剂法、离心法和酶法等。
酶切实验是指使用酶切特定的序列，将DNA 或蛋白质分割成较小的片段的实验。
常用的DNA 酶有限制性内切酶、全基因组酶和多克隆抗体酶，常用的蛋白质酶有蛋白酶K、蛋白酶D 和蛋白酶R。
酶切实验可用于检测和鉴定特定的DNA 序列或蛋白质分子、研究基因组结构和功能、分离和纯化蛋白质分子等。
在进行质粒提取和酶切实验时，应注意实验条件的控制，包括温度、pH 值、酶的活性和浓度、酶的孵育时间和物质的浓度等。
此外，应注意保护样品的纯度，避免受到污染或酶的抑制。
在进行酶切实验时，还应注意使用适当的酶抑制剂来控制酶的活性，以防止不必要的酶切。
在实验报告中，应详细记录实验条件和步骤，并描述样品的特征和纯度。
对于质粒提取实验，应记录使用的提取方法、提取效率和纯度，并对提取的质粒进行简单的鉴定。
对于酶切实验，应记录使用的酶种类和条件、酶切特异性和效率，并对酶切的片段进行简单的鉴定。
总的来说，质粒提取和酶切实验是分子生物学中常用的基础实验，在进行这些实验时应注意实验条件的控制和样品的纯度，并在实验报告中详细记录实验条件和结果。
实验一 质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测
实验一质粒提取、酶切及琼脂糖电泳检测一、实验内容1.采用碱裂解法提取质粒DNA2.采用限制性内切酶对质粒进行酶切3.采用琼脂糖电泳对所提取的质粒DNA及其酶切产物进行鉴定二、实验目的和要求1.掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法2.掌握限制性内切酶酶切DNA的操作过程3.掌握琼脂糖电泳的原理和方法三、实验仪器、材料和试剂1.仪器：摇床、无菌操作台、离心机、电泳仪、凝胶成像仪等2. 材料：移液枪、枪头、离心管、三角烧瓶等3. 试剂：LB培养基，卡那霉素，质粒提取试剂盒，琼脂糖，电泳缓冲液TAE,核酸染料，DNA Marker(DL2000，λ-Hind III digest DNAMarker), Eco R I内切酶等。
四、实验操作1. 质粒提取（1）挑取单菌落至3 mL LB液体培养基，37℃摇动（200 rpm）培养过夜。
（2）转移菌液至1.5 mL Eppendorf管中，12000 rpm离心45 sec，尽量弃尽上清。
（3）加入250 l 预冷的PI(请先检查是否加入RNaseA)，使用移液器彻底混匀细菌沉淀，充分悬浮，静置2 min。
注意：如果有未彻底悬浮的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度的偏低。
（4）向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈振荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。
此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒收到破坏。
如果未变得清亮，可能菌体过多，裂解得不彻底，应减少菌体量。
（5）向离心管中加入350ul 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。
12,000rpm离心1min，此时在离心管底部形成沉淀。
注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小的白色沉淀，可再次离心后取上清。
（6）向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12,000rpm 离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附管重新放入收集管中。
实验六 质粒DNA的提取与酶切
实验六质粒DNA的提取与酶切姓名：mangogola质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行复制，并使子代细胞保持他们恒定的拷贝数。
目前质粒已广泛用于DNA分子无性繁殖的运载体，同时也是研究DNA结构和功能的较好模型。
质粒一般来自细菌，分离和纯化的方法有很多但都包括以下几个步骤：细菌培养和质粒扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。
细菌裂解时常用溶菌酶和SDS或氢氧化钠和SDS的混合物作为裂解液，这样染色体DNA可以形成折叠状结构附着在细胞膜碎片上，离心时容易沉出，质粒DNA存在于上清液中，其中还含有可溶性蛋白和RNA等，用蛋白酶或核糖核酸酶使他们降解，通过碱性酚和氯仿-异戊醇混合液抽提除去蛋白等杂质。
质粒的酶切使用限制性内切酶，它是一类识别双链DNA中特殊核苷酸序列并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内切脱氧核糖核酸酶。
限制性内切酶产生的DNA片段末端有两种形式：粘性末端和平齐末端。
影响限制性内切酶作用效率的影响因素有：DNA甲基化、DNA 纯度、酶用量、反应温度以及反应的缓冲体系等等。
一．实验过程1.细菌培养无菌条件下用接种环挑取少量冻结的菌种接到平皿上（可平板划线分离单菌落），37℃培养8-12h。
用牙签挑取单菌落接入含有氨苄青霉素溶液的液体培养基中，封口，37℃振荡培养6-12h。
2.碱裂解法提取质粒DNA连续取1ml菌体两次通过离心累积至一个EP管中。
将细菌沉淀重悬于100uL预冷的溶液Ⅰ中，振荡器上剧烈震荡混匀。
加入200uL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒混匀5次，不要震荡，将离心管置于冰上5min。
加入150uL预冷的溶液Ⅲ盖紧管口，倒置后温和震荡10s，之后将离心管置于冰上3-5min。
4℃,12000g离心5min，上清液转移至一新管中。
加入等量的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，震荡1-2min。
4℃,12000g离心2min，上清液转移至一新管中。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
动物分子生物学实验6重组质粒DNA的提取及插入DNA的酶切鉴定
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四、实验步骤
接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜
取1.5ml菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）
10min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体
3 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液Ⅰ中，充分混匀，室 温放置10 min。
4 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管盖，混匀内 容物，将离心管放冰上5 min。
5 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数 次使混匀。冰上放置15min。
6 12 000r/min，离心10 min，将上清转至另一离心管中。 向上清中加入等体积酚：氯仿 (1:1)（去蛋白），反复 混匀，12 000r/min，离心5 min，将上清转至另一离心 管中。转移时小心！（total volume: 400 μL）
－ 原核细胞 － 繁殖力强, 2-30 分细胞分裂、加倍
DNA
基因组107bp, 编码约2000种蛋白质
质粒（plasmid）
－ 染色体外的稳定遗传因子
－ 双链、闭环的DNA分子，大小1-200 kb 不等 － 存在于细菌、放线菌和真菌细胞中
－ 具有自主复制和转录能力，并表达所携带的遗传信息
DNA
*溶液II 0.2mol/L溶液(3M, pH=4.8)：
60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O
*饱和酚(pH8.0 Tris-HCl饱和) *氯仿 *3M乙酸钠溶液(pH5.2) * TE缓冲液:
10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, * 100%乙醇与70％乙醇
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如Xba1和Nhe1:
5‘…T|CTAGA…3’ 5‘…G|CTAGC…3’
3‘…AGATC|T…5’ 3‘…CGATC|G…5’
5‘…T CTAGA…3’ CTAGC…3’
3‘…AGATC T…5’ G…5’
5‘…G 3‘…CGATC
5‘…TCTAGC…3’ 3‘…AGATCG…5’
杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌
(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。 这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基 因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功 能及表达非常有用的工具。
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1) 寄主控制的限制与修饰现象
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4) 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含 有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以 及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限 制酶的活性。
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一 位置上切割双链，产生平头末端。例如
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2. 相关基础知识
限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分 子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中 用于体外剪切基因片段的重要工具酶。
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上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异 性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性 内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠
❖ 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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3. 酶切反应的设计一般应注意问题:
1) 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于 12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑 制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总 体积的10%。
同裂酶差别只在于当识别顺序中有 甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶
可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和 MspⅠ的识别顺序都是
5’……G|CG G……3’ 3’……G GC|G……5’
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同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却 能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾 酶
同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将 这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被 破坏。
构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识 别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位 置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性 的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定 长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
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第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷 酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由 于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专 一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中 最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可 以有两种方式：
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粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链 末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢 键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
质粒提取和酶切分析
中心实验室
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质粒DNA的限制性内切酶酶切分析
1. 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性、
掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶 切的原理和方法 ，并理解限制性内切 酶是DNA重组技术的关键工具。
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Hale Waihona Puke 感受态细胞转化效率＝转化子总数 ／感受态细胞总数
EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连
接起来。
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3） 同裂酶和同尾酶：
异源同工酶：又称同裂酶有时两
种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切 割位置都相同，这些有相同切点的酶称 为同裂酶（或同切酶）。
2) 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小 体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液, 从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反 应 的 基 因 组 DNA 浓 度 为 0.1-0.4ug/ul 。 同 时 RNA 应 该尽量消化去除。
3) 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选 择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。
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2)限制性核酸内切酶的类型及特性
按限制酶的亚基组成和切断核酸情况 的不同，分为三类：
Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型
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第一类（I型）限制性内切酶能识别专一 的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任 意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一 性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结
限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各 种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内 切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但 合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞 还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制 性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主 控制的限制与修饰现象。
这些粘性末端连医学接ppt后，Xba1和Nhe1酶将 17
4) 限制性核酸内切酶的命名法
❖ 用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。
❖ 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。