真核基因在大肠杆菌中表达
生物技术制药习题及答案
生物技术制药习题及答案一、选择填空题1.酶的主要来源是什么？微生物生产。
2.第三代生物技术是什么？基因组时代。
3.基因治疗最常用的载体是什么？质粒载体和λ噬菌体载体。
4.促红细胞生长素基因可在大肠杆菌中表达。
但不能用大肠杆菌工程菌生产人的促红细胞生产素为什么？因为大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化，人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用。
5.菌体生存所需能量已菌有氧代谢所需能量在什么情况下产生代谢产物乙酸？菌体生长所需能量（大于）菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。
6.cDNA第一链所合成所需的引物是什么？cDNA第一条链合成所需引物为PolyT。
7.基因工程制药在选择基因表达系统时首先考虑什么？表达产物的功能。
8.为了减轻工程菌代谢负荷，提高外源基因表达水平可采取什么措施？将宿主细胞生长和外源基因的表达分成两个阶段。
9.根据中国生物制品规定要求，疫苗出厂需要经过哪些检验？理化检定、安全检定、效力检定。
10.基因工程药物化学本质是什么？蛋白质。
11.PEG诱导细胞融合？PEG可能与可能与临近膜的水分相结合，使细胞之间只有微笑空间的水分被PEG取代，从而降低了细胞表面的极性，导致双脂层的不稳定，使细胞膜发生融合。
12.以大肠杆菌为目的基因表达系统的表达产物，产物位置是什么？胞内、周质、胞外。
13.人类第一个基因工程药物是什么？重组胰岛素。
14.动物细胞培养的条件是什么？温度:哺乳类37昆虫25~28，ph7.2~7.4，通氧量：使co2培养箱，不同动物比例不同。
防止污染，基本营养物质：三大营养物质+维生素，激素，促细胞生长因子，渗透压：大多数260~320。
15.不属于加工改造抗体的是什么？单域抗体。
16.第三代抗体是什么？利用基因工程技术制备的基因工程抗体。
17.现代生物技术的标志是什么？DNA重组技术。
18.获得目的基因最常用的方法是什么？化学合成法、PCR法（最常用）、基因文库法、cDNA文库法。
大肠杆菌的特点与前景研究
大肠杆菌的特点与前景研究摘要：肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。
直到20世纪中叶，才认识到一些特血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物。
大肠杆菌属于细菌。
关键词：大肠杆菌病原性应用前景大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。
是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。
大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。
在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。
大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。
大肠杆菌O157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。
日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。
在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。
大肠杆菌O 157：H7引起肠出血性腹泻，约2%～7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。
致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。
大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周身鞭毛，能运动，无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
正常栖居条件下不致病。
但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。
在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。
在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。
基因工程问答题
探针（probe）：核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
16.Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。
被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。
17.Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上或尼龙膜，然后用探针杂交。
被检对象为RNA,探针为DNA 或RNA。
18. Western杂交: Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方20.基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。
21. cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建cDNA 文库。
36. 末端转移酶: 一种从小牛胸腺组织中分离得到的酶 可使dnTp添加剂加到DNA分子的3’—oH末端上 不要求模板 但需Co2+的存在基因克隆载体 通过不同途径能将外源DNA片段载入受体细胞 并在其中得以维持的DNA分子称为基因克隆载体或DNA克隆载体2.限制性核酸内切酶的活性受那些因素的影响？ 1样品的纯度 2 DNA样品的甲基化程度 5 酶的纯度 3 缓冲液性质 6 DNA分子的构型 4酶切反应的温度与时间 7 限制性核酸内切酶的星号活性说明使用切口位移法进行说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤: 原理：在Mg2+存在时，用低浓度的DNA酶I（DNaseI）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，这时DNA聚合酶I的5′→3′外切酶活性盒聚合酶活性可以同时发生。
外切酶活性可以从断裂处的5′端除去一个核苷酸，而聚合酶则将一个单核苷酸添加到断裂处的3′端。
由于大肠杆菌DNA聚合酶I不能使断裂处的5′－P和3′—OH形成磷酸二酯键二连接，所以，随着反应的进行，即5′端核苷酸不断去除，而3′端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动，这种现象就成为切口平移。
基因工程3大肠杆菌表达系统
至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保 守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降 低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法， 从而提高克隆的外源基因的表达效率。 例如: 在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基 发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基 因的表达。
5、容易进行代谢调控；
6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类：
1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、
链霉菌等；
2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物
细胞等。
一、真核基因的大肠杆菌表达体系
目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系 统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆 虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大 肠杆菌表达系统具有明显的优越性。
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外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
• • • • • 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
转录水平
翻译水平
（1）启动子
要使克隆的外源基因高水平表达的最佳 启动子，必须具备以下几个条件： 1）必须是一个强启动子。 2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达 水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为 重要的条件。 3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的 方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理 （如热）和化学（如IPTG）诱导 。
（5）翻译终止密码
对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条 件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆 菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码 子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率
提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率摘要：对于基因工程，无论是在原核生物中，还是在真核生物中，外源基因的表达效率一直是人们关注的问题。
这篇综述简要的从启动子、质粒、mRNA转录本、密码子的偏好性、宿主选择、培养条件方面论述如何提高真核基因在大肠杆菌中的表达效率。
关键词：真核基因大肠杆菌表达效率前言：基因工程越来越被广泛应用，人们可以利用基因工程获得高产,稳产和具有优良品质的农作物,培育出各种具有抗逆性的作物新品种。
利用基因技术还可以高效率的生产各种高质量，低成本的药品，如：胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。
通常要把目的基因导入大肠杆菌进行表达，因为大肠杆菌表达系统相对于其它，比如酵母细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统有一定的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机制有深刻的了解；拥有各类适用的寄主菌株和不同的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌中有效、高水平的表达；大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。
但也有缺点，比如说真核基因的转录信号同原核不同，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子，外源基因可能含有大肠杆菌终止子序列，表达产物音折叠错误或缺少翻译后修饰而没有生物活性，本身含有内毒素或毒性蛋白等。
所以真核基因在大肠杆菌中表达可能会遇到如下问题：●缺乏拼接机制：由于原核基因无内含子，目的基因表达后的mRNA内含子无法去除；●缺乏翻译、加工：不能对蛋白质进行糖基化、磷酸化等；●容易降解：细菌对外源蛋白有排斥作用。
正文：一、目标蛋白在大肠杆菌中表达首先要构建表达载体，表达载体包括以下几个部分：★复制起始位点★选择标记基因★启动子★核糖体结合位点★多克隆位点★转录终止序列用图表示即为：二、影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有：●启动子●质粒●mRNA转录本●密码子的偏好性●宿主选择●培养条件（一）启动子在基因的表达调控中，转录的起始是个关键某个基因是否能正常的表达常常决定于特定启动子的起始过程，启动子是DNA分子与RNA聚合酶相结合的部位，是转录的基本信号。
分子生物学答案
分子生物学答案分子生物学答案一、名词1、鸟枪法（Shotgun method）：使用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆的方法。
使用限制性内切酶将带有目的基因的DNA链切成若干小段，再使用DNA连接酶将其整合到载体的基因中，并使其表达。
2、色氨酸操纵子（tryptophane operon）：负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。
3、酶切图谱（Macrorestriction Map）：描述限制性内切酶的酶切点的位置和距离信息的图谱。
4、原位杂交（in situ hybridization）：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
5、结构域（domain）：是构成蛋白质三级结构的基本单元，是指生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域，是蛋白质生理功能的结构基础，这种相对独立的区域性结构就称为结构域。
6、DNA杂交（Southern blotting）：又称为Southern杂交，即用放射性标记的探针与靶DNA进行杂交的技术。
7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和称为基因组文库（短答案：是指采用基因组克隆的方法，克隆的一套基因组DNA片段。
）8、粘性末端（cos site-carring plasmid）：当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸，叫做粘性末端。
9、一致序列（又称保守序列：conserved sequence）：遗传物质里的片段极少发生突变而且在不同生物中广泛存在。
基因工程简答题
1.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因并提出解决的方案? （6分）答：(1)导致星号活性因素：a较高的甘油浓度b酶与底物DNA比例过高（不同酶情况不同，通常为＞100v/micHo.g）c 低盐浓度（<25mM）d 高PH值（>PH8.0）e 存在有机溶剂（如DMSO .乙醇（9）.乙烯乙二醇.二甲基乙酰胺.二甲基甲酰胺.sulphalane(12)等）f用其他二价离子代替Mg2+(Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+等)（2）抑制星号活性的方法：a尽量用较少酶进行完全消化反应，这样可避免过度消化及过度的甘油浓度. B尽量避免有机溶剂（如制备DNA时二乙醇）污染c 将离子浓度提高到100—150mM（若酶活性不受离子浓度影响）d将反应缓冲液PH值降到7.0 e 二价离子用Mg2+3、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（10分）答：a.目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有。
E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达.4蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?答：蓝白斑筛选法出现假阳性的原因：β-半乳糖苷酶的N末端是非必须的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或α肽的互补性。
如果插入的外源DNA引起α肽的可读框的改变或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就形成白色噬菌斑。
如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止子的话，仍会形成蓝白菌落。
这种插入物的长度可达几百个碱基对（1）蓝白斑筛选法原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因区外又另外引入了一段含有多种单一限制性酶切位点的dna序列，这些位点上如果没有克隆外源性dna片段，在质粒导入Lac的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物X—gal和诱导剂IPTG后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源基因，则使LacZ’基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。
基因工程试题(8)
1、下列有关基因的叙述，错误的是【 A 】A 蛋白质是基因表达的唯一产物B 基因是 DNA 链上具有编码功能的片段C 基因也可以是 RNAD 基因突变不一定导致其表达产物改变结构2、基因工程的单元操作顺序是【 B 】A 增，转，检，切，接B 切，接，转，增，检C 接，转，增，检，切D 切，接，增，转，检3、生物工程的上游技术是【 A 】A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及酶工程D 基因工程及细胞工程4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是【 C 】A 终止子与终止密码子B 基因表达与基因转译C DNA 退火与 DNA 复性D 重组子与转化子5、根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成【 B 】A 2 大类B 3 大类C 4 大类D 5 大类6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【 D 】A 2' -OH 和 5' – PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' – PD 5' -OH 和 3' -P7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【 A 】A 连接反应的最佳温度为37 ℃B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD 连接酶通常应过量 2-5 倍8、原生质体转化方法不大适用于【 A 】A 大肠杆菌B 枯草杆菌C 酵母菌D 链霉菌9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【 A 】A Cosmid >λ-DNA > PlasmidB λ -DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >λ -DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid > λ-DNA10、若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【 D 】A 半乳糖B 异丙基巯基 - β - 半乳糖苷( IPTG )C 蔗糖D 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - β -D- 半乳糖苷( X-gal )11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是【 C 】A 大肠杆菌－繁殖迅速B 枯草杆菌－分泌机制健全C 链霉菌－遗传稳定D 酵母菌－表达产物具有真核性12、分子杂交的化学原理是形成【 D 】A 共价键B 离子键C 疏水键D 氢键13、某一重组 DNA ( 6.2 kb ) 的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。
基因工程综合练习题
一、单项选择题1. 生物工程的上游技术是( )A. 基因工程及分离工程B. 基因工程及发酵工程C. 基因工程及酶工程D. 基因工程及细胞工程2. 基因工程的单元操作顺序是( )A. 增，转，检，切，接B. 切，接，转，增，检C. 接，转，增，检，切D. 切，接，增，转，检3. 下列哪种克隆载体对外源DNA 的容载量最大?( )A. 质粒B. 黏粒C. 酵母人工染色体(YAC)D. λ噬菌体E. cDNA 表达载体4. 同一种质粒DNA以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是()A. OC DNA>SC DNA>L DNAB. SC DNA>L DNA>OC DNAC. L DNA>OC DNA>SC DNAD. SC DNA>OC DNA>L DNA5. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是( )A. 修复自身的遗传缺陷B. 促进自身的基因重组C. 强化自身的核酸代谢D. 提高自身的防御能力6. 基因工程的三大理论基石是（）A. 经典遗传学、细胞生物学、微生物学B. 分子遗传学、分子生物学、生化工程学C. 动物学、植物学、微生物学D. 生物化学、生化工程学、化学工程学E. 生理学、仿生学、免疫学7. 基因工程作为一种技术诞生于（）A. 上世纪 50 年代初B. 上世纪 60 年代初C. 上世纪 70 年代初D. 上世纪 80 年代初E. 上世纪 90 年代初8. 下述对DNA聚合酶的描述哪些是错误的（）。
A. 具有5’→3’外切酶活性B. 具有3’→5’外切酶活性C. 具有5’→3’聚合酶活性D. 具有3’→5’内切酶活性9. 下列关于酵母和哺乳动物的陈述错误的是（）A．大多数酵母基因没有内含子，而大多数哺乳动物基因有许多内含子B．酵母基因组的大部分基因比哺乳动物基因组的大部分基因小C．大多数酵母蛋白比哺乳动物相应的蛋白小D．尽管酵母基因比哺乳动物基因小，但大多数酵母蛋白与哺乳动物相应的蛋白大致相同10. 下列哪一种不是产生星号活性的主要原因？( )A. 甘油含量过高B. 反应体系中含有有机溶剂C. 含有非镁离子的二价阳离子D. 酶切反应时酶浓度过低11. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( )外都是正确的。
基因工程智慧树知到答案章节测试2023年山东师范大学
第一章测试1.基因是存在于DNA上的核苷酸序列，具有特定的结构、功能以及遗传特征。
（）A:对B:错答案:A2.1944年Avery首次证实了（）是遗传物质。
A:蛋白质B:糖类C:DNAD:脂类答案:C3.Hind Ⅲ是第一个分离到的限制性核酸内切酶。
（）A:错B:对答案:A4.基因组工程的主要优势是能修改一个特定区域的DNA,从而增加了校正或外源基因插入的精度，重现性好，将成为今后基因工程主要的发展方向。
（）A:对B:错答案:B5.基因工程具有（）特征。
A:可在不同物种之间转移基因B:载体起着重要作用C:中心法则是必需遵守的准则D:真核生物基因可在大肠杆菌中表达答案:ABCD第二章测试1.DNA链的Tm值主要取决于核酸分子的（）A:T－C含量B:A－T含量C:G－C含量D:A－G含量答案:C2.用CTAB方法提取植物基因组DNA 时，使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)与多酚结合形成复合物，从而可有效防止DNA降解。
（）A:对B:错答案:B3.在Southern印迹中常用的核酸变性剂是( )A:氢氧化钠B:盐酸C:乙醛D:甲醛答案:A4.具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称（）A:复杂性B:复性C:变性D:杂交答案:B5.用碱法分离质粒 DNA时，染色体 DNA之所以可以被除去，是因为：( )A:染色体变性后来不及复性B:染色体未同蛋白质分开而沉淀C:染色体 DNA分子量大，而不能释放D:染色体 DNA断成了碎片答案:A第三章测试1.下列( )酶作用时需要引物?A:末端转移酶B:限制酶C:反转录酶D:DNA连接酶答案:C2.Ⅱ型限制性内切核酸酶具有（）特征。
A:有核酸内切酶和甲基化酶活性,且经常识别回文序列B:有外切核酸酶和甲基化酶活性C:仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供D:仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供答案:D3.末端脱氧核苷酸转移酶是合成酶类，( )。
吉大20年4月课程考试《生物制药学》离线作业考核试题
吉林大学网络教育学院2019-2020学年第一学期期末考试《生物制药学》大作业学生姓名专业层次年级学号学习中心成绩年月日作业完成要求：大作业要求学生手写，提供手写文档的清晰扫描图片，并将图片添加到word 文档内，最终wod文档上传平台，不允许学生提交其他格式文件（如JPG，RAR等非word 文档格式），如有雷同、抄袭成绩按不及格处理。
一、名词解释（每小题2分，共20分）1、生物技术药物又称基因工程药物。
以DNA重组技术和蛋白质工程技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞因子类药物及上述产品的修饰物，以及应用生物技术研究开发的反义药物及用于基因治疗的基因药物和核酶等.2、基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品3、高密度发酵又称高密度培养。
一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态的培养技术4、离子交换层析离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。
5、疏水层析疏水层析也称疏水作用下层析从分离纯化生命物质的机制来看，也属于吸附层析一类。
疏水层析和反相层析分离生命物质的依据是一致的，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。
6、生物反应器生物反应器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接种至液相或固相的反应系统7、接触抑制接触抑制是将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现8、原代培养原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养9、外植体植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段10、密度抑制密度抑制，细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
大肠杆菌在分子生物学与生物技术中的应用
大肠杆菌在分子生物学与生物技术中的应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于动物肠道中的杆菌。
由于其生长速度快、操作简便，以及其成熟的遗传学和基因工程技术，大肠杆菌成为了分子生物学和生物技术领域中的重要研究对象。
一、大肠杆菌在基因克隆中的应用大肠杆菌的遗传学研究始于20世纪40年代，随着现代分子生物学和基因工程技术的发展，大肠杆菌成为了最常用的基因克隆宿主。
大肠杆菌的基因组是一个圆形双链DNA分子，包含了约4,500个基因。
大肠杆菌的基因组大小适中，便于操作；并且绝大部分基因已经被注释，可以用于数据挖掘、基因分析和改造等应用。
在大肠杆菌中可以克隆各种带有启动子、编码区、反义密码子等功能区域的外来DNA分子，可以通过分子克隆技术的方法，将所需基因克隆到质粒或染色体上，进而实现目的基因的表达和功能研究。
二、大肠杆菌在表达蛋白的应用大肠杆菌是常用的表达蛋白宿主，可以通过在其基因组中插入外源基因，并将其发挥于目的蛋白的生产。
这是一种简单、高效的生产蛋白的方法。
大肠杆菌表达系统已成为工业化生产重要蛋白的主要方法之一。
目前，大肠杆菌表达体系主要分为原核和真核两类。
原核表达是指将外源基因插入质粒，导入大肠杆菌中进行表达。
真核表达是指将外源基因插入真核细胞质粒中，将其转化为蛋白，再将蛋白导入大肠杆菌中进行后续处理。
三、大肠杆菌在基因编辑和基因改造中的应用大肠杆菌作为常见的细胞工厂，在基因编辑和基因改造中发挥着重要的作用。
通过大肠杆菌的基因编辑，可以有效抑制或改变其特定的基因表达。
所谓基因编辑，是指通过介导靶向去除或替换基因片段，引发突变或修复突变，从而实现特定基因的功能破坏或修复。
使用大肠杆菌进行基因编辑的优点是：操作简单；高效性、不依赖于携带外界基因的载体；可靠性好、操作风险较低；适用于单个、多个或整个基因谱系的编辑。
四、大肠杆菌在制药领域中的应用大肠杆菌被广泛应用于生产制备各种生物制品，如抗生素、酶、质粒、疫苗、抗体和蛋白类产品等。
生物工程制药之基因工程制药7
基因工程制药
3.3.2.2、互补DNA第一链的合成
mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡 聚脱氧胸苷酸为引物，在反转录酶的催化下，开始互补 DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的 dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的 dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳 后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应 条件。
3、不致病、不产生内毒素；
4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。
基因工程制药
3.4.1 宿主细胞的选择 宿主可分为两大类： 原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。
基因工程制药
3.2基因工程药物生产的基本过程
•目的基因的克隆； •构建DNA重组体；
•将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；
•工程菌的发酵； •外源基因表达产物的分离纯化； •产品的检验等。
基因工程制药
3.2.1制备基因工程药物的一般程序：
获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌
培养工程菌
产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装
生物制药工艺（基因工程制药）
基因工程技术就是将重组对象的目的基因 插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成 工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的 基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
基因工程制药
3.1基因工程技术生产药物的优点：
1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床 使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生 化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
生物制药技术试卷
一、名词解释1.生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。
2.基因文库：将供体生物的DNA用限制酶切成许多片段，在连接酶的作用下分别与克隆载体进行体外重组，这种含有供体生物全部不同基因的重组克隆载体的总体称供体生物的基因文库。
3.同裂酶：识别不同的核苷酸序列，但切割后产生相同的粘性末端，这样一类限制酶称同切口限制酶或同裂酶。
4.限制酶星活性：在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。
在非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。
5.PCR技术：聚合酶链式反应技术，简称PCR技术，是一种用于在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。
应用该技术可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。
6.多克隆位点：（MCS）基因载体上由多种限制酶单一识别序列组成的序列，是插入外源目的基因DNA片段的位点。
7.McAb：采用B淋巴细胞杂交瘤技术，由纯一的单克隆细胞系产生的，针对一个抗原决定簇的，结构和特异性完全相同的高纯度抗体称单克隆抗体。
8.克隆化：单个细胞通过无性繁殖而获得的细胞集团的整个培养过程。
9.细胞分化：动物细胞不是靠一个细胞包办一切生理活动，各种细胞有明确的分工，相应有不同的形态。
这种随功能不同所产生的形态变化称分化。
10.外植体：植物组织培养中，进行离体无菌培养的材料，可以是器官或组织的切段、原生质体、细胞等。
11、转导：将重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞的过程。
12、感受态细胞：细胞最易接受外源DNA片断，并能实现转化的一种生理状态。
13、回文结构：限制性酶的识别序列，如果都从5，末端向3，末端读其碱基序列，则在识别序列的两条核苷酸链中的碱基排列次序完全相同，这种结构称回文结构。
14、接触抑制：当细胞贴附在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞相互接触时，细胞就停止增殖。
生物制药 习题答案
第一章绪论一、生物技术药物分为哪些类型？1.应用重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类2.基因药物3.来自动物、植物和微生物的天然生物药物4.合成与部分合成的生物药物二、生物技术药物的特性1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性7.体内的半衰期短8.受体效应9.多效应和网络性效应10.检验的特殊性三、生物技术制药的特征是什么？1.高技术2.高投入3.长周期4.高风险5.高收益第二章基因工程制药一、基因工程技术生产药品的优点有哪些？1.利用基因工程技术可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障。
2.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。
3.利用基因工程技术可以发现和挖掘更多的内源性生理活性物质。
4.利用基因工程和蛋白质工程对生理活性物质进行修饰和改造，提高药效价值。
5.利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
二、基因工程药物制造的主要程序有哪些？分离目的基因，目的基因与载体连接构建DNA重组体，将DNA 重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌发酵，目的基因表达产物的分离纯化，产品的检验三、利用基因工程生产蛋白质或多肽首先需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？目的基因来源于原核细胞，可选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。
目的基因来源于真核细胞，常用的方法有：1.反转录法：为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可以从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA, 以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录生成该蛋白质mRNA互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶Ⅰ作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。
2.反转录PCR：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链（不需要合成cDNA第二链），再以cDNA第一链为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
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增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 真核基因在大肠杆菌中的表达 影响真核基因表达效率的因素
真核基因在大肠杆菌中表达
第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系
真核基因在大肠杆菌中表达
1. 大肠杆菌表达体系
基因工程的重要目标
制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的 表达系统
蛋白酶的降解：表达的真核蛋白质被细菌的蛋 白酶识别并降解。
真核基因在大肠杆菌中表达
解Hale Waihona Puke 方案✓ 从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转录 合成cDNA，并连接到载体上，以克服内含子问题。
✓ 如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大， 可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸 片断。
✓ 将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。 ✓ 对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突
真核基因在大肠杆菌中表达
启动子
核糖体结合位点
转录终止子
复制 起点
大肠杆菌表达载体的基本结构特征 真核基因在大肠杆菌中表达
1. 表达载体的基本成分
启动子（P）：影响外源基因的表达水平
使外源基因高水平表达必须具备的条件： ✓ 强启动子 ✓ 启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源
蛋白可能对寄主细胞不利。 ✓ 诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导
真核生物启动子的结构
-25 区
转录起始位点
5' NNNNNNNNNNNNNNNNNTATAAANNNNNNNNNNNNNNNNANNNN 3'
TA真T核AT基A因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达真核基因的劣势
蛋白质产物的后修饰：许多真核基因的蛋白质 产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基 化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋 白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是 不可溶的，常形成包涵体，无活性。
真核基因在大肠杆菌中表达
另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能 维持正常的稳定性
✓ 表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。 ✓ 蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。 ✓ 蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。 ✓ 大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分
子伴侣。
真核基因在大肠杆菌中表达
第二节 大肠杆菌的表达载体
行批量生产。
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达真核基因的劣势
真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续 性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对preRNA进行加工剪接的能力。
mRNA分子结构的差异：真核基因mRNA 5’-端有 帽子结构，3’-端有poly(A)尾巴，影响其稳定性及 与细菌核糖体结合的能力。
2. 常用的大肠杆菌表达载体
➢ Lac启动子的表达载体 ➢ T7启动子的表达载体
真核基因在大肠杆菌中表达
➢ Lac启动子的表达载体
乳糖操纵子结构模型 真核基因在大肠杆菌中表达
lac操纵子受lac阻遏物的负调节。 培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时， lac阻遏物同
操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。 培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻
将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达 载体。
真核基因在大肠杆菌中表达
这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所 有的Lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的β-半乳 糖苷酶基因解抑制。
变的方法消除。
真核基因在大肠杆菌中表达
2. 克隆基因正确表达的基本条件
最基本条件：能够进行正常的转录和翻译
转录：真核基因置于原核启动子的下游 3’-末端具有转录终止子
翻译： mRNA分子具有RBS（ribosome binding site）
包括AUG或GUG和与16S rRNA 3’-末端 互补的SD（Shine-Dalgarno）序列。
遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。 因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基 因的表达。
真核基因在大肠杆菌中表达
Lac操纵子的控制区，包括核糖体结合区、RNA聚合酶 结合区及阻遏物结合区都位于长203 bp的HaeIII片断上。
203 bp的HaeIII片断含有Lac启动子、操纵单元及β-半乳 糖苷酶的前8个密码子。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达真核基因的劣势
转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具
备结合细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的
RNA聚合酶不能识别真核启动子。
原核生物启动子的结构
-35 区
-10 区
转录起始位点
5' NNNNNTTGACANNNNNNNNNNNNNNNNNTATATTNNNNNNANNNN 3'