免疫检测新技术

一、生物素与亲和素的特性
2、亲和素 (avidin)：是一种存在于鸡蛋清中的碱性糖 蛋白，结晶呈白色粉末状，易溶于水。在pH 2～13 缓冲液中性质稳定，消化道多种蛋白水解酶不能使其 失活。它对热的耐受性较强，经80℃温度作用2min 仍保持活性。亲和素是由4个相同的亚单位组成的四 聚体，富含色氨酸，通过色氨酸与生物素的咪唑环呈 十分牢固的结合。亲和素的每个亚单位可结合1个分 子生物素，因此1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
3、标记生物素-亲和素技术(LAB)
LAB法是以生物素标记抗体作第1抗体，酶标记亲
和素作为第2抗体。
BRAB法和LAB法都需以生物素标记第1抗体，应
ห้องสมุดไป่ตู้
用不如ABC法普遍。但是，用于免疫细胞中免疫球
蛋白的显示具有特异性。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
4、生物素-亲和素或链霉亲和素ELISA检测技术
二、原理
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小 的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态， 形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定 的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负 电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合， 由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物 特性。
二、原理
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它 生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体 金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状 及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而 使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细 胞生物学等领域。
二、原理
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶 体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗 粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而 形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各 种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球 形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球 菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、 激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而 在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
目前最灵敏的免疫组化二抗检测系统 由于亲和素和生物素有极强的亲和力（其亲和力
比抗体和大多数抗原的亲和力高100万倍），因而亲
和素和生物之间的结合是不可逆的。此外，亲和素
具有4个生物素结合位点，大多数蛋白质包括酶可以
和多个生物素分子结合。利用这些特征，可以把亲
和素和生物素化的酶结合为大分子复合物（ABC’s）。
使用步骤：1．加入一抗，与切片孵育。如加入兔抗 肿瘤相关抗原的抗体。2．加入生物素化二抗，如生物 素化抗-兔IgG。3．加入亲和素-生物素化酶复合物 （ABC）。4．加入酶作用底物，定位抗原。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
2、桥亲和素-生物素技术(BRAB)
原理及应用：方法是用生物素分别标记抗体和酶， 然后以亲和素为桥，把两者连接起来。检查抗原时， 先用生物素标记的抗体与细胞(或组织内)的抗原反应， 洗去未结合的抗体，加人亲和素孵育后，洗去未结合 的亲和素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以 细胞化学方法呈色反应。
1、生物素 生物素(biotin)是一种广泛分布于动、植物 组织的生长因子，亦称辅酶R或维生素H，尤以蛋黄、 肝、肾组织中含量较高。结构式中的咪唑酮环是与亲 和素结合的主要部位。利用生物素的羧基加以化学修 饰后，可以制成各种活性基团的衍生物，称为活化生 物素。针对不同的被标记物可以应用不同类型的活化 生物素。
包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技 术。
第2节 免疫胶体金检测技术
一、概
述
免疫胶体金标记技术是以胶体金颗粒为示踪标记物 或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记 技术。已广泛应用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫 转印、体外诊断试剂的制造等领域。 胶体金即水溶胶，是一种带负电荷的疏水胶体溶液， 具有一般溶胶的特性，主要通过还原剂将氯化金分子 聚合成特定大小金颗粒的方法而产生。可通过采用柠 檬酸、抗坏血酸钠和白磷等还原氯金酸或四氯化金而 制备胶体金。胶体金颗粒可通过静电吸引及其表面的 物理特性与多种生物分子(如抗体、SPA)相结合，形 成蛋白质-金颗粒复合物，即胶体金标记物(胶体金探 针) 。
二、原理
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主 要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白 结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物 在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色 斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中， 这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免 疫金银染色。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
1、亲和素-生物素—过氧化物酶技术(ABC法) （2）应用： ①组织切片和细胞悬液中抗原的检测 ②在免疫电镜中的应用 标记抗体渗透性是免疫 电镜技术的关键，小分子的生物素就可得到更高的 渗透力，且生物素化抗体可在组织包埋前或包埋后 加入，因此ABC法进行抗原的亚细胞水平定位分析 得到较好的应用。
第2节影响
章节安排
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
的因素 第二节 免疫胶体金检测新技术
第三节 免疫电镜技术 第四节 免疫转印技术
[目的与要求]
1、了解标生物素-亲和素免疫检测技术的原理及 种类。 2、理解免疫胶体金检测技术的原理及常用的检 测方法。
3、了解免疫电镜技术的应用。
4、了解免疫转印技术的原理及应用。
[难点与重点]
重点：免疫胶体金检测技术的原理。 难点：免疫胶体金检测技术的原理。
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
利用生物素与亲和素专一性结合以及生物素、
亲和素既可标记抗原或抗体，又可被标记物所
标记的特性，可建立生物素-亲和素系统来显示
抗原抗体特异性反应的各种免疫检测技术。
一、生物素与亲和素的特性
链霉亲和素
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
1、亲和素-生物素-过氧化物酶技术(ABC法)
（1）原理：ABC法是利用亲和素分别连接生物素 标记的第2抗体和生物素标记的酶。生物素标记的第 2抗体与ABC复合物相连接，最后加底物进行显色反 应。其中，ABC复合物是将过氧化酶结合在生物素 上，再将生物素-过氧化酶连接物与过量的亲和素蛋 白反应而制备的。