哺乳动物细胞表达ppt课件
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哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因
重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动
子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数
应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细
胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸
腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细 胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同， 需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
1 表达载体
1．1 表达栽体的类型
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转
染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转
染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系
统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到
病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出
目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为
1．2 表达载体的结构元件
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个 高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的 mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复 制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子 ／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对 它做简要介绍。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子
病毒载体与质粒载体。
Leabharlann Baidu
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白
与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病
毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状
病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受
重视。
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能
(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉
瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的
pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三
种启动子驱动目的基因的表达。
常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列
和人巨细胞病毒增强子。
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
2 宿主细胞
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
哺乳动物细胞表 达
研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研 究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞 系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激 活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生 成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。 有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表 达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处 在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/ l08细胞 /24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细 胞中重组蛋白的分泌效率较低。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培
养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达
持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，
稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱
导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重
金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自
我复制的附加体形式存在。
整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达
受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元
3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分
为瞬时、稳定和诱导表达系统。
瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选
择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白
的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周
期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热
点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白， 产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技 术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。
件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体
必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。 ②启动子和增强子；
③剪接信号；
④终止信号和polyA加尾信号。
为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须 加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、 氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等. dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据 文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能 扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
4 表达系统的选择
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许
多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过
程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、
重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性
等。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细
胞的合理搭配问题。因此如果需获得一个基因的高表 达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。
重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动
子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数
应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细
胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸
腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细 胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同， 需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
1 表达载体
1．1 表达栽体的类型
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转
染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转
染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系
统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到
病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出
目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为
1．2 表达载体的结构元件
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个 高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的 mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复 制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子 ／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对 它做简要介绍。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子
病毒载体与质粒载体。
Leabharlann Baidu
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白
与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病
毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状
病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受
重视。
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能
(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉
瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的
pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三
种启动子驱动目的基因的表达。
常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列
和人巨细胞病毒增强子。
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
2 宿主细胞
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
哺乳动物细胞表 达
研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研 究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞 系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激 活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生 成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。 有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表 达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处 在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/ l08细胞 /24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细 胞中重组蛋白的分泌效率较低。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培
养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达
持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，
稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱
导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重
金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自
我复制的附加体形式存在。
整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达
受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元
3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分
为瞬时、稳定和诱导表达系统。
瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选
择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白
的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周
期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热
点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白， 产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技 术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。
件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体
必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。 ②启动子和增强子；
③剪接信号；
④终止信号和polyA加尾信号。
为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须 加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、 氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等. dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据 文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能 扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
4 表达系统的选择
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许
多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过
程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、
重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性
等。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细
胞的合理搭配问题。因此如果需获得一个基因的高表 达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。