哺乳动物细胞表达ppt课件
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哺乳动物PPT课件7 人教版
动，行动会变成习惯，习惯会变成性格。性格会影响人生！
习惯不加以抑制，会变成生活的必需品，不良的习惯随时改变人生走向。人往往难以改变习惯，因为造习惯的就是自己，结果人又成为习惯的奴隶！人生重要的不是你从哪里来， 而是你到哪里去。当你在埋头工作的时侯，一定要抬头看看你去的方向。方向不对，努力白费！你来自何处并不重要，重要的是你要去往何方，人生最重要的不是所站的位置，而 是所去的方向。人只要不失去方向，就永远不会失去自己！这个世界唯一不变的真理就是变化，任何优势都是暂时的。当你在占有这个优势时，必须争取主动，再占据下一个优势， 这需要前瞻的决断力，需要的是智慧！惟一能移山的方法就是：山不过来，我就过去。人生最聪明的态度就是：改变可以改变的一切，适应不能改变的一切！是产生在人的思想里。 你没找到路，不等于没有路，你想知道将来要得到什么，你必须知道现在应该先放弃什么！把人抛入最低谷时，往往是人生转折的最佳期。谁能积累能量，谁就能获得回报；谁若 自怨自艾，必会坐失良机！人人都有两个门：一个是家门，成长的地方；一个是心门，成功的地方。能赶走门中的小人，就会唤醒心中的巨人！要想事情改变，首先自己改变，只
第七节 哺乳动物
小刚家的母狗下了一窝小狗 崽，一个个毛茸茸的非常可爱。 看，它们正挤在妈妈的身旁抢 奶吃呢。你还知道哪些动物是 靠哺乳抚育下一代的？这种抚 育后代的方式有哪些优越性呢？
1.说出哺乳动物的多样性。 2.描述哺乳动物的生殖发育特点。 3.识记哺乳动物的主要特征。 4.举例说出哺乳动物与人类生活的关系。
3. 下列叙述中，不能说明哺乳动物在人们 生活中的应用的是（A ） A.利用青蛙来防治稻田害虫 B.盲人利用导盲犬引导行走 C.猎人利用猎狗捕捉野兔 D.养殖貂、貉等以获得毛皮
哺乳和胎生是哺乳动物最显 著的特征。
习惯不加以抑制，会变成生活的必需品，不良的习惯随时改变人生走向。人往往难以改变习惯，因为造习惯的就是自己，结果人又成为习惯的奴隶！人生重要的不是你从哪里来， 而是你到哪里去。当你在埋头工作的时侯，一定要抬头看看你去的方向。方向不对，努力白费！你来自何处并不重要，重要的是你要去往何方，人生最重要的不是所站的位置，而 是所去的方向。人只要不失去方向，就永远不会失去自己！这个世界唯一不变的真理就是变化，任何优势都是暂时的。当你在占有这个优势时，必须争取主动，再占据下一个优势， 这需要前瞻的决断力，需要的是智慧！惟一能移山的方法就是：山不过来，我就过去。人生最聪明的态度就是：改变可以改变的一切，适应不能改变的一切！是产生在人的思想里。 你没找到路，不等于没有路，你想知道将来要得到什么，你必须知道现在应该先放弃什么！把人抛入最低谷时，往往是人生转折的最佳期。谁能积累能量，谁就能获得回报；谁若 自怨自艾，必会坐失良机！人人都有两个门：一个是家门，成长的地方；一个是心门，成功的地方。能赶走门中的小人，就会唤醒心中的巨人！要想事情改变，首先自己改变，只
第七节 哺乳动物
小刚家的母狗下了一窝小狗 崽，一个个毛茸茸的非常可爱。 看，它们正挤在妈妈的身旁抢 奶吃呢。你还知道哪些动物是 靠哺乳抚育下一代的？这种抚 育后代的方式有哪些优越性呢？
1.说出哺乳动物的多样性。 2.描述哺乳动物的生殖发育特点。 3.识记哺乳动物的主要特征。 4.举例说出哺乳动物与人类生活的关系。
3. 下列叙述中，不能说明哺乳动物在人们 生活中的应用的是（A ） A.利用青蛙来防治稻田害虫 B.盲人利用导盲犬引导行走 C.猎人利用猎狗捕捉野兔 D.养殖貂、貉等以获得毛皮
哺乳和胎生是哺乳动物最显 著的特征。
哺乳动物细胞表达ppt课件
11
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表 达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
12
3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在 于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖 基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能， 因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开 始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年 间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工 程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结 构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
件如何优化、整合的染色体位点多么ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ适，其外源 基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因 拷贝数来获得高表达重组药物的CHO细胞工程株是 基因工程药物研究中不可或缺的一步。
19
5 宿主细胞的改造 随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周
期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过 载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、 扩展因子、抗凋亡因子、转录翻译的反式作用因子以及 其他细胞生长存活所必需的成分的基因和顺式表达调控 元件敲人宿主细胞，以提高其表达；
5
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制 的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表 达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
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3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在 于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖 基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能， 因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开 始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年 间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工 程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结 构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
件如何优化、整合的染色体位点多么ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ适，其外源 基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因 拷贝数来获得高表达重组药物的CHO细胞工程株是 基因工程药物研究中不可或缺的一步。
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5 宿主细胞的改造 随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周
期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过 载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、 扩展因子、抗凋亡因子、转录翻译的反式作用因子以及 其他细胞生长存活所必需的成分的基因和顺式表达调控 元件敲人宿主细胞，以提高其表达；
5
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制 的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
哺乳动物细胞表达 PPT课件
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
②启动子和增强子； ③剪接信号； ④终止信号和polyA加尾信号。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培 养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达 持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤， 稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱 导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重 金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能 稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自 我复制的附加体形式存在。 整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达 受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突胞表达载体的必要元件包括：一个
初中生物《哺乳动物》课件(共32张PPT)
2.（略）
体表 被毛，体毛光滑柔软保温
兔的运动方式？与前后肢有关吗？
跳跃；前肢短，后肢长，且肌肉发达，适于 跳跃
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、哺乳动 物的主要特征
⑴ 观 看视频 ：
观 察兔的牙齿 等特征
想一想：兔和狼牙齿的不同说明了什么？
牙齿 的作用: 门齿 —形状似凿 ,适于切断植物纤维 ;
臼齿 —咀嚼面宽阔 ,适于磨碎食物; 犬齿 —尖锐锋 利,可用于攻击 、捕食、撕 裂食物. 牙齿 的不同，表明动 物的食性不同，兔 没有犬齿 属于草食性.狼属于肉性食.
现在饲养的各种家畜，都是由它们的野生祖先经过长期 的人工驯化而成的。人类最早饲养的动物是狗，以后又 增加了牛、羊、猪等。近年来，为了满足生产、生活及 科学研究的需要，不少野生哺乳动物不断被人类驯化。 比如，紫貂、北极狐、海狸鼠等的驯化饲养，为我国毛 皮生产开拓了广阔的前景。梅花鹿、麝鼠的驯化饲养， 为我们提供了大量的鹿茸、鹿胎、鹿尾、麝香等药材、 香料或滋补品。因此，对于经济价值较高、有饲养前途 的野生动物进行驯化和饲养，是开发和利用野生动物资 源的重要途径。
⑵ 看书 理解： ● 哺乳动 物成活率高的原因:胎生、哺乳；
高度发 达的神经 系统 和感觉 器官
归纳 哺乳动 物的特征 ：
体表被毛；
胎生，哺乳； 牙齿 有门齿 、犬齿 和臼齿 的分化。
三、技能训练
动 物都是由细 胞构成的； 动 物都能生长 和繁殖……
测量家兔的体温，既可以测量它的肛温，也可以测量它的腋下温 度。测量肛温时，先将体温计放入75％的酒精中消毒，然后将体 温计的水银柱甩到30℃以下，轻轻插入家兔的肛门中，过2～3分 钟后取出，用酒精消毒后再查看并记录体温度数。测量腋下温度 时，可将体温计放入家兔的前肢腋下，5～8分钟后查看并记录。
体表 被毛，体毛光滑柔软保温
兔的运动方式？与前后肢有关吗？
跳跃；前肢短，后肢长，且肌肉发达，适于 跳跃
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、哺乳动 物的主要特征
⑴ 观 看视频 ：
观 察兔的牙齿 等特征
想一想：兔和狼牙齿的不同说明了什么？
牙齿 的作用: 门齿 —形状似凿 ,适于切断植物纤维 ;
臼齿 —咀嚼面宽阔 ,适于磨碎食物; 犬齿 —尖锐锋 利,可用于攻击 、捕食、撕 裂食物. 牙齿 的不同，表明动 物的食性不同，兔 没有犬齿 属于草食性.狼属于肉性食.
现在饲养的各种家畜，都是由它们的野生祖先经过长期 的人工驯化而成的。人类最早饲养的动物是狗，以后又 增加了牛、羊、猪等。近年来，为了满足生产、生活及 科学研究的需要，不少野生哺乳动物不断被人类驯化。 比如，紫貂、北极狐、海狸鼠等的驯化饲养，为我国毛 皮生产开拓了广阔的前景。梅花鹿、麝鼠的驯化饲养， 为我们提供了大量的鹿茸、鹿胎、鹿尾、麝香等药材、 香料或滋补品。因此，对于经济价值较高、有饲养前途 的野生动物进行驯化和饲养，是开发和利用野生动物资 源的重要途径。
⑵ 看书 理解： ● 哺乳动 物成活率高的原因:胎生、哺乳；
高度发 达的神经 系统 和感觉 器官
归纳 哺乳动 物的特征 ：
体表被毛；
胎生，哺乳； 牙齿 有门齿 、犬齿 和臼齿 的分化。
三、技能训练
动 物都是由细 胞构成的； 动 物都能生长 和繁殖……
测量家兔的体温，既可以测量它的肛温，也可以测量它的腋下温 度。测量肛温时，先将体温计放入75％的酒精中消毒，然后将体 温计的水银柱甩到30℃以下，轻轻插入家兔的肛门中，过2～3分 钟后取出，用酒精消毒后再查看并记录体温度数。测量腋下温度 时，可将体温计放入家兔的前肢腋下，5～8分钟后查看并记录。
哺乳动物细胞表达系统
HEK293（人胚肾细胞）
30年前由HEK细胞系转化腺病毒5的裸露DNA
表达腺病毒13 S Ela 蛋白显著增强CMV启动子的转录
HEK293T
293细胞同时转化了SV40 TAg（大T抗原）
SV40 ori (293T)
和293细胞相比，没有显著增强表达
HEK293E
293细胞同时转化了Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen-1 (EBNA1)
EBV oriP(293E)
和293细胞相比，显著增强表达
HKB11（人体细胞杂交细胞系）
HEK293细胞杂交淋巴瘤细胞而成。转化了EBNA1
EBV oriP/（HKB11）
用HIV-1 Tat/TAR反式作用因子载体。相比293能提高20倍
遗传标记
编码产物
筛选标记
作用机理
APH-
氨基糖苷转移酶
G418
APH灭火G418
DHFR
二氢叶酸还原酶
氨甲喋呤
DHFR变体抗氨甲喋呤
HPH-
潮霉素B磷酸转移酶
潮霉素B
HPH-灭活潮霉素
TK-
胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤
TK合成TMP
XGPRT-
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
霉酚酸
XGPRT-合成GMP
ADA-
腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷
ADA-灭活Xyl-A
载体标记
表达细胞
细胞
Hale Waihona Puke 起源特点应用Cos-1和COS-7（非洲绿猴肾细胞）
SV-1（非洲绿猴肾细胞）细胞系紫外照射和复制缺陷病毒SV40转化
表达SV40 TAg（大T抗原）允许具有SV40 ori 的载体大量复制
30年前由HEK细胞系转化腺病毒5的裸露DNA
表达腺病毒13 S Ela 蛋白显著增强CMV启动子的转录
HEK293T
293细胞同时转化了SV40 TAg（大T抗原）
SV40 ori (293T)
和293细胞相比，没有显著增强表达
HEK293E
293细胞同时转化了Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen-1 (EBNA1)
EBV oriP(293E)
和293细胞相比，显著增强表达
HKB11（人体细胞杂交细胞系）
HEK293细胞杂交淋巴瘤细胞而成。转化了EBNA1
EBV oriP/（HKB11）
用HIV-1 Tat/TAR反式作用因子载体。相比293能提高20倍
遗传标记
编码产物
筛选标记
作用机理
APH-
氨基糖苷转移酶
G418
APH灭火G418
DHFR
二氢叶酸还原酶
氨甲喋呤
DHFR变体抗氨甲喋呤
HPH-
潮霉素B磷酸转移酶
潮霉素B
HPH-灭活潮霉素
TK-
胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤
TK合成TMP
XGPRT-
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶
霉酚酸
XGPRT-合成GMP
ADA-
腺嘌呤核苷脱氨酶
腺嘌呤木酮糖苷
ADA-灭活Xyl-A
载体标记
表达细胞
细胞
Hale Waihona Puke 起源特点应用Cos-1和COS-7（非洲绿猴肾细胞）
SV-1（非洲绿猴肾细胞）细胞系紫外照射和复制缺陷病毒SV40转化
表达SV40 TAg（大T抗原）允许具有SV40 ori 的载体大量复制
哺乳动物细胞表达系统原理
哺乳动物细胞表达系统原理
哺乳动物细胞表达系统是一种用于生产重组蛋白和基因治疗的有效工具。
其原理主要基于哺乳动物细胞具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，使得表达的蛋白更接近天然状态。
哺乳动物细胞表达系统有两种主要方式：瞬时转染表达和稳定转染表达（稳定细胞系构建）。
瞬时转染表达是指在短时间内表达出一定量的蛋白。
外源基因不整合到宿主染色体上，随着细胞的生长不断丢失，表达小量蛋白的过程。
这种方法简捷，实验周期短。
稳定转染/稳定细胞株筛选则是指将构建好的质粒线性化，在导入到培养好
的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方法实现质粒与细胞的融合。
线性化的质粒进入到宿主细胞后，与细胞自身的基因组进行整合，同时随着细胞的生长繁殖而生长，过程中在经过一系列的筛选鉴定，排除未正确融合的重组子，或不能稳定表达下去的重组子，最终筛选出可以稳定表达的细胞株。
以上内容仅供参考，建议查阅哺乳动物细胞表达系统相关书籍获取更全面和准确的信息。
哺乳动物细胞表达系统
dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐渐增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗性的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
哺乳动物细胞表达系统
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因 3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA. 牛生长激素基因PolyA. 人工合成PolyA.
IRES
IRES(internal Ribosome entry site)内部核糖体切入 位点,可从一个mRNA翻译二个ORF。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
遗传标记 编码产物
筛选药物
作用机理
APH-
氨基糖苷磷酸转移酶 G418
APH灭活G418
DHFR HPHTK-
二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤 潮霉素B 氨甲喋呤
DHFR变体抗氨 甲碟呤
HPH灭活潮霉素 B
TK合成TMP
XGPRTADA-
黄嘌呤过控制 tet 的浓度来控制基因表达的水平。
▪ 应用于研究基因不同水平的表达对细胞,个体发育的影响
有何不同。
作用机制示意图
四环素调控表达系统构成元件
▪ 四环素阻遏子（Tet repressor protein,TetR） ▪ 四环素操纵子（Tet operator DNA Sequence, TetO） ▪ 单纯疱疹病毒Vp16转录活化区(Vp16 activation domain,AD) ▪ 四环素调控反式激活子（Tetracyeline-Controlled
transactivator .tTA）TetR与Vp16组成融合表达蛋白。
哺乳动物细胞表达系统
动物基因工程原理
特点与优势
哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白 质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型 糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分 子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白质分子。
八年级生物上册 5.1.7 哺乳动物课件 (新版)新人教版
ppt课件
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2.饲养的家兔听到饲养员的脚步声会主动上前索食，而遇到陌 生人走近则会被吓跑，这与它的什么结构有关？ 提示：这与它发达的大脑和遍布全身的神经有关，能对饲养员 的脚步声形成复杂反射。
ppt课件
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二、哺乳动物与人类生活的关系 1.有益： (1)作为食物：_动__物__蛋__白__的主要来源。 (2)在生态系统中的作用：维持生态系统的_稳__定__。 (3)经济价值：一些哺乳动物的_皮__毛__等，如貂皮、藏羚羊皮等。 (4)其他用途：导盲犬、_警__犬__、军马等。 2.有害： 如鼠类猖獗会对农、林、牧业造成危害，有时还会__传__播__疾__病_。
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(5)神经系统和感觉器官。 ①特点：有高度发达的_神__经__系__统__和_感__觉__器__官__。 ②意义：能够灵敏地感知_外__界__环__境__的__变__化__，对环境的复杂 多变及时_作__出__反__应__。 2.主要特征： (1)体表_被__毛__；(2)胎生，_哺__乳__；(3)牙齿有_门__齿__、__犬__齿__和__ _臼__齿__的分化。
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3.哺乳动物的体表特征： (1)易错点：体表被毛是哺乳动物在外形上与其他动物的区别 之一，但并不是所有的哺乳动物体表都被毛。 (2)举例：如鲸鱼、河马、海豹等生活在水中的哺乳动物体表 光滑，这是与其生活环境相适应的。
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【探究提升】 1.鲸生活在水中，看上去很像鱼，但它属于哺乳动物，这是为 什么呢？ 提示：鱼的特征是体表常有鳞片覆盖，用鳃呼吸，生殖方式为 卵生等。鲸鱼具有胎生哺乳、体腔内有膈、用肺呼吸、体温恒 定等特征，这些是哺乳动物的主要特征。
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(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉
瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的
pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三
种启动子驱动目的基因的表达。
常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列
和人巨细胞病毒增强子。
构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。
2 宿主细胞
4 表达系统的选择
哺乳动物细胞表达系统中，重组蛋白的表达水平与许
多因素相关，如转录和翻译调控元件、RNA剪接过
程、mRNA稳定性、基因在染色体上的整合位点、
重组蛋白对细胞的毒性作用以及宿主细胞的遗传特性
等。选定表达系统之后，还需考虑表达载体与宿主细
胞的合理搭配问题。因此如果需获得一个基因的高表 达。最好多试用几种不同的载体及宿主细胞。
哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因
重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动
子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数
应功能，但表达量很低。
常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细
胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸
腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细 胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同， 需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。
稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自
我复制的附加体形式存在。
整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达
受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元
病毒载体与质粒载体。
病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白
与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病
毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状
病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受
重视。
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能
3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分
为瞬时、稳定和诱导表达系统。
瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选
择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白
的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周
期短。大规模的瞬时表达技术是 近年来的一个研究热
点。已有报道能放大到100 L反应器中生产重组蛋白， 产量(分泌型蛋白)可达l~10 mg/L。不过该方法技 术条件要求高，如质粒的纯度、转染的效率等。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培
养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达
持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，
稳定表达相耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱
导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重
金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体
必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。 ②启动子和增强子；
③剪接信号；
④终止信号和polyA加尾信号。
为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须 加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、 二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、 氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等. dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当 培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对 MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据 文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能 扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
1．2 表达载体的结构元件
哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个 高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的 mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复 制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子 ／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对 它做简要介绍。
目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子
哺乳动物细胞表 达
研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研 究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞 系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激 活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生 成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。 有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表 达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处 在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/ l08细胞 /24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细 胞中重组蛋白的分泌效率较低。
1 表达载体
1．1 表达栽体的类型
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转
染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转
染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系
统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到
病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出
目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为