原位杂交操作流程
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
原位杂交
原位杂交实验能否成功的要点之一是待 能否在加入探针前得到有效保护。 测mRNA能否在加入探针前得到有效保护。 能否在加入探针前得到有效保护 原位杂交实验技术的杂交前多个处理环节 如组织取材、保存、切片等） （如组织取材、保存、切片等）存在污染 RNA酶的机会，易造成待测 酶的机会， 损失， 酶的机会 易造成待测mRNA损失，导 损失 致实验失败。 致实验失败。 此外， 此外，杂交后示踪系统与特异标记探针 的结合以及非特异反应的封闭等环节， 的结合以及非特异反应的封闭等环节，也容 易发生问题。 易发生问题。
9. 30%、60%、80%、95%、100%乙醇各 min 乙醇各2 、 、 、 、 乙醇各 10. 含探针杂交液 含探针杂交液10ul(2ng/ul),加盖片 37℃过夜 加盖片, 加盖片 ℃ 去盖片,50%甲酰胺 ×SSC 37℃ 15 min, 2×SSC 甲酰胺/2× 去盖片 甲酰胺 ℃ × 37℃ 15 min, ℃ 12. 1×SSC 室温 15 min × 13. 4×SSC 室温平衡 min, 吸去残余缓冲液 勿干涸 室温平衡5 吸去残余缓冲液(勿干涸 勿干涸) × 14. 封闭液 封闭液(200ul),加盖片 湿盒 37℃ 30 min 加盖片,湿盒 加盖片 湿盒, ℃ 15. Anti-DIG-Biotin 200ul,盖玻片 湿盒 ℃,30min 盖玻片,湿盒 盖玻片 湿盒37℃ 16. 17. 18. 19. 20. 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗 min×3 ℃ 摇洗5 × SABC-POD 200ul,盖玻片 湿盒 ℃,30min 盖玻片,湿盒 盖玻片 湿盒37℃ 42℃,0.1%Tween 20 /PBS 摇洗 min×3 摇洗5 ℃ × DAB 200ul,盖玻片 室温 暗处 盖玻片,室温 暗处,10-20min 盖玻片 室温,暗处 PBS 5min(终止反应 复染 终止反应),复染 甘油封片. 终止反应交实验方法: 简便的外周血白细胞原位杂交实验方法
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。
现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。
二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。
过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。
两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。
用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。
DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。
下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。
三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。
（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。
一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。
这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。
（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。
以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。
铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。
原位杂交操作流程3
原位杂交操作流程：步骤备注材料的固定和包埋1、固定：将花芽浸入20倍于材料的FAA固定液中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4 °C过夜（24h-72h），然后保存于70%乙醇中。
100mlFAA固定液包含：乙醇50 ml 冰醋酸 5 ml 37% 甲醛溶液10 ml DEPC-H2O 35 ml2、脱水：材料经70%，80%，90%，100%，100%，100%乙醇脱水，每步60分钟。
3、透明：依次经25%二甲苯-75%乙醇，50%二甲苯-50%乙醇，75%二甲苯-25%乙醇，100%二甲苯，100%二甲苯，100%二甲苯，每步45分钟。
4、浸蜡：50%石蜡-50%二甲苯，42°C处理24h，重复此操作一次，移入60°C温箱，换入纯石蜡，60°C保温四天，每天换两次纯石蜡60°C石蜡过滤，超过62°C可能会破坏石蜡结构5、包埋：包埋时注意除气泡石蜡包埋块4°C可以保存1年以上切片1、载玻片：使用进口的处理好的载玻片。
2、切片展片：42°C粘片四天。
探针标记1、转绿反应（10µl）：线性化模板200-300ng（2µl）5x Transcription Buffer 2µl5x Labeling Mix 2µlRNApolymerase 1µlDEPC-H2O 2.5µlRnase Inhibitor 1µl37 °C or 42°C反应2小时2、收集探针：1µl 10mg/ml tRNA2.5µl 4M Licl75µl 100%乙醇，-20°C放置2小时，4°C，1,2000，30分钟70%乙醇洗涤沉淀，风干，溶于50µl DEPC-H2O中。
为使探针彻底溶解，可以在60°C 保温15分钟3、探针半定量：不同稀释倍数的探针和标准品点同样体积于尼龙膜，按照说明书进行显色。
原位杂交步骤整理
1.石蜡切片：每组一个蜡块，切片厚度5-6μm
2.脱蜡入水
3.DEPC水洗5min*2（1500ul/1500ml）
4.蛋白酶K消化，37℃，10-15min，DEPC水洗5min。
5.2×SSC平衡20min*1,DEPC 5min*2
6.42℃预杂交2h，切片上每个组织50μl，湿盒内（至少30min）(冰柜里面放的白色的液体就是预杂交液，标的H的）
7.沸水中变性探针，5min，立即冰浴（防止探针复性），放冰盒内（用预杂交液稀释）
8.稀释探针浓度为1-8ng/μl，(3ng/ul左右)切片上每个组织30μl，42℃过夜，湿盒内A:56ng/ul
9. 2×SSC洗两次，每次 5min
10.0.5×SSC洗两次，每次15min
11.马来酸洗一次，5min。
12.封闭液（由TBS溶解粉剂至1%）孵育60min，不洗。
（用马来酸稀释封闭液1:9）100/900(冰柜黄色液体)
13.用封闭液稀释生物素化抗地高辛抗体：混匀后50μL/片加至标本片上。
置样品于湿盒中，37℃反应120分钟。
0.5/500(上面稀释好的)
14.马来酸洗10分钟×3次。
15.detection buffer 5min*1
16.nbip 显色1ml加20μl（用detection buffer 稀释）时间3个小时以上。
（避光）
17.苏木素轻度复染。
蒸馏水洗。
脱水，透明，封片。
rna样品原位杂交流程
rna样品原位杂交流程RNA样品原位杂交是一种用于分析RNA分子在组织或细胞中位置和表达水平的实验技术。
该技术的应用广泛，可以帮助科学家们了解基因表达模式、发现新的基因调控机制以及研究疾病的发生机制。
本文将详细介绍RNA样品原位杂交的流程，并一步一步回答相关问题。
第一步：样品准备在进行RNA样品原位杂交实验之前，首先需要准备好所需的样品。
这通常包括组织切片或细胞培养物。
对于组织切片，可以通过组织切片仪将组织切割成适当的薄片。
对于细胞培养物，可以通过离心将细胞从培养容器中收集起来。
问题1：为什么需要准备样品？样品的准备是RNA样品原位杂交实验的基础。
只有准备好的样品才能正常进行后续的实验步骤。
第二步：固定样品在进行RNA样品原位杂交实验之前，需要使用适当的方法将样品固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、甲醛或细胞固定试剂等。
固定样品的目的是保持样品的形态结构，并防止RNA分子的降解。
问题2：为什么需要固定样品？固定样品可以使细胞或组织的结构保持完整，同时保护RNA分子不被降解。
第三步：蛋白酶消化固定的样品往往含有多种蛋白质，这些蛋白质会干扰RNA杂交的过程。
因此，在进行RNA杂交实验之前，需要使用蛋白酶消化来去除细胞或组织中的蛋白质。
常用的蛋白酶包括蛋白酶K和胰蛋白酶。
问题3：为什么需要进行蛋白酶消化？蛋白酶消化可以降低蛋白质的干扰，提高RNA杂交的灵敏度。
第四步：RNA杂交反应在固定样品的基础上，进行RNA杂交反应是RNA样品原位杂交实验的核心步骤。
在这一步骤中，首先需要制备适当的RNA探针。
RNA探针是用于杂交的RNA分子，通常使用具有标记的RNA分子，如荧光标记的RNA 或酶标记的RNA。
问题4：什么是RNA探针？有什么作用？RNA探针是用于杂交的RNA分子，可以通过与RNA样品发生互补配对来检测RNA的位置和表达水平。
制备好的RNA探针会与待测RNA样本杂交，形成稳定的双链结构。
杂交反应可以在一定的温度和时间条件下进行。
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明
荧光原位杂交实验具体步骤及详细说明用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
1. 探针变性将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
2. 标本变性（1）将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。
（经Giemsa 染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
（2）取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2x SSC的变性液中变性2～3 min。
（3）立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。
3. 杂交将已变性或预退火的DNA探针10 uL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18x18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。
由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。
4. 洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。
（1）杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
（2）将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（3）在已预热42～50℃的1xSSC中洗涤3次，每次5 min。
（4）在室温下，将玻片标本于2xSSC中轻洗一下。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200 uL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）（1）在玻片的杂交部位加150 uL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
原位杂交操作过程
（一）、仪器设备医用微波炉；水浴锅。
（二）、试剂1）95%乙醇，DEPC水配制2）70%乙醇，DEPC水配制3）0.1M甘氨酸glycine（用0.1M PBS配制）4）0.3%TritonX-100（用0.1M PBS配制）5）TE缓冲液配制：0.1M Tria-HCl，0.05M EDTA，pH8.0，DEPC水配制6）蛋白酶K (5-20 ug/ml)，（用PBS缓冲液配制）7）4% Paraformaldehyde（PFA）（用0.1M PBS配制）8）0.1mol/L Triethanolamine TEA (pH8.0): Triethanolamine 5.33ml，DEPC水定容0.4L。
9）醋酸酐溶液: 0.1mol/L Triethanolamine中醋酸酐（用前加至浓度0.25M）。
10）杂交缓冲液：50% deionized formamide, sterile 4X SSC（DEPC 水配制）11）杂交液：50% deionized formamide, 100 μg/ml heparin, 5X SSC, 0.1% Tween20, 5 mM EDTA, 1X Denhardt's, 1 mg/ml total RNA; stored frozen in 50 ml aliquots.12）20×SSC(pH7.0)：20X SSC [175 g NaCl, 88.5 g trisodium citrate, DEPC-H2O and 200 ul 10M HCl to 1L, pH 7.4 (DEPC treated and autoclaved)]. Store frozen in 40 ml aliquots. All reagents are purchased from Sigma.13）10mg/ml RNA: 让RNase溶于NTE缓冲液。
原位杂交标准操作程序
原位杂交标准操作程序原位杂交一HBV标准操作程序检测原理：原位杂交技术的原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，镜下观察结果。
此方法具有很高的灵敏性和特异性。
操作步骤：1.切片处理：将4um组织切片黏附在APES处理的载玻片上，切片于60-70o C烘烤60分钟以上。
2.脱蜡：溶液次数*时间（分）二甲苯3*10100%酒精1*395%酒精1*380%酒精1*3蒸馆水1*3（注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全）3.酶消化处理：甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量蛋白酶K工作液（约503,根据组织大小增、减量），37℃孵育30分钟。
4.封闭内源性过氧化物酶：蒸储水冲洗，小心擦干组织周围液体,滴加适量过氧化物酶阻断剂（约50ul,根据组织大小增、减量），室温水湿盒中孵育10分钟。
PBS液洗涤2*1分钟后，蒸储水洗涤1*1分钟，小心擦干组织周围液体。
5.杂交：（1）每张切片滴加适量杂交液（约25ul,根据组织大小增、减量），并加盖玻片；（2）放置于95。
C原位杂交加热器中变性5分钟；（3）放入含30%湿盒增效液的湿盒中，37。
C下孵育4-16小时。
建议过夜（＜16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果；（4）48o C（PBS预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS继续浸泡5分钟；（5）48。
CPBS 洗涤3*5分钟（轻微震荡容器）；（注意:杂交液量应与盖玻片规格匹配，切片在整个试验过程中要保持湿润状态,防止干片）6.蛋白封闭：小心擦去组织周围液体，滴加适量蛋白封闭液（约50ul,根据组织大小增、减量），室温水湿盒中孵育5分钟；PBS洗涤1*1分钟。
7.信号放大与显色：（1）小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗（约50UL根据组织大小增、减量），37℃,水湿盒中孵育30分钟；PBS 室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（2）小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育20分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（3）小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（4）小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育10分钟。
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
细胞爬片荧光原位杂交流程
细胞爬片荧光原位杂交流程
细胞爬片荧光原位杂交实验步骤
1. 准备细胞爬片：选择适当的细胞爬片，如盖玻片或载玻片，并进行适当的处理，如涂布血清或明胶。
2. 细胞培养与固定：将细胞种植在爬片上，培养一定时间后进行固定，常用的固定剂包括甲醇和冰醋酸等。
3. 脱蜡与水化：将固定好的爬片放入脱蜡缸中，按照规定程序进行脱蜡，然后进行水化。
4. 通透处理：用一定浓度的盐酸或甲酸对细胞进行通透处理，使探针能够进入细胞内。
5. 杂交：将标记有荧光染料的核酸探针与细胞中的核酸进行杂交，通常在一定温度下进行一定时间的杂交。
6. 洗涤：杂交后需要进行充分的洗涤，以去除未结合的探针和杂质。
7. 观察：在荧光显微镜下观察杂交结果，记录荧光信号的位置、强度等信息。
8. 数据分析：对观察到的荧光信号进行分析，计算荧光密度、阳性率等指标，并进行统计学处理。
需要注意的是，荧光原位杂交技术是一种相对复杂的技术，需要一定的实验技能和经验。
在进行实验前，应充分了解实验原理、操作步骤和注意事项，严格遵守实验室规章制度和操作规程。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。
2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3.轻轻摇匀，冰浴30min。
4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。
6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。
2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。
3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。
4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。
6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。
恒压50V，进行电泳。
7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
原位杂交操作过程
（一）、仪器设备医用微波炉；水浴锅。
（二）、试剂1）95%乙醇，DEPC水配制2）70%乙醇，DEPC水配制3）0.1M甘氨酸glycine（用0.1M PBS配制）4）0.3%TritonX-100（用0.1M PBS配制）5）TE缓冲液配制：0.1M Tria-HCl，0.05M EDTA，pH8.0，DEPC水配制6）蛋白酶K (5-20 ug/ml)，（用PBS缓冲液配制）7）4% Paraformaldehyde（PFA）（用0.1M PBS配制）8）0.1mol/L Triethanolamine TEA (pH8.0): Triethanolamine 5.33ml，DEPC水定容0.4L。
9）醋酸酐溶液: 0.1mol/L Triethanolamine中醋酸酐（用前加至浓度0.25M）。
10）杂交缓冲液：50% deionized formamide, sterile 4X SSC（DEPC 水配制）11）杂交液：50% deionized formamide, 100 μg/ml heparin, 5X SSC, 0.1% Tween20, 5 mM EDTA, 1X Denhardt's, 1 mg/ml total RNA; stored frozen in 50 ml aliquots.12）20×SSC(pH7.0)：20X SSC [175 g NaCl, 88.5 g trisodium citrate, DEPC-H2O and 200 ul 10M HCl to 1L, pH 7.4 (DEPC treated and autoclaved)]. Store frozen in 40 ml aliquots. All reagents are purchased from Sigma.13）10mg/ml RNA: 让RNase溶于NTE缓冲液。
原位荧光杂交操作规程(3篇)
第1篇一、目的原位荧光杂交技术是一种在细胞或组织切片上进行DNA或RNA定位的方法，通过对特定序列的DNA或RNA进行标记，从而实现对特定基因或染色体的定位和定量分析。
本规程旨在规范原位荧光杂交操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
二、适用范围本规程适用于所有原位荧光杂交实验，包括细胞原位杂交、组织切片原位杂交等。
三、材料与设备1. 材料：- 标本：细胞或组织切片- 探针：标记有荧光染料的DNA或RNA探针- 酶标抗体：针对探针标记的荧光染料- 洗涤液：如磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）- 抗荧光抗体：用于检测酶标抗体- 封片剂：如甘油封片剂2. 设备：- 荧光显微镜- 原位杂交仪- 热循环仪- 高速离心机- 显微镜载物台- 离心管- 移液器四、操作步骤1. 标本制备：- 将细胞或组织切片固定在载玻片上，进行脱水和透明处理。
- 将载玻片放入烘箱中，进行烘烤，使切片紧密贴合在载玻片上。
2. 探针制备：- 将探针进行变性，使其单链化。
- 将变性后的探针与标记有荧光染料的探针混合，进行杂交反应。
3. 杂交反应：- 将杂交混合物滴加在载玻片上的标本上，用封片剂封口。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行杂交反应。
4. 洗涤：- 将杂交后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
- 洗涤过程中，注意轻柔操作，避免破坏杂交结构。
5. 酶标抗体反应：- 将酶标抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行抗体结合反应。
6. 洗涤：- 将抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
7. 抗荧光抗体反应：- 将抗荧光抗体滴加在载玻片上的杂交结构上，进行荧光抗体结合反应。
- 将载玻片放入原位杂交仪中，进行荧光抗体结合反应。
8. 洗涤：- 将荧光抗体结合后的载玻片放入洗涤液中，进行洗涤。
9. 封片：- 将封片剂滴加在载玻片上的杂交结构上，进行封片。
10. 观察与分析：- 将载玻片放入荧光显微镜中，进行观察和分析。
原位杂交具体步骤
原位杂交流程以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针 对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。
这些实验操作方法很多参考书中均有 但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的 因此特加以综合供同行参考 在具体操作过程中很多地方可酌情变更。
在临床应用中 常常可以买到已经标记好的商品探针 那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去 从石蜡切片处理做起即可。
下面介绍的方法笔者已亲手做过数次 可获满意结果。
主要操作步骤制备感受态细菌用含目的基因的质粒转化细菌小量培养转化的细菌小量提取质粒小量酶切质粒电泳鉴定大量培养转化的细菌大量提取质粒大量酶切质粒电泳分离、回收及纯化标记探针石蜡切片的处理预杂交、杂交杂交后处理抗体连接、显色制备感受态细菌【试剂及配制】1 LB液体培养基在900ml三蒸水中加入胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g酵母提取物(bacto-extract) 5gNaCl 10g磁力搅拌使完全溶解 用5mol NaOH调节pH至7.0 如用进口试剂则不必调 。
定容为1000ml 高压灭菌20min。
2 0.1mol CaCl2溶液1.1g无水氯化钙 溶于90ml三蒸水中 定容至100ml 用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中 4℃保存。
【材料】大肠杆菌单菌落或冻存菌种 也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。
【操作方法】1 从37℃培养12 16h的平板中用无菌的接种环 用前酒精灯烧红晾凉 挑一单菌落 转入含有5ml LB培养基的无菌试管 37℃振摇 200r/min 过夜。
次日取菌液1ml 加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶 37℃振摇培养 200 300r/min 约2 3h将烧瓶取出立即置冰浴10 15min2 以下均为无菌操作。
在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中3 4℃离心 5000g ×10min 回收细菌4 弃去培养液 将管倒置于滤纸上1min 流尽培养液5 用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体 置冰浴30min6 4℃离心 5000g ×10min 弃上清 倒置于滤纸上1min7 加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 重悬菌体 动作要轻8 置4℃冰箱12 24h 即可用于转化。
原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交试剂及其配制方法（以下试剂均需用RNase-free水配制）：1×PBS：NaCl 8g∕L、KCl 0.2 g∕L、Na2HPO4 1.44 g∕L、KH2PO4 0.24 g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH 计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；PBST：PBS加0.1%吐温-20；LiCI：配4M LiCI 100ml需要LiCI．H20 25.6g，配好后加入千分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH 计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH(放置一段时间待其pH稳定后)，据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；HYB－溶液：50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2HYB＋溶液：HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）肝素，（－20℃）；pH6.250%甲酰胺／2×SSCT：50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；2×SSCT：2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；MAB马来酸缓冲液（Maleic acid buffer）：100mM maleic acid，150mM NaCl，pH 7.5(20℃)，溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH 为7.5，并过滤除菌（sterile）MABT:MAB，使用前加入0.1%吐温-20；10×Blocking reagent（阻断剂）：将阻断试剂（Blocking reagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？（is autoclaved）并分装后保存于－20℃。
原位杂交实验步骤
原位杂交实验步骤原位杂交实验步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求1.组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
2.固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
3.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
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原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
FISH步骤1、脱蜡：1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；2）100％酒精两次，每次2min；3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。
将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。
37℃孵育20min。
3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3）78℃孵育8min；4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；5）空气干燥。
4、杂交：1）准备探针；2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：5）镊子小心去除盖玻片；6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。
把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。
1×PBS室温下洗3次，每次2min；15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。
切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
地高辛标记寡核苷酸探针1．组织处理（1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。
切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。
PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min ×2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度。
PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。
在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。
在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。
孵育在2×SSc 10min。
2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo -）探针，3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。
3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。
如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。
（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。
如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。
（2）预杂交后以2×SSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。
如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。
次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温），0.5×SSc 37℃洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。
4．地高辛显示。
地高辛标记cRNA探针1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10～30μm）最佳。
切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜。
经过上述处理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。
但仍以新鲜制片为好。
如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。
一般不提倡浸入二甲苯溶液。
但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。
经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。
在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。
下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1）PBS洗2×3min。
（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。
其它切片暂放于PBs 内。
RNA酶对照片处理方法：加RNA酶（100μg/ml）在预热37℃的溶液内。
放在潮湿的盛有少许2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。
在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。
（3）蛋白酶K消化：将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。
消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。
时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。
（4）0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。
0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。
（5）在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6）以PBs 漂洗2×3min。
（7）浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min，以封闭非特异性结合部位。
（8）2×SSC漂洗15min。
2．杂交以含cRNA探针（0.5ng/ml）的杂交液，按每张切片10～2μl的量覆盖切片。
地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。
覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC 温盒内在42℃，16～18h或过夜。
3．显示（1）用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。
（2）在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。
（3）拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。
加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1：500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。
（4）缓冲液1漂洗3×3min。
（5）浸入缓冲液210min室温。
（6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT，室温。
最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。